EXPERIMENTACIÓN EN QUÍMICA ANALÍTICA .

4º Curso de Licenciatura en Química

PRÁCTICA 4

DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE GLUCOSA Y SACAROSA EN ALIMENTOS

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA.

Desde un punto de vista analítico, la capacidad de los enzimas para catalizar

reacciones específicas con un alto grado de eficacia, ha dado lugar a diferentes
aplicaciones en diversos campos del análisis como análisis clínicos, análisis de
productos alimentarios, análisis de preparados farmacéuticos etc.

El análisis enzimático o análisis mediante el empleo de enzimas puede ser

utilizado en:
1. La determinación de los sustratos de la reacción enzimática, siendo posible
determinar específicamente cada una de las sustancias de una mezcla sin necesidad de
separar. Para la cuantificación de sustratos se pueden utilizar dos métodos generales:
a. Métodos de cambio total, de equilibrio o de punto final. En este tipo de
métodos (los más utilizados en la práctica) se permite que la reacción enzimática
se complete o llegue al equilibrio y se mide la variación producida en la
concentración de un producto de reacción o de un reactivo presente inicialmente
en exceso.
b. Métodos cinéticos, en los que se utilizan medidas de la velocidad inicial de la
reacción enzimática para deducir la concentración inicial de sustrato. Los
procedimientos de medida son idénticos a los utilizados para reacciones
catalíticas en general.

2. Determinación de los mismos enzimas mediante el empleo de métodos

cinéticos en los que se mide la velocidad de desaparición del sustrato o de generación
del producto, relacionada con la concentración de enzima en disolución.

3. Determinación de otras sustancias mediante el empleo de reactivos marcados

con enzimas: enzimoinmunoanálisis.

El objetivo de esta práctica es determinar el contenido de glucosa y sacarosa en

un zumo empleando para ello un método enzimático espectrofotométrico de tiempo fijo.
Se trata de certificar la autenticidad de un zumo de fruta comercial. El volumen de un

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zumo natural puede aumentarse simplemente agregándole agua. Otras formas más
sofisticadas de adulteración incluyen la adición de azúcares y ácidos para producir
disoluciones con composición similar a la del producto auténtico. En cualquier caso se
altera la relación específica de azúcares con respecto a la del producto natural. En el
anexo se facilita una tabla en la que se resumen los requerimientos de calidad para jugos
según la organización AIJN (Association of the Industry of Juices and Nectars from
Fruits an Vegetables ).

2. FUNDAMENTOS

Aunque la glucosa puede determinarse por métodos químicos, estos en su

mayoría carecen de especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros
monosacáridos. Tanto en análisis clínicos como en la industria alimentaria se utilizan
métodos enzimáticos para la determinación de glucosa. Así la glucosa oxidasa es una
flavoproteina altamente específica que cataliza la oxidación de la glucosa a β-D-
gluconolactona, sin que ningún otro azúcar natural reaccione en extensión apreciable.
GOD
C6H12O6 + O2 C6H10O6 + H2O2

Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamente

o mediante un electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta
reacción espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda
reacción enzimática indicadora adecuada. Para la determinación colorimétrica de
glucosa por el método de la oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre
(HRP), que elimina el peróxido de hidrógeno a medida que se forma, a la vez que se
genera un colorante adecuado según el siguiente esquema de reacción:
HRP
H2O2 + Aceptor de oxígeno Producto coloreado + H2O
(DH2) (D)

Se podrían utilizar como aceptores de oxígeno benzidina, o-toluidina, o-dianisidina. Sin

embargo, la naturaleza carcinogénica de estos compuestos ha impulsado la búsqueda de
aceptores alternativos. Uno de estos sistemas es la 4-aminoantipirina que reacciona con
el fenol y el peróxido de hidrógeno en presencia de HRP para formar un colorante con
estructura de quinonaimina, que presenta un máximo de absorción a 505 nm.

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CH3 NH2
OH CH3 N
CH3 N
N O HRP
+ + H2O 2 CH3 N
N O + H2O

Este método, propuesto por Trinder (1) en 1972, será el empleado en esta práctica para
la determinación de glucosa en un zumo. A continuación se resumen las distintas
reacciones acopladas que se utilizarán para la determinación de la glucosa. La cantidad
de colorante generada, y por tanto la absorbancia medida a 505 nm, será directamente
proporcional a la cantidad de glucosa.

GOD HRP
Glucosa H2O2 H2O
4-aminoantipirina +
O2 Gluconolactona fenol Colorante

El disacárido sacarosa puede también determinarse específicamente basándose

en el esquema de reacciones anterior, previa hidrólisis enzimática del mismo con el
enzima fructofuranosidasa o invertasa. Este enzima cataliza la transformación de la
sacarosa en una molécula de fructosa y una molécula de glucosa (azúcar invertido). Se
debe determinar la glucosa en la muestra antes y después de la hidrólisis enzimática, por
diferencia se obtiene el contenido de sacarosa.

Invertasa GOD HRP

Sacarosa Glucosa H2O2 H2O
4-aminoantipirina
Fructosa O2 Gluconolactona + fenol Colorante

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3. MATERIAL, REACTIVOS, INSTRUMENTACIÓN

a. Instrumentación
− Espectrofotómetro monohaz Spectronic 20 con cubetas de 1 cm de paso de luz.

b. Material
• 4 matraces de 100 ml
• 8 matraces de 50 ml
• 1 vaso de 250 ml, 2 vasos de 100 ml
• 1 embudo, papel de filtro, vidrio de reloj.
• Cronómetro

c. Reactivos

Reactivo Trinder: Disolución que contiene todos los reactivos necesarios para la
determinación de la glucosa por el método propuesto en las concentraciones que se
indican a continuación:

• 4-aminoantipirina 0,3 mmol/L

• Fenol 8,5 mmol/L
• Glucosa oxidasa (GOD) obtenida de Aspergillus Niger 10 U/mL
• Peroxidasa de rábano silvestre (Horseradish peroxidase, HRP) 0,3 U/mL

Estos reactivos, en las cantidades adecuadas, se suministran en una disolución

reguladora de pH 6,6 lista para su uso. Esta disolución debe almacenarse en botellas
color topacio y en el refrigerador. Si se mantiene entre 2 –8 ºC la disolución estable
durante 2 meses.

Disolución de invertasa 100 U/ml en tampón de citrato 0,1 M de pH 4,6. Preparar 50

mL

Disolución patrón de glucosa 0,01 M

Disolución Carrez I. Disolver en agua 3,6 g de ferrocianuro potásico y llevar a 100

mL.

Disolución Carrez II. Disolver en agua 7,2 g de acetato de zinc y llevar a 100 mL

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4. PROCEDIMIENTO

Se empleará un método de tiempo fijo para la cuantificación de glucosa y

sacarosa en una muestra de zumo comercial.

Para la construcción de la línea de calibrado deben prepararse cinco disoluciones

de glucosa de concentraciones comprendidas entre 5×10-5 M y 5×10-4 M por dilución
del patrón de glucosa. Añadir a la cubeta del espectrofotómetro 1 mL de reactivo
Trinder y 250 µL de patrón, mezclar e incubar exactamente 5 minutos a temperatura
ambiente. Medir a continuación la absorbancia de la mezcla de reacción a 505 nm frente
a un blanco de reactivos.

Para la determinación de glucosa y sacarosa en la muestra, esta se diluirá con

agua en la proporción adecuada según el contenido de glucosa y sacarosa esperado. Las
muestras turbias deben tratarse con los reactivos Carrez y filtrarse. Para ello pipetear 2
mL de muestra en un vaso que contenga unos 30 mL de agua, añadir 2,5 mL de
disolución Carrez I y 2,5 mL de disolución Carrez II. Filtrar, recoger cuantitativamente
en un matraz de 100 mL y llevar a volumen.

Para la determinación del contenido de glucosa, se procederá con la disolución

diluida de la misma manera que con los patrones de glucosa.

Para determinar el contenido de sacarosa se llevará a cabo en primer lugar su

hidrólisis enzimática a glucosa y fructosa (inversión) con invertasa. Para ello se toman 2
mL de la disolución de muestra (con un contenido máximo de sacarosa de 1 g/L) y se
mezclan con 8 mL de la disolución de invertasa. Se incuban 15 minutos a 55 ºC. La
suspensión fría se filtra, se lava el filtro y se recoge cuantitativamente en un matraz
aforado enrasando con agua hasta la marca, realizando a continuación la determinación
del contenido total de glucosa según el procedimiento anteriormente descrito. El
contenido de sacarosa se obtiene por diferencia entre las concentraciones de glucosa
obtenidas antes y después de la inversión enzimática. Expresar el contenido de glucosa y
sacarosa en la muestra en g/L.

5. BIBLIOGRAFÍA

1. D. Barham, P. Trinder; Analyst,1972, 97, 142-145

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Extracto del Código de Prácticas del AIJN sobre requerimientos absolutos de calidad para zumos

Ácido Ácido Ácido Ácido L- Ácido

Ácidos Etanol Ácido D- Nitrato Amonio Glucosa Fructosa Sacarosa Sorbitol
D/L- ascórbico cítrico málico glutámico
volátiles (g/L) málico (g/L) (mg/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L)
Láctico (mg/L) (mg/L) (g/L) (mg/L)
(g/L)
(g/L)
Naranja Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.2 Min 200 6.7-17 0.8-3 No 75-205 Max 5 Max 25.5 20-50 20-50 10-50
Pomelo Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.2 Min 200 8-20 0.2-1.2 No 80-235 Max 5 14-50 20-50 20-50 5-40
Manzana Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.5 50-200 Min 3.0 No 10-200 Max 5 15-35 45-85 5-30 2.5-7
Uva Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.5 Max 0.5 2.5-7 No 20-150 Max 5 60-110 60-110 Trazas
Limón Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.2 Min 150 45-63 1.0-7.5 No 160-400 Max 5 Max 100 3-12 3-11 7.0
Tomate Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.5 2-5 0.1-0.6 No Max 20 10-16 12-18 Max. 1
Maracuyá Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.5 25-50 1.3-5.0 No 300-800 Max 30 Max 140 20-55 20-53 10-45
Pera Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.5 Max 4.0 0.8-5 No 20-70 Max 10 10-35 50-90 0-15 10-25
Damasco Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.5 1.5-16 5-20 No 0.27-1.36 Max 15 15-50 10-45 0-55 1.5-10
Grosella Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.5 Min 750 26-42 1-4 No 40-220 Max 15 Max 150 23-50 30-65 Max 5
Cereza Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.5 Max 0.4 15.5-27 No 20-150 Max 10 Max 200 35-70 32-60 10-35
Frambuesa Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.5 9-22 0.2-1.2 No Max 10 15-38 18-45 Max 10
Fresa Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.5 5-11 0.6-5 No 20-250 Max 200 5-90 15-35 18-40 Max 10 Max 0.25
Mandarina Max. 0.4 Max. 3 Max. 0.2 Min 100 6-22 0.5-3 No 60-200 Max 5 10-40 10-40 20-60