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determinacion de glucosa y sacarosa en alimentos

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pureba de laboratorio de alimentos
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EXPERIMENTACIÓN EN QUÍMICA ANALÍTICA
 
. 4º Curso de Licenciatura en Química
1
PRÁCTICA 4
DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE GLUCOSA Y SACAROSA EN ALIMENTOS1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA.
Desde un punto de vista analítico, la capacidad de los enzimas para catalizarreacciones específicas con un alto grado de eficacia, ha dado lugar a diferentesaplicaciones en diversos campos del análisis como análisis clínicos, análisis deproductos alimentarios, análisis de preparados farmacéuticos etc.El análisis enzimático o análisis mediante el empleo de enzimas puede serutilizado en:1.
La determinación de los sustratos
de la reacción enzimática, siendo posibledeterminar específicamente cada una de las sustancias de una mezcla sin necesidad deseparar. Para la cuantificación de sustratos se pueden utilizar dos métodos generales:a. Métodos de cambio total, de equilibrio o de punto final. En este tipo demétodos (los más utilizados en la práctica) se permite que la reacción enzimáticase complete o llegue al equilibrio y se mide la variación producida en laconcentración de un producto de reacción o de un reactivo presente inicialmenteen exceso.b. Métodos cinéticos, en los que se utilizan medidas de la velocidad inicial de lareacción enzimática para deducir la concentración inicial de sustrato. Losprocedimientos de medida son idénticos a los utilizados para reaccionescatalíticas en general.2.
Determinación de los mismos enzimas
mediante el empleo de métodoscinéticos en los que se mide la velocidad de desaparición del sustrato o de generacióndel producto, relacionada con la concentración de enzima en disolución.3. Determinación de otras sustancias mediante el empleo de reactivos marcadoscon enzimas:
enzimoinmunoanálisis
.El objetivo de esta práctica es determinar el contenido de glucosa y sacarosa enun zumo empleando para ello un método enzimático espectrofotométrico de tiempo fijo.Se trata de certificar la autenticidad de un zumo de fruta comercial. El volumen de un
 
EXPERIMENTACIÓN EN QUÍMICA ANALÍTICA
 
. 4º Curso de Licenciatura en Química
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zumo natural puede aumentarse simplemente agregándole agua. Otras formas mássofisticadas de adulteración incluyen la adición de azúcares y ácidos para producirdisoluciones con composición similar a la del producto auténtico. En cualquier caso sealtera la relación específica de azúcares con respecto a la del producto natural. En elanexo se facilita una tabla en la que se resumen los requerimientos de calidad para jugossegún la organización AIJN (Association of the Industry of Juices and Nectars fromFruits an Vegetables ).
2. FUNDAMENTOS
Aunque la glucosa puede determinarse por métodos químicos, estos en sumayoría carecen de especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otrosmonosacáridos. Tanto en análisis clínicos como en la industria alimentaria se utilizanmétodos enzimáticos para la determinación de glucosa. Así la glucosa oxidasa es unaflavoproteina altamente específica que cataliza la oxidación de la glucosa a
β
-D-gluconolactona, sin que ningún otro azúcar natural reaccione en extensión apreciable.C
6
H
12
O
6
+ O
2
C
6
H
10
O
6
+ H
2
O
2
Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamenteo mediante un electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de estareacción espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segundareacción enzimática indicadora adecuada. Para la determinación colorimétrica deglucosa por el método de la oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre(HRP), que elimina el peróxido de hidrógeno a medida que se forma, a la vez que segenera un colorante adecuado según el siguiente esquema de reacción:H
2
O
2
+
 Aceptor de oxígeno Producto coloreado
+ H
2
O
(DH 
2
)
 
(D)
Se podrían utilizar como aceptores de oxígeno benzidina,
o
-toluidina,
o
-dianisidina. Sinembargo, la naturaleza carcinogénica de estos compuestos ha impulsado la búsqueda deaceptores alternativos. Uno de estos sistemas es la 4-aminoantipirina que reacciona conel fenol y el peróxido de hidrógeno en presencia de HRP para formar un colorante conestructura de quinonaimina, que presenta un máximo de absorción a 505 nm.
GODHRP
 
EXPERIMENTACIÓN EN QUÍMICA ANALÍTICA
 
. 4º Curso de Licenciatura en Química
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Este método, propuesto por Trinder (1) en 1972, será el empleado en esta práctica parala determinación de glucosa en un zumo. A continuación se resumen las distintasreacciones acopladas que se utilizarán para la determinación de la glucosa. La cantidadde colorante generada, y por tanto la absorbancia medida a 505 nm, será directamenteproporcional a la cantidad de glucosa.El disacárido sacarosa puede también determinarse específicamente basándoseen el esquema de reacciones anterior, previa hidrólisis enzimática del mismo con elenzima fructofuranosidasa o invertasa. Este enzima cataliza la transformación de lasacarosa en una molécula de fructosa y una molécula de glucosa (azúcar invertido). Sedebe determinar la glucosa en la muestra antes y después de la hidrólisis enzimática, pordiferencia se obtiene el contenido de sacarosa.Glucosa
GOD
O
2
Gluconolactona
H
2
O
2
 HRP
Colorante
H
2
O
4-aminoantipirina +fenol
Glucosa
GOD
O
2
Gluconolactona
H
2
O
2
 HRP
Colorante
H
2
O
4-aminoantipirina+ fenol
 Invertasa
SacarosaFructosaNNCH
3
CH
3
ONH
2
OH
++
H
2
O
2
HRPNNCH
3
CH
3
ONH
2
O
+
O

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