TEMA5.

DIAGNOSTICO DE VESTIGIOS DE SANGRE EN EL LABORATORIO

DE BIOLOGÍA FORENSE. PRUEBAS DE ORIENTACIÓN Y
CERTEZA, TÉCNICAS ANALÍTICAS DE ELECCIÓN.
INTERPRETACIÓN Y SU VALORACIÓN BIOLÓGICA FORENSE.

Actualmente se estudia un número suficiente de marcadores para distinguir

unas muestras de otras. La mayoría de laboratorios forenses utilizan los
mismos marcadores con el fin de intercambiar datos sin tener que
reanalizar las muestras.

CONCEPTO DE MUESTRAS DUBITADAS E INDUBITADAS

Para que una pericia genético biológica sea concluyente es imprescindible

desarrollar el análisis en dos tipos de muestras:

a) Muestras dubitadas o evidencias: son restos biológicos de

procedencia desconocida, es decir, no sabemos a quién pertenecen (por
ejemplo las muestras recogidas en la escena del delito o de un cadáver sin
identificar).

b) Muestras indubitadas o de referencia: son restos biológicos de

procedencia conocida, es decir, sabemos a quién pertenecen (por ejemplo la
sangre tomada de un cadáver identificado, o las muestras tomadas a
familiares de un desaparecido).

La analítica de ADN se ha denominado en múltiples ocasiones «huella

genética»; este término no debe llevarnos a confusión pues, si bien es
verdad que cada individuo presenta un ADN diferente (como en el caso de
las huellas dactilares), no existe una base de datos formada por las
características genéticas de cada individuo que vive en España (a diferencia
de la huella dactilar, de la cual existe un registro del índice derecho de
todas las persona con DNI). Por este motivo, sólo podremos identificar las
evidencias biológicas si disponemos de muestras de referencia para su
comparación.

Los tipos de muestras dubitadas más frecuentemente analizadas por

técnicas genético moleculares son: sangre (habitualmente en forma de
mancha), semen (lavados vaginales o manchas sobre prendas de la
víctima), saliva (colillas de cigarrillo, chicles, sobres y sellos), pelos, uñas,
tejidos blandos, restos óseos y dentarios (estos últimos relacionados
fundamentalmente con la identificación de cadáveres).

El tipo de muestras indubitadas más habituales son sangre y saliva (frotis

bucal). No es necesario que las muestras de referencia sean del mismo tipo
que las evidencias, es decir, podremos comparar distintos tipos de restos
biológicos entre sí ya que el ADN es igual (salvo excepciones) en todos
tejidos de un mismo individuo.

Podemos diferenciar tres etapas principales en el análisis de una muestra

forense: (i) pruebas preliminares para determinar la naturaleza y el
organismo de procedencia de la muestra; (ii) análisis del ADN presente en la
muestra con fines identificadores y (iii) análisis e interpretación de los
resultados obtenidos.

Existen fundamentalmente tres tipos de pruebas

preliminares:

a) Orientativas: se trata de técnicas que nos revelan la posible naturaleza

de la mancha pero no nos la aseguran, es decir, sirven sólo para descartar,
pero no para concluir. Por ejemplo, la llamada reacción de Adler es una
sencilla prueba colorimétrica que si resulta positiva nos orienta a pensar
que estamos ante una mancha de sangre, pero sin poder asegurarlo pues
existen otras sustancias (jugos vegetales, óxido, lejía) que también dan
positiva esta reacción. Si la prueba resulta negativa podremos asegurar que
el resto que estamos analizando no es sangre. Estas pruebas son sencillas
de realizar, son de bajo coste, muy rápidas, y nos ayudan a seleccionar las
manchas a analizar.

b) De certeza: nos permiten determinar el tipo de resto biológico analizado

con seguridad. La detección de hemoglobina en la muestra para
determinación de sangre o la visualización al microscopio de
espermatozoides para la determinación de semen son algunos ejemplos.

c) Específicas: nos permiten determinar el tipo de organismo al que

pertenece el resto biológico. Una vez que hemos determinado el tipo de
muestra que hemos de analizar, interesa saber si se trata de una muestra
humana o no. Existen principalmente dos tipos de pruebas específicas: unas
basadas reacciones antígeno-anticuerpo y otras basadas en el estudio de
ciertas regiones del ADN, si bien, en cierto tipo de muestras (pelos, restos
óseos) puede realizarse un estudio de las características morfológicas para
determinar el tipo de organismo. En el caso de que nos encontremos ante
una muestra de origen animal, normalmente los análisis terminarán en este
punto a no ser que el objetivo sea precisamente determinar la especie (por
ejemplo, en caso de delitos ecológicos y de caza furtiva). En el caso de
muestras de origen humano se procederá a realizar la segunda etapa del
estudio destinada a individualizar la muestra mediante técnicas de ADN.

Conviene señalar que en determinadas ocasiones no es posible determinar

el tipo de resto biológico hallado por la escasa cantidad de muestra
disponible. En estos casos se suele proceder directamente a realizar los
estudios de ADN para intentar individualizar la muestra.

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Una vez que se ha finalizado el estudio molecular propiamente dicho se

procede al análisis de los resultados obtenidos. Podemos encontrarnos con
dos situaciones:

1. Que dispongamos de muestras indubitadas de referencia para cotejar con

las evidencias.

2. Que no tengamos acceso a muestras de referencia para comparar.

En el caso de que nos encontremos ante la primera situación, el resultado

de la comparación entre muestras dubitadas e indubitadas puede ser de dos
tipos:

1.1 Coincidencia o compatibilidad: el perfil genético evidenciado en ambos

tipos de muestras es coincidente (criminalística) o compatible
(paternidades) . En este caso se ha de valorar estadísticamente si la
coincidencia es debida al azar o a que realmente la evidencia biológica
pertenece al individuo de referencia. Es evidente que este análisis depende
«a priori» del número de marcadores analizados en las muestras y una vez
realizado el análisis, de lo frecuente o no que sean los alelos de cada
marcador (por ejemplo, en el hipotético caso de que estudiáramos el grupo
sanguíneo, el grupo 0 es muy frecuente en nuestra población por lo que
este resultado se ha de valorar con menor «fuerza» que si obtenemos un
grupo AB, mucho menos frecuente). Por esta razón, los laboratorios analizan
de rutina en cada muestra una batería de marcadores con elevado poder de
discriminación.

1.2 No coincidencia o incompatibilidad: el perfil genético evidenciado en las

muestras dubitadas no coincide con el de la muestra indubitada; o bien, en
casos de paternidad, el supuesto padre no comparte alelos con el hijo
(incompatibilidad). En estos casos no es necesario realizar una valoración
estadística pues la exclusión se informa con seguridad.

En los casos donde no disponemos de muestras de referencia para

comparar con las evidencias podemos introducir los perfiles genéticos
obtenidos en una base de datos de perfiles anónimos. Esto nos permitirá
relacionar distintos delitos entre sí, facilitando así la investigación policial y
judicial en hechos reincidentes como violaciones y robos. Actualmente
algunos laboratorios poseen sus propias bases de datos de evidencias, pero
sería deseable que se unificaran criterios así como la información contenida
en cada una de ellas con el fin de intercambiar datos de forma rutinaria. Por
otro lado, en otros países ya existe una legislación sobre la introducción de
perfiles genéticos de carácter indubitado relacionados con prácticamente
todos o cierto tipo de delitos (según el país); en España sería necesario que
existiera un marco legal con el fin de evitar la pérdida de información que
proporcionarían dichos perfiles.

Además de las bases de datos de perfiles genéticos anónimos obtenidos a

partir de las evidencias, existen bases de datos de perfiles procedentes de
cadáveres sin identificar y de familiares de desaparecidos que dieron su
consentimiento para el análisis de su ADN. Con estas bases de datos los
laboratorios pretenden facilitar la difícil tarea de identificar cuando no
existen otros medios que el análisis genético

PROBLEMÁTICA DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS

Ya hemos visto que, actualmente, para determinar a qué individuo

pertenece una muestra biológica, se recurre al estudio de sus polimorfismos
de ADN y ya hemos descrito todas las fases analíticas que se han de realizar
(extracción, cuantificación, amplificación y tipaje), pero creemos
conveniente apuntar la problemática del día a día del laboratorio en las
diferentes etapas del análisis de estos polimorfismos.
Las muestras indubitadas que pertenecen a individuos vivos no suelen dar
problemas en el análisis genético si fueron recogidas y enviadas al
laboratorio en condiciones óptimas. Sin embargo, las evidencias con
carácter dubitado pueden sufrir una serie de modificaciones que
dependerán no sólo del tiempo transcurrido hasta el momento de su
estudio, sino de las condiciones ambientales a las cuales se vieron
sometidas, de la cantidad de muestra, del soporte en el cual se encuentran,
del lugar de procedencia y del tipo de muestra biológica.

De todos los tipos de muestras biológicas que se analizan diariamente en el

laboratorio forense, quizá sean las de sangre las más agradecidas.

Sin embargo algunas veces también dan problemas.

La sangre podemos hallarla bien en estado líquido o en forma de

mancha. La sangre líquida bien conservada no ofrece ningún tipo de
problema, pero no es raro que al laboratorio llegue sangre putrefacta bien
porque se ha estropeado durante el transporte o bien porque pertenece a
un cadáver en el cual se ha iniciado la descomposición. Para evitar el primer
problema es conveniente realizar una mancha sobre una gasa antes de
proceder al transporte de la muestra y para el segundo no queda más
remedio que tratar de buscar otra muestra para el análisis, bien sea un
tejido blando, uñas, o un resto óseo, dependiendo del estado de
conservación del cuerpo. Por el contrario, la sangre en forma de mancha se
conserva más fácilmente y puede analizarse tras varios años si las
condiciones de secado fueron adecuadas. Quizá las manchas sobre cueros,
maderas tratadas, restos vegetales y tierras sean de las más críticas pues
estos materiales tienen diferentes grados de absorción y en ellos se
encuentran presentes gran cantidad de inhibidores de la PCR como los
taninos, que impiden que la reacción funcione.

La investigación de manchas de sangre sigue ocupando un lugar preferente

en Criminalística. Tradicionalmente, se ha venido realizando un sistema de
investigación que incluye la realización de los siguientes diagnósticos [1]:

1.- Orientación.

2.- Certeza.

3.- Especie.
4.- Individual (grupos, ADN, sexo).

5.- Otros (antigüedad, lugar de procedencia, etc.).

MANCHAS:

Según la clasificaciónde Simonin se dividen en:

. Manchas de proyección

. Manchas de escurrimineto

. Manchas de contacto

. Manchas de impregnación

. Manchas de limpieza

ASPECTO:

Ennegrece con el tiempo. Si no son visibles se emplea Luminol.

Ventajas

Efecto luminiscente en la oscuridad. No altera la mancha. Luego puede

seguir su análisis sin ningún problema.

Desventajas

Sensible al tiempo (usar inmediatamente a la preparación). Producto

comercial (costo elevado

PRUEBAS DE CERTEZA

Específicas y poco sensibles. Manifiesta elementos formes o hemoglobina.

1. Técnicas microscopicas: muestra elementos formes de la sangre.

2. Tecnicas microquimicas o cristalograficas.

Cristales deTeichman
 Cristales deTakayama (En caso Teichman sea negativo)

3. Técnicas cristalográficas:

4. Técnicas Espectrofotométricas: Espectro de absorción de hemoglobina

5. Tecnicas cromatograficas: Pruebas fisico-quimicas de la hemoglobina.

 PRUEBAS DE ORIENTACION
Muy sensibles

Carecen de especificidad

Presencia de lasperoxidasas de la sangre

Sangre (enzima) + H2O2=H2O+ O

(+ leucobase= base coloreada)

1. Reacción de Adler

BECIDINA SANGRE

ACIDO ACETICO GLACIAR

AGUA OXIGENADA

Azul intenso

La prueba de Adler tiene como fundamento la oxidacion, basada en a

presencia de peroxidasas (color verde o azul, con bencidina y ácido
acético glacial)
 2. Reaccion de Van deen

Resina de Guayaco sangre

Alcohol de 95

Agua oxigenada azul intenso

El método de guayacol fue desarrollado por Van Deen en 1864

para detectar sangre oculta.

Boas comenzó a usar este método en 1901 para diagnosticar

sangrado gástrico. La reacción de Van Deen (con tintura de guayaco y
agua oxigenada, color azul

REACCION DE KASTLER MEYER

Fenolftaleina

Hidroxido de potasio sangre

Polvo de zinc

Alcohol etilico absoluto

Agua destilada rojo

Agua oxigenada

REACCION DE MEDINGER

Verde malaquita sangre

Acido acetico glacial

Agua destilada

Agua oxigenada

Con verde de malaquita, forma leuco, recuperación del color verde)

REACCION DE LAS CATALASAS

Agua oxigenada con sangre burbujas

Las muestras de saliva no suelen presentar problemas en la analítica de
ADN. Suelen llegar al laboratorio en forma de mancha, sobre filtros de
cigarrillo, sellos, chicles o prendas (por ejemplo la zona coincidente con la
boca en un pasamontañas utilizado en un atraco) o bien en soportes más
engorrosos como vasos, botellas o huesos de fruta.

En las muestras de esperma de los casos de agresiones sexuales, el

principal problema es que además de los espermatozoides del agresor se
suele encontrar presente otro tipo celular procedente de la víctima, las
células del epitelio vaginal. Por ello, a la hora de analizar estas muestras nos
encontraremos con una mezcla de perfiles genéticos. Es de gran ayuda
disponer de una muestra indubitada de la víctima con el fin de identificar
qué alelos pueden proceder de la víctima en la mezcla evidenciada.

El análisis de ADN a partir de muestras de pelos es más delicado que a

partir de los restos biológicos anteriores. Estas muestras requieren un
análisis microscópico previo a la analítica molecular con el fin de determinar
el tipo de análisis que es posible en ellos (estudios de ADN nuclear o de ADN
mitocondrial) además de otras características importantes. Con el análisis
microscópico se determinan, entre otros, los siguientes puntos:

– Si se trata de pelos de origen animal o humano.

– Si se trata de pelos completos (con bulbo) o de fragmentos de pelos (sin

bulbo). En el caso de fragmentos de pelos los estudios a realizar son los de
ADN mitocondrial como veremos en el siguiente apartado.

En el caso de los pelos con bulbo se puede determinar en qué fase vital se
encuentra éste. En los pelos con bulbo telogénico (en fase de caída) se
suele realizar análisis de ADN mitocondrial y en los pelos con raíz anagénica
(en fase de crecimiento) se puede realizar un análisis de ADN nuclear.

– Visualizar el grado de suciedad que presentan los pelos y si aparecen

restos de posible sangre adheridos a los mismos. En el caso de presentar
sangre se ha de proceder a la separación de ambos tipos de restos
biológicos para su análisis por separado, pues puede tratarse de muestras
pertenecientes a diferentes personas.
En cuanto a las muestras de uñas diremos que se trata de una muestra muy
agradecida pues suele dar resultados positivos en la mayoría de los casos.
Las uñas pueden interesarnos fundamentalmente por dos motivos:

Como muestra biológica indubitada para la identificación cadavérica

(analizando la propia uña) cuando no es posible una identificación por
métodos no genéticos, o como lugar de búsqueda de restos biológicos si en
un hecho delictivo medió lucha.

Las muestras de tejidos también suelen estar relacionadas sobre todo con la
identificación de cadáveres en los que han comenzado los procesos de
putrefacción. Los mejores resultados se obtienen con músculo

Sangre: es un tipo de indicio fácilmente reconocible sobre determinados

soportes. Existe una amplia variedad de tests de diagnóstico previo que
ponen de relieve su presencia (luminol, benzidina, fenolftaleina, o-toloidina,
guayacol, verde leucomalaquita...). Los tipos de soporte más comunes sobre
los que se presenta son ropas, armas, uñas, en el lugar de los hechos
(tierra, suelo, piedras, paredes...). El estudio de la morfología de las
manchas en la escena del delito proporciona información a cerca de cómo
se produjeron los hechos.

La herramienta de elección es la individualización genética por

lo que los laboratorios de Biología Forense actuales están altamente
especializados en Genética Molecular.

RECUPERACIÓN DE LOS VESTIGIOS

I.- EXAMEN CUIDADOSO DEL CUERPO
Toma de muestras de sangre.
RECOGIDAS DE INDICIOS.
Muestras de sangre y/o saliva.
Identificación de indicios biológicos de interés criminal: son el tipo de
análisis más solicitado en el laboratorio de biología forense. Todos los
indicios recogidos sobre la víctima, el sospechoso o el lugar de los hechos
deben ser objeto de un minucioso y exhaustivo estudio que permita
localizar, conocer o confirmar la naturaleza de los indicios, que variaran en
función de las características del suceso investigado. Los vestigios
biológicos más frecuentes son los restos de sangre, fluidos seminales,
fluidos vaginales, saliva, pelos y restos orgánicos en uñas.
Estudios complementarios en casos de muerte por sumersión-
asfixia: siempre que se recupera un cadáver del agua o cuando se
sospecha que la causa de la muerte puede haber sido la sumersión, será
necesario confirmar los datos macroscópicos obtenidos en la autopsia
mediante estudio anatomopatológico y considerar otros datos tales como la
existencia de hidremia ( hemodilución de la sangre del ventrículo izquierdo
respecto de la del derecho) y la existencia de elementos formes en las
vísceras del cadáver que deben compararse, siempre que sea posible, con
las del líquido de sumersión.

Restos de orina: La identificación de la orina se basa en la detección de

iones o compuestos orgánicos que se hallan más concentrados en orina que
en otros fluidos fisiológicos, tales como la urea o creatinina, también
presentes en sudor, sangre, saliva, semen pero en menor concentración.
Contiene células epiteliales del tracto urinario, así como leucocitos y
eritrocitos, muy diluidas en la orina, por lo que la esperanza de recuperar
ADN a partir de manchas de orina es muy baja. Además, la flora bacteriana
propia de la orina acelera los procesos de degradación en la muestra.

De forma general y una vez que tenemos seleccionadas las muestras objeto
de análisis, todo el proceso analítico se puede dividir en tres grandes
bloques:

EXTRACCIÓN de ADN, AMPLIFICACIÓN (PCR) y DETECCIÓN.

Extracción de ADN

Posiblemente, de los tres bloques citados anteriormente, la extracción

constituya el paso más crítico, ya que cualquier manipulación errónea de la
muestra en esta etapa inicial del proceso puede conducirnos a su descarte,
siendo en algunos casos, el único indicio biológico de que se dispone para
resolver un delito.

Cualquier laboratorio forense debe contar con diferentes métodos de

extracción que permitan obtener en cantidad y calidad suficiente ADN de la
enorme variabilidad muestral que recibe. Los métodos de extracción se
pueden dividir en tres grupos:
a) Aquel que comprende una digestión, una extracción orgánica y una
purificación-concentración o, como alternativa, una precipitación con etanol.
Se utiliza para la mayoría de las muestras biológicas de interés forense.

b) Aquel que comprende una etapa de digestión seguida de una

precipitación con etanol. Se usa, principalmente, para obtener mucha
cantidad de ADN a partir de sangre en buen estado.

c) Aquel que comprende solo una extracción directa mediante membranas

especiales o bolas de sílice o similares. Su uso se limita normalmente a
muestras de sangre líquida.

La importancia de las manchas de sangre es conocida por todos, por la

frecuencia en el lugar del hallazgo (1) y la gran cantidad de datos que
pueden proporcionar: cómo han sucedido los hechos, cuál ha sido la
cronología de los mismos, cuántas personas han intervenido, qué objetos se
han utilizado, identificación del agresor o agresores, de las víctimas, cuál ha
sido la causa de la muerte.

Las muestras biológicas criminales, entre las que destacan las manchas de
sangre, tienen las siguientes peculiaridades (2), respecto a otro tipo de
muestras como son las clínicas:

Son escasas en concentración; puesto que la cantidad de sangre no es

la que solicita o desea el investigador, sino que ésta viene dada por las
características del hecho investigado: número de víctimas, número de
autores, tipo de agresión, manipulación posterior, etcétera Están mal
conservadas: las muestras recogidas para estudio criminal por norma han
estado expuestas a circunstancias ambientales o a manipulaciones
intencionadas que influyen en el estado de conservación. Estarán tanto peor
conservadas, cuanto más expuestas al ambiente externo hayan estado o
más manipulaciones hayan soportado.

Degradadas: En directa relación con la conservación y más en concreto

con las posibles acciones directas sobre las muestras, se encuentra el hecho
de que se deteriore el material biológico o lo que es lo mismo, que se
degrade, de modo que sea mucho más difícil alcanzar los objetivos
planteados en la investigación. En el mejor de los casos, la toma de la
muestra se hará en un periodo que se puede contar en horas, en otros, se
hablará de meses, incluso años. El tiempo constituye por sí solo un factor en
contra de la investigación de las muestras biológicas.

Contaminadas: La exposición del material biológico al ambiente o a

acciones externas determina que puedan contaminarse, es decir, incorporar
material biológico o no biológico, que influya en los resultados.

Y siempre irrepetibles: lo que diferencia fundamentalmente las muestras

biológicas judiciales del resto es que son irrepetibles e irreproducibles,
excepto cuando se trata de muestras indubitadas procedentes de una
víctima viva o del agresor, también vivo.

Así pues, los restos biológicos dejan de tener unas condiciones estables y de
control cuando abandonan el organismo del que proceden. Las condiciones
a las que se verán expuestos son peores y se consideran adversas, en
especial debido a las condiciones medioambientales, temperatura y
humedad, a la exposición a sustancias químicas o de microorganismos,
hongos y bacterias, etc. que pueden degradar el indicio o bien pueden
inhibir los análisis (3)

En el caso de las manchas de sangre, el estudio tradicional de este tipo de

incluye los siguientes diagnósticos: genérico -de orientación y de
confirmación-, de especie, individual (grupos, ADN, sexo) y otros
(antigüedad, lugar de procedencia, etcétera). El primero engloba tanto las
pruebas denominadas de orientación como las de confirmación o certeza. Si
bien actualmente en los laboratorios forenses se suele realizar un
diagnóstico simultáneo genérico y específico, mediante el uso de los kits
comerciales de detección de hemoglobina humana, no hay que olvidar que
este tipo de indicio se debe buscar en todas las escenas criminales; que
unas veces serán evidentes a simple vista y otras, por su baja concentración
o por degradación, necesitarán de medios de búsqueda y de puesta en
evidencia. El descubrimiento de una mancha en el lugar estudiado no
implica que sea de sangre, por lo que resulta fundamental determinar cuál
es su naturaleza (6) y, por tanto, realizar un estudio genérico sobre las
mismas.

Este trabajo sigue la línea de investigación que iniciaron el profesor Verdú y

la profesora Gisbert en 1995 (7), continuada con la tesis doctoral de la
profesora Castelló (1) y con la publicación en 2003 del estudio de la
fiabilidad de las pruebas de orientación sobre manchas contaminadas con
distintos productos (6, 8) En realidad no se pretende valorar cómo influye
la contaminación en muestras recientes, sino cómo afecta la degradación
que se produce con el paso del tiempo y con la exposición a factores
ambientales (8). Así pues, se trata de comprobar la utilidad de las pruebas
de orientación sobre manchas sometidas a distintas condiciones
ambientales y en distintos soportes, en especial si se afecta la sensibilidad
del luminol y si influye el soporte. También se valora si el empleo de luces
puede mejorar la visibilidad de las manchas latentes.

Material y método

Obtención de la muestra

La sangre se obtuvo por venopunción y no se le añadió ningún conservante.

Las manchas se formaron al depositar una gota de sangre sobre el soporte

seleccionado.

Dado que es imposible simular en laboratorio todos los soportes sobre los
cuales puede haber una mancha de sangre, pues las escenas delictivas son
tan variables como diverso es el planeta y tras valorar todas las
posibilidades, se seleccionaron los siguientes materiales, siguiendo un
criterio lógico y de frecuencia de presentación en nuestro entorno
inmediato:

— Dos superficies impermeables: acero y hierro (placas metálicas de 3 x 3 y

4 x 4 cm)

— Ocho soportes porosos: dos tipos de azulejos, uno más rugoso y otro con
una superficie menos porosa; telas de distintos tipos: vaquera, de algodón,
sintética blanca y sintética estampada, también tela de rizo (toalla) y, por
último papel (pañuelos de celulosa).

Reactivos:

Fenolftaleína (PHENOLPHTHALEIN DISCHAPS™ Sirchie, Cat. No. DCB100)

Leucomalaquita verde (Leuco-Malachite DISCHAPS™ Sirchie, Cat. No.

DCB200)

Luminol (Merck)

Carbonato potásico (Panreac)

Perborato de sodio (Panreac)

Agua destilada

Para la preparación del reactivo Luminol se siguieron las instrucciones del

laboratorio y los métodos descritos en la bibliografía (9).

Procedimiento para la preparación de la muestra:

Sobre los diferentes soportes se forman manchas de sangre sin diluir,

dejando caer una gota con una pipeta Pasteur. En el caso de los soportes
impermeables y de los azulejos, se depositó la gota sobre la superficie y se
extendió con una espátula con el fin de obtener una fina película y evitar la
escasa adherencia debida a la forma de la gota.

En los soportes porosos la sangre formó una mancha, con bordes más o
menos difusos y extensión variable según el soporte. Se observó que la tela
sintética estampada era poco absorbente, por lo cual la mancha formaba
una costra inicial sobre la superficie.

Una vez seca la sangre, las muestras se han sometido a diferentes

condiciones ambientales. Es necesario precisar que dependiendo de la
naturaleza del soporte, se ha seleccionado las condiciones ambientales, en
las que se ha mantenido la muestra. Así, la distribución resultó como sigue:

1. Sumergidas en agua. Se han sumergido todos los soportes excepto los

azulejos, puesto que simulan el suelo o revestimiento y, por tanto, no van a
estar sumergidos en condiciones reales.

2. Enterrados. Todos los soportes excepto los azulejos, por la misma

razón.

3. En el resto de condiciones (aire libre a cubierto, aire libre a descubierto y

laboratorio) han estado todos los soportes.

Se depositaron también muestras control de cada tipo de soporte y

condición ambiental.

Procedimiento experimental

Los soportes se recogieron después de haber estado expuestos el tiempo

predeterminado (5, 10, 15, 20, 25, 40, 50, 70, 80 y 125 días).

Los soportes húmedos se dejaban secar y se guardaban en sobres de papel

para el transporte al laboratorio.

El periodo transcurrido desde la recuperación de los soportes y el estudio en

el laboratorio no ha sido fijo, sino que ha variado en función de la
disponibilidad de tiempo. En realidad, en los laboratorios de investigación, el
tiempo que transcurre también varía en función de las condiciones,
exigencias, necesidades, etcétera. no sólo del laboratorio sino también la
trascendencia judicial.

Pruebas de orientación:
Ya en el laboratorio, el método de estudio ha sido el habitual en el caso de
manchas de sangre:

1º Observación directa, con luz blanca con distintos filtros y con luz
ultravioleta.

2º Preparación de la muestra previa a la aplicación del reactivo.

Cuando sobre el soporte impermeable aparecía una mancha visible de

sangre, se procedía al raspado de la costra en un tubo eppendorf que
contenía suero fisiológico. Posteriormente se depositaban tres gotas de la
dilución sobre un hisopo y se realizaba la prueba.

Cuando la mancha no era visible, se procedía a la obtención de una «huella»

mediante un hisopo hidratado con agua destilada con el cual se limpiaba el
soporte; la prueba de orientación elegida se realizaba sobre un fragmento
de dicho hisopo.

En el caso de los soportes permeables, éstos se cortaban en varios

fragmentos, sobre los cuales se aplicaba el reactivo.

3º Exponer el hisopo o el fragmento al reactivo.

4º Leer el resultado.

Resultados

Como era de esperar, las muestras peor conservadas son las que han
estado sumergidas, enterradas y al aire libre descubierto, mientras que las
que han permanecido al aire libre cubierto y en el laboratorio se han
conservado mucho mejor; la mancha de sangre se ha mantenido visible a
simple vista durante el periodo estudiado.

En las tablas 1 a 4, se exponen los resultados obtenidos en función del

soporte.

Según el soporte utilizado, se puede decir que:

En el acero el luminol ofrece un resultado positivo hasta los 80 días

independientemente

del medio en el que se haya encontrado; para los cuatro meses, sólo se
obtienen resultados positivos con el luminol, excepto en las muestras
sumergidas.

La leucomalaquita es el reactivo que funciona peor con las muestras

antiguas y no sirve para muestras que hayan permanecido en agua.

Las luces no han demostrado ser eficaces en el examen de este soporte.

En el hierro y para muestras sumergidas, los reactivos de orientación

utilizados no sirven si se trata de manchas recientes, incluso de diez días. Lo
mismo se puede decir de las muestras al aire libre descubierto, expuestas a
la lluvia y otros factores atmosféricos; en este caso, es el luminol el que
mejores resultados da en muestras de hasta 25 días; no se obtienen
resultados

positivos a partir de esta fecha.

Las luces no son útiles a los 5 días si las muestras han estado sumergidas, y
a los 25 días si han estado al aire libre descubierto. En los soportes que han
estado al aire libre cubierto y en el laboratorio las manchas son visibles a
simple vista a los 125 días y los resultados de las pruebas de orientación
son positivos.

En el azulejo no poroso, la fenolftaleína es el reactivo que peor funciona

en manchas antiguas y deterioradas, expuestas a las condiciones
medioambientales.

Con la leucomalaquita se obtienen resultados positivos con muestras

deterioradas de hasta 80 días.