Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

KCKT dapat disamakan dengan

KGC dalam hal kepekaan dan
kemampuannya menghasikan data
kualitatif dan kuantitatif dengan
sekali kerja saja. Perbedaannya
ialah fase diam yang terikat pada
poli-mer berpori terdapat dalam
kolom baja tahan karat yang
bergaris tengah kecil, dan fase gerak cair mengalir akibat tekanan yang besar. Alat KCKT
lebih mahal daripada alat KGC, terutama karena diperlukan sistem pompa yang cocok
serta semua sambungan harus disekrup sgar dapat menahan tekanan. Fase geraknya
adalah campuran pelarut ys-ng dapat bercampur. Campuran ini dapat tetap susunannya
(penusahan isokratik) atau dapat diubah perbandingannya secara sinambung dengan
menambahkan ruang pencampur kepada susunan alat (elusi landaian), Senyawa dipantau
ketika keluar dari kolom dengan mcnggunakan pendeteksi, biasanya dengan mengukur
spek-trum serapan UV. Dapat ditambahkan pemadu (integrator) untuk mengolah data
yang dihasilkan dan seluruh pekerjaan dapat diken-dalikan dengan mikroprosesor.
Perbedaan utama antara KCKT dan KGC ialah bahwa cara pertama biasanya
dilakukan pada suhu kamar sehingga senyawa tidak men-dapat perlakuan yang
memungkinkan terjadinya tatasusun-ulang termal selama pemisahan. Tetapi, mungkin
saja pengendalian suhu kolom KCKT menguntungkan pada pemisahan kritis sehingga
mungkin diperlukan selubung yang dikendalikan dengan termostat. Kolom, yang
biasanya dikemas dengan partikel bulat kecil yang terbuat dari silika yang berlapiskan
atau berkaitan dengan fase diam, terutama peka terhadap cemaran. Dengan demikian
ekstrak tumbuhan perlu dimurnikan dan disaring sebelum disuntikkan ke dalam pangkal
kolom.
KCKT digunakan terutama untuk golongan senyawa takatsiri, misal-nya
terpenoid tinggi, segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid, dan gula. KCKT berhasil
paling baik untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spektrum UV atau spektrum
sinar tampak. Satu contoh pemisahan flavonoid dengan KCKT ditunjukkan pada gambar
1.3. Untuk gula yang tidak menunjukkan serapan UV dapat digunakan pendeteksi indeks
bias, tetapi kepekaannya lebih rendah. Protein telah dipisahkan dengan KCKT dengan
menggunakan kolom 'sephadex' yang dimodifikasi, silika gel, atau penukar ion.
Sebagian besar pemisahan dengan KCKT modern menggunakan kolom siap
pakai, dan berbagai jenis kolom ini disediakan oleh pabrik. Tetapi, kebanyakan
pemisahan dapat dilakukan dengan menggunakan kolom partikel silika mikropori (untuk
senyawa nonpolar) atau kolom fase-balik, yaitu fase-ikat Cig (untuk senyawa polar)
(Hamilton dan Sewell, 1982). Satu hal praktis terakhir yang patut disebut-kan yaitu
pelarut harus ultramurni dan harus diawagaskan sebelum dipakai.
KCKT merupakan cara kromatografi paling baru yang ditambahkan ke dalam
perlengkapan fitokimiawan. Terlepas dari biaya alat dan pelarut, KCKT memberi harapan
sebagai alat terpenting dan serba guna pada analisis kuantitatif tumbuhan. Namun
demikian, KCKT hams dapat membuktikan kegunaannya pada skala preparatif.

Metode identifikasi
Umum
identifikasi suatu kandungan tumbuhan, setelah kandungan itu oiisolasi dan
dimurnikan, pertama-tama harus kita tentukan dahulu golongannya, kemudian barulah
ditentukan jenis senyawa dalam golongan tersebut. Sebelum itu, keserbasamaan senyawa
tersebut harus diperiksa dengan cermat, artinya senyawa harus membentuk ^ercak
tunggal dalam beberapa sistem KLT dan/atau KKt.
Golongan senyawa biasanya dapat ditentukan dengan uji warna, penentuan
kelarutan, bilangan Rp, dan ciri spektrum UV. Uji bio-kimia dapat bermanfaat juga:
adanya glukosida dapat dipastikan dengan hidrolisis yang menggunakan j &
-glukosidase; adanya glukosida minyak amandel dengan hidrolisis yang menggunakan
mirosinase, dan sebagainya. Untuk senyawa pengatur tumbuh, uji biologi merupakan
bagian identifikasi yang penting.
Identifikasi lengkap dalam golongan senyawa bergantung pada peng-ukuran sifat
atau ciri lain, yang kemudian dibandingkan dengan data dalam pustaka. Sifat yang diukur
termasuk titik leleh (untuk senyawa padat), titik didih (untuk cairan), putaran optik (untuk
senyawa aktif optik), dan Rp atau RRt (pada kondisi baku). Tetapi, data mengenai
senyawa tumbuhan yang sama ialah ciri spektrumnya, termasuk pengukuran spektrum
UV, inframerah (IM), resonansi magnet inti (RMI), dan spektrum massa (SM). Biasanya
senyawa yang pernah diketahui dapat diidentifikasi berdasarkan data di atas. Untuk
pemastian akhir harus dilakukan pembandingan langsung dengan senyawa autentik (bila
ada). Bila senyawa autentik tidak ada, pembandingan saksama dengan data pustaka sudah
cukup untuk identifikasi. Bila menjumpai senyawa baru, semua data di atas sudah cukup
untuk menentukan cirinya. Tetapi, untuk senyawa baru, pemastian identitas sebaiknya
dengan penguraian kimia atau dengan mensintesis senyawa tersebut.
Identifikasi senyawa tumbuhan baru dengan kristalografi sinar-X sekarang sudah menjadi
rutin dan dapat dilakukan bila senyawa itu cukup jumlahnya dan berbentuk kristal. Cara
ini terutama sangat bermanfaat pada kasus terpenoid rumit karena dengan cara ini dalam
sekali kerja saja kita dapat menentukan sekaligus struktur kimia dan stereokimia.
Sekarang akan dikemukakan ulasan singkat mengenai berbagai cara spektrofotometri itu
dan perbandingan peranan masing-masing pada identifikasi fitokimia. Mengenai
pembahasan cara spektrofotometri yang lebih terinci, anda dipersilakan membaca salah
satu dari se-jumlah buku yang mengupas penggunaan cara spektrofotometri dalam kimia
organik (Brandt dan Eglinton, 1965; Williams dan Fleming, 1966; Scheinmann, 1970,
1974).