P

R ÁC
TIC
A1

MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO Y

ESTERILIZACIÓN

I. OBJETIVOS

1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el

acondicionamiento y esterilización de materiales y equipos más
empleados en un laboratorio de microbiología industrial.

2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de

materiales para el análisis microbiológico.

3) Justificar la importancia de los métodos de esterilización para el

control microbiológico de los alimentos.

II. MARCO TEÓRICO

El acondicionamiento de los materiales así como la esterilización de

los mismos es el primer paso en el control microbiológico de los
alimentos, pues de él dependerá el éxito del análisis.

2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR

El calor actúa desnaturalizando y coagulando las proteínas.

2.1.1.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

Se requiere temperaturas elevadas y un periodo más prolongado de

calentamiento que la esterilización con vapor. Su uso está limitado
primariamente a la esterilización de material de vidrio y aquellas
sustancias que sean impermeables al vapor.

El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en

los efectos letales del calor seco debido a la desecación en general,
lesión por oxidación y efectos tóxicos de los niveles de electrólitos.

En ausencia de agua, disminuye el número de grupos polares de la

cadena peptídica y se requiere más energía para abrir las moléculas,
de allí la aparente mayor estabilidad del organismo.

Se emplea el horno o estufa de esterilización, en la que se aplica una

temperatura de 160-170ºC durante 1 hora.
 a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los
materiales a esterilizar (asas y agujas de kolle, espátulas, pinzas,
tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar
rápidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de
Bunsen.

b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriológico u

horno Pasteur, donde se esteriliza el material a temperaturas de
170º-180ºC por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar
material de vidrio.

2.1.2 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren más

rápidamente cuando se encuentran húmedas como porque el vapor
proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas
partes del recipiente de esterilización, el vapor debe conservarse a
una presión de 1000g/cm3 sobre la presión atmosférica para obtener
una temperatura de 121ºC. Se produce también rupturas de cadena
única en el ADN , y la pérdida de la viabilidad de las células
expuestas a calor leve puede correlacionarse con la introducción de
estas rupturas. La lesión de ADN parece ser enzimática, como
resultado de activación o liberación de una nucleasa.

El calor produce también una pérdida de la integridad funcional de la

membrana y filtración de pequeñas moléculas y material absorbente
de 260 nm. Este material es de origen ribosómico y aparentemente
es resultado de la degradación de los ribosomas por ribonucleasas
activadas por el tratamiento con calor. Existe también degradación
del ARN ribosómico y la pérdida de viabilidad de las células
expuestas a temperaturas elevadas.

a) Por Ebullición. Se coloca el material a esterilizar en agua

hirviendo (100ºC) por 15-35 minutos.

b) Vapor de agua sin Presión. Se coloca el material a

esterilizar a la acción del vapor de agua y a temperatura no mayor
de 100ºC; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita
abierta. Se utiliza para materiales termolábiles como es el caso de
algunos medios de cultivo.

c) Vapor de agua con Presión. Se realiza en un autoclave a

15 libras de presión y 121ºC por 15-20 minutos. Se emplea para
esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no
pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave,
pasteurización o tindalización.
 c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de
forma cilíndrica, paredes resistentes, puede ser horizontal o vertical;
consta de:

♠ Caldera de material resistente, fondo cóncavo

cubierta de una camisa metálica cilíndrica.
♠ Dispositivos para la instalación de la fuente
calorífica (gas, electricidad o vapor de agua).
♠ Orificios superiores para purga de gases de
combustión.
♠ Tapa con válvula de seguridad, espita, manómetro.
♠ Canastilla para colocar el material a esterilizar.

2.3 ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN

Consiste en hacer pasar las sustancias líquidas o gaseosas a

esterilizar a través de membranas porosas que retienen a los
microorganismos; sirve para la esterilización de sustancias
termolábiles. El material filtrante puede ser de porcelana, tierras de
infusorios, acetato de celulosa, etc.

2.4 ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN ULTRAVIOLETA

Poseen efectos letales y mutagénicos en las bacterias presentando

su mayor efectividad como agente bactericida en la región espectral
de alrededor de los 260 nm de longitud de onda, éste método
presenta muchas dificultades técnicas.

III. MATERIALES Y EQUIPO

♠ Material de vidrio: pipetas, palcas petri

♠ Erlenmeyer, tubos de ensayo
♠ Papel craff, algodón, gasa, tijeras
♠ Mechero de Bunsen
♠ Horno Pasteur de aire caliente
♠ Autoclave

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 PREPARACIÓN DE MATERIAL A ESTERILIZAR

a)Preparación de tubos matraces

♠ Los tubos, matraces y frascos antes de su

esterilización deben llevar sus tapones de algodón
respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy
 flojos ni apretados, ni largos ni cortos, preparados según el
método siguiente:
♠ De acuerdo al tapón a confeccionar se toma el
pedazo convenientemente de algodón de fibra, extendida,
rectangular
♠ Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
♠ Enrollar de un extremo, presionando sobre sí
mismo hasta completar toda la longitud.
♠ Rotar con los dedos el trozo confeccionado
aplastando para dársele la forma de cono truncado, con el
diámetro a la medida del recipiente a taponar, el tapón debe
entrar en el recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar
fuera. Se pueden preparar los tapones envueltos en gasa para
evitar el hilachamiento.

Tubos de Ensayo
♠ Formar un paquete de tubos de ensayo
taponados, empaquetarlos con papel kraft y amarrarlos, en su
defecto se le envuelve con papel sólo la zona de las bocas.

Frascos y Matraces
♠ Los frascos y matraces se taponan con algodón,
se cubre con papel kraft y se amarra con hilo pabilo.
♠ Colocar el nombre del medio de cultivo
♠ Rotular la fecha de preparación.

b)Preparación para proteger las pipetas

♠ En el extremo de succión de cada pipeta
introducir una porción de algodón con auxilio de una aguja o
puntero delgado, evitando que quede muy ajustado.
♠ Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm.
de ancho, y colocar uno de sus extremos, en una de las puntas
del papel envolver la punta de la pipeta en forma oblicua y
envolver toda la longitud de la pipeta girándose en espiral en
forma ajustada y en la parte terminal de la boquilla se remata
con una torsión para protegerla y se rompe el resto de papel
sobrante.
♠ Anotar con un lápiz la medida de la pipeta y la
fecha de su esterilización.

c) Preparación de las placas petri

♠ Cortar papel kraft tamaño adecuado para cubrir
íntegramente las placas petri completas.
♠ Con la parte brillante del papel hacia fuera se
envuelve la placa poniéndose esta en el centro, se envuelve la
placa tomándose dos extremos opuestos del papel, dándose
 una vuelta alrededor de ella, los otros dos extremos del papel
se doblan en triángulos, rematándose con un fuerte dobles
hacia el dorso de la placa, dándosele una apariencia de
paquete de regalo.

4.2 ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO

El procedimiento de esterilización por aire caliente sólo se puede

emplear con utensilios de vidrio o metal.

a)Procedimiento para la esterilización en horno

♠ Ponga el termostato a l75ºC y encienda el horno.
♠ Si hay un ventilador verifique que esté
funcionando.
♠ Vigile el termómetro. Cuando la temperatura
llegue a l75ºC. sígase calentando durante 60 minutos más.
♠ Apague el horno. Espere a que la temperatura
descienda hasta 60ºC. Abra la puerta del horno.
♠ El papel empleado para envolver deberá de
haber tomado un color marrón oscuro, si el color del papel es
amarillo pálido indicará que el horno no se ha calentado
bastante. Si el papel se ha ennegrecido indicará que el horno se
ha calentado demasiado.

4.3 ESTERILIZACIÓN CON CALOR HÚMEDO

a)Procedimiento para la esterilización con autoclave

♠ Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el
soporte de la canasta). Cerciórese que el agua no toque la
canasta. Elimine el exceso de agua abriendo la espita del
drenaje.
♠ Introduzca en el autoclave la canasta con los
materiales que se van a esterilizar, se pueden añadir
indicadores de la esterilización, como ciertas piezas de papel
especial que ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada.
♠ Cierre la tapa de la autoclave, cerciorándose de
que la arandela de goma se encuentra en su surco. Atornille a
niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin
apretarlo demasiado.
♠ Abrir la válvula de salida del aire.
♠ Inicie el calentamiento de la autoclave.
♠ Vigile la salida de aire hasta que aparezca un
chorro de vapor. Aguarde 3- 4 minutos hasta que el chorro de
vapor sea uniforme y continuo, esto indicará que todo el aire ha
sido expulsado de la autoclave.
 ♠ Cierre a continuación la válvula de salida del
aire. Apriétense los sujetadores de la tapa de la autoclave y
reduzca la temperatura ligeramente.
♠ Cuando se obtenga la temperatura adecuada
120ºC se deberá regular el calor para conservarla. Y esperar
por 15 minutos.
♠ Reduzca completamente el calor tan pronto
como se cumpla el tiempo requerido.
♠ Cuando la temperatura descienda a menos de
80ºC abra la válvula de salida de aire para igualar las presione
dentro y fuera del autoclave.
♠ Deje enfriar el autoclave y a continuación retire
cuidadosamente la canasta con los utensilios estériles.

V. CUESTIONARIO

5.1. ¿Qué método de esterilización utilizó en la práctica, cite

algunos ejemplos?.
5.2. ¿Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los
materiales antes del control microbiológico, por qué?
5.3 Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para
poner en funcionamiento el autoclave.
5.4.Compare la resistencia al calor de las células vegetativas con
esporas bacterianas y explique a que se debe tal diferencia.
5.5.Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de
esterilización.
 PRÁCTICA2

MICROSCOPIA

I.- OBJETIVOS

1) Identificar cada una de las partes del microscopio óptico,

conocer su función y el cuidado de cada uno de ellas.
2) Conocer la morfología de organismos unicelulares.
3) Conocer los distintos métodos de observación de
microorganismos “in vivo”.

II.- MARCO TEORICO

El microscopio permite la observación de estructuras muy pequeñas
que no pueden ser vistas a simple vista. El poder de resolución de un
microscopio esta en relación inversa a la longitud de onda de la luz
usada.

2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. Parte mecánica:
- Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo)
- Tubo: Revólver
- Tornillo macrométrico o sistema de movimiento rápido
- Tornillo micrométrico o sistema de movimiento lento
- Platina: Pinzas sujetadoras de láminas y mandos coaxiales
- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador,
anillo porta filtros, diafragma iris y soporte para el espejo

2. Parte óptica del Microscopio:

- Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador
- Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra
Los objetivos traen impresas las siguientes características:
o Magnificación: Ej. x 25
o Apertura numérica (A.N.): Ej. 0,45
 o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un
objetivo Planacromático
o Longitud del tubo: Ej. 160 mm
o Corrección de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm
o Aparato de iluminación. comprende: Espejo,
Condensador, Diafragma

2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o
platina porque deteriora el tornillo micrométrico.
2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura
conveniente para observar sin fatiga Verificar que los oculares
estén limpios y en posición correcta.
3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo
del M.O. para una mejor comodidad si se trata de Microscopios
que no posean el sistema inclinado. Si se observan
preparaciones frescas o”in vivo” debe mantenerse la platina
horizontal.
4. Verificar que los objetivos en el revólver estén en orden
progresivo de aumento.
5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico girando
el revólver hasta que haga “clik”.
6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy
cerca de la platina y abra el diafragma totalmente.
7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor
y si tiene espejo orientarlo hacia la ventana mejor iluminada o
al fluorescente más cercano.
8. Observe por el ocular la iluminación del campo y trate de
lograr la máxima luminosidad moviendo el espejo; luego, si es
necesario baje ligeramente el condensador.
9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la
laminilla cubreobjetos quede hacia arriba, la etiqueta hacia la
derecha del observador y que el preparado se encuentre entre
el condensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos
de luz. Este desplazamiento se logra utilizando los mandos
coaxiales.
10. Para iniciar la observación, emplee siempre el objetivo de
menor aumento (panorámico ó 10X) y procure que la distancia
objeto-objetivo sea la mínima (5 mm.), esto se logra bajando
el tubo con el tomillo macrométrico y observando por un lado
del Microscopio el descenso del mismo. Luego, observe por el
ocular y simultáneamente suba al tubo con el tomillo
macrométrico hasta enfocar el elemento en estudio, de
inmediato utilice el tomillo micrométrico para dar nitidez a la
imagen. Finalmente recorra la lámina con la ayuda de los
 mandos coaxiales para su observación integral, siempre
utilizando el tomillo micrométrico para no perder la nitidez.
Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende
al utilizar el tomillo macrométrico, la distancia objeto-objetivo
debe ser de 1 a 1,5 cm.
11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores
condiciones de contraste.
12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en
el centro del campo y cambie de objetivo girando el sistema
de revólver, teniendo cuidado de girar el objetivo del siguiente
aumento (45X) y NO el de inmersión. Ponga nítida la imagen
únicamente con el tomillo micrométrico.
Es importante tener en cuenta que para cambiar de un
aumento a otro no debe manipularse con el tomillo
macrométrico porque corre el riesgo de romper la lámina o la
lente frontal del objetivo.
13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersión,
coloque el elemento seleccionado en el centro del campo y
gire un poco el objetivo, de manera tal, que quede libre éste
sector de lámina para que pueda colocarse una gota de aceite
de inmersión. Luego, continúe girando el revólver hasta que el
objetivo de inmersión (100X) contacte con la gota y encaje en
el eje óptico; finalmente, observe por el ocular y aclare la
imagen solamente con el tomillo micrométrico.
Una vez terminada la observación limpie el objetivo de
inmersión y la lámina con el campo ligeramente humedecido
con alcohol isopropílico o metanol.

2.3.- AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CÁLCULO APROXIMADO DE

DIMENSIONES CELULARES
1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el
aumento del objetivo por el del ocular.
Ej.: Objetivo 40X y Ocular 10X
40 x 10 = 400 aumentos
2. Para el cálculo aproximado de dimensiones celulares, se debe
conocer el diámetro del campo microscópico que varía de
acuerdo al objetivo que se usa.

Diámetro del campo microscópico

Diámetro del
Ocular Objetivo
campo en micras
10X 10X 1500
10X 45X 400
10X 100X 150
 Ejemplo: Si observamos una célula epitelial al Microscopio
con objetivo 10X y ocular 10X, y si ésta ocupa la
tercera parte del campo microscópico,
concluiremos que la célula mide
aproximadamente 500 micras; es decir, la
tercera parte de 1500.

2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo ó
la platina, porque a la larga deteriora el tomillo micrométrico.
2. Los objetivos y oculares constituyen la parte mas delicada del
Microscopio, por lo que debe tenerse sumo cuidado en su uso.
Así, el enfoque debe hacerse suavemente, evitando que la
lente frontal del objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna
razón debe desmontarse los objetivos.
El objetivo de inmersión no debe usarse en seco y debe
quedar escrupulosamente limpio después de su uso, para lo
cual use el “campo” ligeramente humedecido con alcohol
isopropílico o metanol.
3. Al finalizar la observación microscópica, coloque el objetivo de
menor aumento en el eje óptico dejando un espacio de 2 cm.
entre éste y la lentilla del condensador, luego apague la luz.

2.5.- OBSERVACIÓN “IN VIVO” DE ORGANISMOS UNICELULARES

Indicaciones:
1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina
esté en posición horizontal.
2. Coloque la lámina porta objetos en su Microscopio.
3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lámina
de manera que la luz del Microscopio la atraviese.
4. Proceda a enfocar con menor aumento y observará que tiene
exceso de iluminación y poca visión de la muestra corrija éste
defecto bajando el condensador y cerrando un poco el
diafragma iris.
5. Observará elementos fijos, con pocos movimientos y veloces
que tienen características especiales y un fondo de partículas
de tierra y cristales grises y oscuros. Pueden distinguirse:
- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a
manera de pequeñas escaleras en cuyo interior se
observan los cloroplastos.
- Diatomeas, de diferentes formas y tamaños, se las
distingue porque son brillantes, amarillentas, poco móviles;
van desde la forma de un barril pequeño hasta cigarros o
prismas.
 - Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente
el campo de observación. Son protozoarios que tienen
forma ovoide, de zapatilla y se caracterizan por presentar
su cuerpo rodeado de cilios. En su interior observar el
núcleo y vacuolas.
- También puede observarse a la stilonichia, más pequeña
que el Parameccium y con un pelo o cerda en un extremo.
- Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis,
caracterizada por presentar un flagelo largo (Protozoario
flagelado).
- La ameba, difícil de visualizar por su transparencia,
presenta pocos movimientos y se desplaza lentamente
emitiendo pseudópodos en la superficie de su cuerpo.
- También puede encontrar Vorticelas, tienen forma de
cáliz, con un pedicelo largo y delgado, generalmente viven
en colonias. La superficie del “cáliz” está rodeada de cilios.
6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul
de metileno) en su preparado y observe nuevamente los
organismos unicelulares.
7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres
correspondientes.

_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________

2.6.- EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS

1. Examen en Fresco
Es la forma más simple de realizar la preparación de un
espécimen para su examen microscópico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar
microorganismos vivos.

Hay 2 tipos de técnicas:

a. Preparación en fresco simple “entre porta y cubre”.
Consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos
sobre un porta objetos y luego cubrirla con un cubreobjetos.
 b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de líquido con microorganismos en
un cubreobjetos y cubrirlo con un portaobjetos (de forma
invertida) con una excavación central (portaobjetos excavados).
Se debe sellar la preparación con vaselina alrededor de la
excavación.
La ventaja de esta preparación es que no se seca y puede ser
observada durante un tiempo más largo.

II. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS

Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza
con la finalidad de observar caracteres de movilidad, morfología,
agrupación, observación de huevos y quistes de parásitos.

EXAMEN EN FRESCO

Material
-Microscopio
-Láminas cubreobjetos
-Láminas portaobjetos
-Agua destilada
-Asas de Kolle
-Gérmenes varios
-Muestras fermentadas
-Cultivo de microorganismos

Metodología
-Si la muestra proviene de un líquido, con un asa de kolle se
coloca una gota de líquido sobre un portaobjeto, sobre el que
se coloca un cubreobjeto.
-Si la muestra proviene de un cultivo sólido, se deposita
primero una gota de suero fisiológico sobre el portaobjetos,
para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una
suspensión y colocar un cubreobjetos.
-Observar al microscopio con objetivo 40X.
Observación y Resultados

_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
 _______________________________________

III. CUESTIONARIO
i. ¿Qué ventajas y desventajas ofrece una preparación en fresco?
ii. ¿Qué ventaja presenta una preparación gota pendiente?
iii. ¿Realice un dibujo del microscopio y señale sus partes?
iv. ¿A qué se denomina campo óptico?
v. ¿Qué es el sistema parafocal?
 PRÁCTICA3

PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO: TINCIÓN GRAM

I.- OBJETIVOS
2) Observar los microorganismos vivos en suspensión:
preparaciones húmedas y coloraciones supravitables.
3) Observar células muertas en frotis seco y teñidas con
diferentes procedimientos de coloración.

II.- MARCO TEORICO

Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y
su protoplasto posee un índice de refracción cercano al agua, se
requiere generalmente tinciones biológicas para visualizarlos
adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas.
Los colorantes están constituidos en su mayoría por el anillo
bencénico, y difieren uno de otro en cuanto al número y disposición
de estos anillos y a la sustitución de los átomos de hidrógeno por
otras moléculas. Algunos de los grupos cromóforos más comunes
hallados en los colorantes son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O,
NO2.
La intensidad de coloración de colorante es proporcional al número
de radicales cromóforos del compuesto.

2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES

PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150 µ m y 0.500 µ m de
espesor, pudiendo incluso alcanzar 0.8 µ m (Lactobacillus). Las
paredes de las células jóvenes son más delgadas que las células
de cultivo antiguo.

GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas está

constituida principalmente por cadenas de peptidoglucano, a
menudo unidas por puentes peptídicos.
Sin embargo estas células contienen también una gran cantidad
de ácidos teicocos, polímeros de glicerol y ribitol unidos por
grupos fosfato y aminoácidos como D-alanina o azúcares como
la glucosa están unidos a los grupos glicerol y ribitol.

GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas,

dispuestas de manera laxa, estas incluyen la membrana externa
(ME), con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que contiene
el antígeno O somático conocido como lipopolisacárido LPS, una
capa densa intermedia, y la membrana plasmática interna. Un
espesor de 0.0075 µ m.

2.2.- COLORACIONES VITALES

Son los montajes de materia viva teñidos. Suelen utilizarse para
ello, determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro) a
muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es
facilitar la observación, mediante el colorante de la morfología y
la estructura bacteriana, pero sin provocar alteraciones celulares
ni destruir la bacteria.

2.3.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Este tipo de preparaciones son las más frecuentes, tanto las
obtenidas directamente a partir de muestras clínicas como las
obtenidas a partir de desarrollo de cultivos.

Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada

y coloreada son:

a. Confección del Frotis. Puede prepararse a partir de

productos líquidos o sólidos.
Producto liquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un
portaobjetos de vidrio limpio y seco, una gota del material a
estudiar y se extiende con ayuda del asa de platino.
Cultivo en medio sólido. puede prepararse una suspensión
del material en una gota de solución salina colocada
previamente en el portaobjetos, extendiéndola con ayuda del
asa de platino.

b. Secado. Se dejará secar el frotis a temperatura ambiente.

c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de

las estructuras del material a estudiar en un estado lo mas
próximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rápida
de los microorganismos, debida a la coagulación de las
albúminas protoplásmicas. Existe un gran número de fijadores,
tanto en forma simple (etanol, ácido pícrico). Las formas más
habituales de fijación son: por el calor y alcohol en frío.

d. Coloración. Es el proceso de coloración de los

microorganismos.

e. Lavado. Eliminación del exceso de colorante.

f. Secado. Se secará la preparación al aire.

 CLASIFICACIÓN DE LAS COLORACIONES
La clasificación de los colorantes es algo confusa, pero está
basada en los cromóforos presentes.

a. Según su estructura química. Pueden clasificarse como

Ácido o Básico, término que no índica sus reacciones de pH en
solución, sino, si una parte de la molécula es aniónica o
catiónica.
• Los colorantes básicos, tiñen estructuras de naturaleza
ácida, como la cromatina nuclear de las células. Ej: Cristal
violeta, Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.
• Los colorantes ácidos, reaccionan con sustancias básicas,
tales como estructuras citoplásmaticas, y como colorante de
contraste. Ej: ácido pícrico.
• Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante
ácido con uno básico. Ej: Wright, Giemsa, Hematoxilina -
Eosina.
• Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua
y solubles en alcohol. Ej: Sudán III.

CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES

a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y

permiten conocer la morfología y tipo de agrupación bacteriana.
ejemplo. Tinción azul de metileno, Tinción fucsina.

b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y

sirven para poner de manifiesto las características de afinidad
de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tinción
Gram, Tinción ácido-alcohol resistente.

c. Tinciones Estructurales. Utilizan más de un colorante y

sirven para poner de manifiesto estructuras bacterianas. como;
Tinción de flagelos, Tinción de esporas, Tinción de cápsulas,
Tinción de corpúsculos metacromáticos

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

3.1. COLORACIONES VITALES

Estos tipos de exámenes pueden considerarse como
preparaciones en fresco o como técnicas intermedias entre éstas
y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de
materia viva teñidas.
 Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, a examinar,
Cubreobjetos, Solución de azul de metileno (1/1000), Asas de
platino, Gérmenes diferentes

Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de
metileno (l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de
una asa de kolle mezclar. Seguir el procedimiento (muestra
liquida o sólida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.

Observación y Resultados

_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________

3.2. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Preparación del Frotis

- Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo.
Sostenga el asa inmediatamente arriba de la porción azul de la
flama. Ponga el asa tan cerca de la posición vertical como sea
posible. Déjela enfriar (cuente hasta 20).
- Tome una porción de la muestra que se va examinar,
colocando el asa en posición plana en la superficie del líquido.
- Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplánese ligeramente
en el centro de éste (el portaobjeto deberá estar numerado).
- Sosteniendo todavía el asa aplanada sobre el portaobjeto
muévala trazando una espiral del centro a la periferia. Debe
dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados
del portaobjetos.
 - Flamee de nuevo el asa hasta que esté al rojo vivo para
destruir cualesquiera bacterias que se encuentren en ella.

Fijación
- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire
libre.
- Pase el portaobjeto tres veces a través de la llama del
mechero de Bunsen, con la muestra hacia arriba.
- Déjelo enfriar antes de aplicar la tinción.

3.3. TINCIONES SIMPLES

Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Azul de metileno

(solución acuosa al 1%), Safranina (solución acuosa 1%), Asas de
platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión, Xilol

TINCIÓN DE AZUL DE METILENO

Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de
absorción del colorante por los diferentes microorganismos es
variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.

Procedimiento

- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de

agua destilada para hacer un frotis.
- Con él esa tome una pequeña porción del cultivo en medio
sólido y disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio
liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan no
deben ser ni muy gruesos m muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama
suavemente para obtener la fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja
actuar de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de
agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso
de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y
con aceite de inmersión.

Observación y Resultados

_______________________________________
_______________________________________
 _______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________

TINCIÓN DE SAFRANINA

Las bacterias aparecen de color rojo.

Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota
de agua destilada para hacer un frotis.
- Con el asa tome una pequeña porción del cultivo en
medio sólido y disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo
es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se
obtengan no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la
llama suavemente para obtener la fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante de safranina (2 ó
3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro
de agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el
exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X)
y con aceite de inmersión.

Observación y Resultados

_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________

3.4. COLORACIONES DIFERENCIALES

 Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Set para la
coloración de Gram, Asas de platino, Gérmenes diferentes,
Aceite de inmersión.

TINCIÓN GRAM
El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a
la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una
solución débil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido a su
naturaleza química de sus paredes celulares, poseen la
capacidad de retener el cristal violeta, aún luego del tratamiento
con un decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol y
acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido
lipídico en su pared celular, pierden la coloración primaria del
cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El
colorante secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las
bacterias Gramnegativas que han perdido el cristal violeta,
aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado
la safranina como contracolor a sus paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de
absorción del colorante por los diferentes microorganismos es
variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.

Reactivos
- Solución de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95º
= 20 ml, Agua destilada csp=100 ml)
- Solución de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de
potasio= 2.0 g, Agua destilada= 100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml)
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95º= 10 ml, Agua
destilada csp=100 ml)

Procedimiento
- Coloque una azada de caldo nutritivo que contiene una
mezcla de bacterias Grampositivas y Gramnegativas sobre una
lámina portaobjeto limpia.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama
suavemente para obtener la fijación del frotis, con la finalidad de
que el material no sea arrastrado durante el proceso de tinción.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la
superficie con solución de cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien
con agua de caño.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto.
Lavar con agua.
 - Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la
superficie con unas gotas del decolorante acetona-alcohol hasta no
arrastrar más colorante violeta. Se requiere unos 10 segundos más
o menos.
- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar
con agua de caño.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y
con aceite de inmersión.

Observación y Resultados

_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________

_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________

_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________

V. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es un colorante y cuáles son sus propiedades?
2. ¿Por qué se le llama a un colorante ácido o básico?
3. ¿A qué se debe la afinidad que tiene un colorante
por la bacteria?
4. ¿De qué manera influye el pH en la coloración?
5. ¿Por qué es necesario utilizar métodos de tinción
para visualizar a las bacterias?
6. Escriba la estructura del azul de metileno y
safranina
7. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma
de bacilos
8. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma
de espirales
9. Dibuje los componentes de la pared celular de los
microorganismos grampositivos y explique la función que cumple
cada uno de ellos.
10. Dibuje los componentes de la pared celular de los
microorganismos gramnegativos y explique la función que
cumple cada uno de ellos.
11. Explique el fundamento de la coloración de Gram y
esquematice.
12. ¿A qué se denomina mordiente y mencione tres
ejemplos?
13. Mencione tres razones por las que un
microorganismo grampositivo se observa gramnegativo.
14. Dibuje la estructura del colorante cristal violeta
15. Mencione tres microorganismos (género) que sean
cocos grampositivos, bacilos, grampositivos, cocos gramnegativo
y bacilos gramnegativos.