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PROCEDIMENTOS EM TÉCNICAS
LABORATORIAIS VEGETAIS
Mauren C.A.Silveira
Biomédica
Graduanda Eng. Biotecnológica
SUMÁRIO
Gurupi/2010
UFT 2
PRECAUÇÕES 5
PREPARO DE SOLUÇÕES 7
MACERAÇÃO 16
CENTRIFUGAÇÃO 16
TIPOS DE CENTRÍFUGAS 17
VELOCIDADES DE SEPARAÇÃO DE COMPONENTES 18
CENTRIFUGAÇÃO X SOLVENTES 19
ESPECTROFOTOMETRIA 20
ELETROFORESE 21
ELETROFORESE EM GEL 22
Gel de Agarose 23
Gel de Poliacrilamida 24
Gurupi/2010
UFT 3
DNA 25
SENTIDO 5’- 3’ 28
PROTEÍNAS 29
RNA 30
NUCLEASES E RIBONUCLEAES 33
NUCLEASES 34
Enzimas de restrição tipo II 34
Nuclease Bal 31 35
Nuclease S1 35
Desoxirribonuclease I (DNAse I) 35
Nuclease Microcócica 35
Exonuclease III 36
RIBONUCLEASES 36
Ribonuclease A (RNAse A) 36
Ribonuclease H (RNAse H) 36
Ribonuclease T1 37
DNA POLIMERASES 37
DNA Polimerases DNA – Dependentes 37
DNA Polimerase I 38
Fragmento Klenow 39
T4 DNA Polimerase 40
T7 DNA Polimerase 40
Taq DNA Polimerase 40
DNA POLIMERASES RNA – DEPENDENTES 41
AMV Transcriptase Reversa 41
DNA Polimerase - Independente de Molde 42
RNA POLIMERASES 42
RNA Polimerases DNA – Dependentes 43
RNA Polimerases DNA – Independentes 43
Polinucleotídeo Fosforilase 44
LIGASES 44
T4 DNA Ligase 44
T4 RNA Ligase 45
FOSFATASES E QUINASES 45
Fosfatases 45
Quinases 46
SOLUÇÃO TAMPÃO 46
TAMPÃO DE CORRIDA 47
TAE (TRIS-ACETATO-EDTA) 47
CTAB 2% 47
NACL 5M 48
EDTA (ÁCIDO ETILENO DIAMONO TETRACÉTICO) 0,5 M PH 8,0 48
CLOROFÓRMIO (ÁLCOOL ISOAMÍLICO) (E/OU FENOL) 48
INCUBAÇÃO EM BANHO-MARIA 49
-MERCAPTOETANOL 0,2% 49
PVP (POLIVINILPIRROLIDONA) 49
BROMETO DE ETÍDEO 49
Gurupi/2010
UFT 4
Referências bibliográficas 93
Gurupi/2010
UFT 5
PRECAUÇÕES
Durante extrações de RNA as luvas devem ser trocadas se houver contato com
superfícies ou material não tratado com DEPC.
Pode-se tratar vidraria e material de plástico com DEPC 0,1%, lavando com
água previamente tratada com DEPC e esterilizando-os em autoclave por 20 min
a 121ºC.
Folhas coletadas para análises devem ser rapidamente congeladas a fim de inibir
ação de RNAses endógenas.
Fenol, clorofórmio, formaldeído e -mercaptoetanol são tóxicos e devem ser
manipulados em capela de exaustão com EPIs.
Gurupi/2010
UFT 6
A pipetagem deve ser feita com exatidão, tomando o cuidado com excessos do
lado de fora da ponteira.
Gurupi/2010
UFT 7
PREPARO DE SOLUÇÕES
Molaridade (M – g/L)
Molaridade é a concentração de uma SOLUÇÃO em molar.
1 molar = 1 mol de soluto em 1L de solução final.
1 mol de soluto = soma de todas massas moleculares que compõem o soluto.
Ex. 1 mol de NaCl = 58,5g (Na = 23g e Cl = 35,5g)
NaCl 1M = 58,5G DE NAcL em 1L de água
58,5g/mol = 58,5MM
MM = massa molar
OBS. 1M de NaCl é muito concentrado, quase saturado, mas a concentração depende da
massa molecular dos compostos da solução.
Percentual (% - g/mL)
Pode ser expresso em m/v (massa/volume), v/v (volume/volume), m/m (massa/massa).
Ex. NaCl 2% = 2g de NaCl em 100mL de solução final.
Para solutos líquidos: ex. Glicerol 10% = 10 mL de glicerol em 100 mL de solução final
( 10 mL de glicerol + 90 mL de água)
Outras Relações
mg/mL,g/mL
Ex. qualquer solução de 100mL em concentração 10 mg/mL =
1g de soluto em 100 mL de solução final =
1000mg/100mL = 10mg/1mL
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UFT 8
0,001g = 1 mg
100g = 0,1 Kg
Diluições de Soluções
Antes da Diluição
Após a Diluição
Gurupi/2010
UFT 9
Ou:
Exemplo:
Obter álcool etílico 70% a partir de álcool etílico 95%:
Álcool 70% = 700 mL de álcool + 300 mL de água
Álcool 95% = 950 mL de álcool + 50 mL de água
Álcool 100% = 1000 mL de álcool + 000 mL de água
Para 1L:
315,78 mL de álcool 95% + 684,22 mL de água = 1 L de álcool 30%
95% x V1 = 30% x 1 L
V1 = 0,31578 L = 315,78 mL
1 L – 315,78 mL = 684,22 mL
DEPC 0,5 mL
Água destilada autoclavada por 2 horas 500 mL
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UFT 10
EDTA 18,612 g
Água DEPC 70 mL
Ajustar o pH para 8.0 com NaOH
Completar o volume para 100mL com água DEPEC.
Na2EDTA.2H2O 186,1 g
Água destilada 800 mL
Agitar com agitador magnético
Ajustar pH para 8.0 com NaOH, aprox. 20g em pastilhas
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UFT 11
Clorofórmio 480 mL
Álcool isoamílico 20 mL
Fenol equilibrado 500 mL
Agarose 2g
TAE ou TBE 1X 200 mL
Fundir em microondas. Deixar esfriar até 70ºC aprox.
Adicionar brometo de etídio 1% 1 L
Misturar suavemente.
NaOH 400 g
Água destilada 1L
NACL 5M -DEPC
NaCl 146 g
Água DEPC q.s.p. 500 mL
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UFT 12
NACL 5M
NaCl 292,2 g
Água destilada q.s.p. 1 L
Esterilizar em autoclave
RNASE A 10MG/ML
SDS 20%
SDS 200 g
Água destilada 700 mL
Banho-maria a 50ºC, no mínimo.
Água destilada q.s.p. 1 L
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UFT 13
TAMPÕES
Tris HCl 1M
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UFT 14
TAE 50X
TBE 10X
TE pH 8.0
Gurupi/2010
UFT 15
NaH2PO4.H2O Na2HPO4
pH
1M 1M
53,7 mL 46,3 mL 6.8
42,3 mL 57,7 mL 7.0
22,6 mL 77,4 mL 7.4
15,5 mL 84,5 mL 7.6
10,4 mL 89,6 mL 7.8
STE
NaCl 5M 2 mL
Tris-HCl 1M 1 mL
EDTA 500mM; pH 8.0 200 L
Água destilada q.s.p. 100 mL
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UFT 16
Na2HPO4 14,4 g
KH2PO4 2,4 g
NaCl 80 g
KCl 2g
Água destilada q.s.p. 1L
Ajustar o pH para 7.4. Esterilizar em autoclave
MACERAÇÃO
Em cadinhos com nitrogênio líquido: as paredes celulares devem ser rompidas com o
objetivo de liberar os constituintes celulares.
CENTRIFUGAÇÃO
Remoção dos resíduos celulares e precipitação das proteínas. A desproteinização é
obtida através de um tratamento com fenol ou clorofórmio, pois esses solventes
orgânicos desnaturam as proteínas e enzimas, e são separadas após centrifugação,
permanecendo na interface entre a fase aquosa (superior) contendo os ácidos nucléicos e
a fase orgânica (inferior).
A centrifugação depende do raio do rotor em cm, do ângulo fixo (tubo inclinado) ou
ângulo variável ou swingout (tubo pêndulo). A força centrífuga relativa (RCF) ou xg
significa quantas vezes uma amostra é acelerada em relação à gravidade na superfície da
Terra (9,8 N/s2 ou 1xg).
Gurupi/2010
UFT 17
Tipos de centrífugas
Microcentrífugas
0,5 a 1,5 mL de capacidade e até 14000 rpm em segundos.
Centrífugas de média velocidade
São geralmente preparativas. Apresenta vários volumes, aceleração máxima até 20000
rpm e vários tipos de rotores. Pode ser feita a separação de bactérias ou outras células
do meio de cultura até o fracionamento celular.
Ultracentrífugas
A primeira foi da marca Svedberg e hoje existem as que atingem 60000xg. Podem ser
preparativas para separação de moléculas e/ou partículas ou técnicas analítica para
medir as propriedades físicas de macromoléculas.
Apresenta o rotor em câmara blindada, sistema de alto vácuo para eliminar o atrito com
o ar e o superaquecimento. Possui sistema de refrigeração. Os rotores são em liga de
titânio e o disco na parte inferior do rotor possui uma superfície clara e outra escura para
a leitura óptica por fotocélula que capta o sinal quando o rotor gira e pode desligar a
centrífuga, caso haja desbalanceamento dos tubos ou caso a velocidade máxima seja
alterada.
Gurupi/2010
UFT 18
A unidade S de peso para compostos microssomais foi devido à marca Svedberg que
proporcionou tal medida.
É tecnicamente chamado de coeficiente de sedimentação (s): velocidade por unidade de
força. S de uma partícula é a sua velocidade de sedimentação por unidade de campo de
força F.
As unidades Svedberg (S) são expressas em 10-13segundos porque grande parte das
moléculas biológicas sedimenta a velocidades iguais ou superiores a essa.
Ex: albumina sérica: coeficiente de sedimente de 4,5S
Vírus da poliomielite: 150S
Mitocôndria: 15000- 65000S
Ribossomos: 80S
DNA de bacteriófago: T5 50S
tRNA de E. coli: 15 S
tRNA de levedura: 4S
Gurupi/2010
UFT 19
Centrifugação X Solventes
ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetro é o aparelho utilizado para quantificação do comprimento de luz
absorvido ou refletido por uma substância.
A cor é a luz resultante de vários comprimentos de onda que foram refletidos, assim,
uma substância que tem a cor vermelha sendo refletida, é por que absorveu a cor azul.
Gurupi/2010
UFT 20
1g de um fragmento de DNA com 1000pb = 1,52 pmol = 9,1 x 1011 moléculas
1g do plasmídeo pUC19 (2686pb) = 0,57 pmol = 3,4 x 1011 moléculas
1g do plasmídeo pBR 322(4361pb) = 0,35 pmol = 2,1 x 1011 moléculas
1g de DNA do bacteriófago M13mp19 (fita dupla com 7249pb na forma) = 0,21 pmol
= 1,3 x 1011 moléculas
1g de DNA do bacteriófago (48502pb) = 0,03 pmol = 1,8 x 1011 moléculas
1 pmol de um fragmento de DNA com 1000pb = 0,66 g
1 pmol de plasmídeo pUC19 (2686pb) = 1,77 g
1 pmol do plasmídeo pBR322(4361pb)= 2,88 g
1pmol de DNA do bacteriófago M13mp19(fita dupla com 7249pb) = 4,78 g
1pmol de DNA do bacteriófago(48502pb) = 32,01
Gurupi/2010
UFT 21
ELETROFORESE
Gurupi/2010
UFT 22
Eletroforese em Gel
No caso dos meios em gel, as partículas se movimentam dentro dele. Antes da semi-
solidificação é preciso colocar um pente no lugar onde serão depositadas as partículas a
serem separadas, pois no lugar dos dentes do pente formam poços para o depósito das
partículas.
A eletroforese em gel pode ser feita em posição vertical ou horizontal, com um tipo de
gel ou com dois tipos de gel.
O gel é preparado como a gelatina comum, a partir da agarose ou amido ou
poliacrilamida que semi-solidificam em temperaturas mais baixas que 50ºC.
A estrutura do gel depende da sua composição e cada estrutura apresenta uma
porosidade por onde vão transitar as partículas. Alguns géis apresentam uma malha
mais estreita que outros. O que determina que as estruturas de cargas mais leves e
pesadas sejam mais bem separadas. Partículas mais pesadas indicam que os seus
tamanhos são maiores que as partículas de cargas mais leves.
Para ter um parâmetro são usados marcadores moleculares com pesos conhecidos que
migram ao lado das partículas analisadas. Eles devem ter a mesma natureza das
partículas.
O processo de eletroforese pode ser contínuo ou descontínuo. Na composição do gel é
utilizada uma solução tampão que pode ser a mesma que cobrirá o gel para fazer a
condução elétrica (sistema contínuo) ou pode ser diferente (sistema descontínuo).
Gurupi/2010
UFT 23
No sistema descontínuo há dois tipos de géis: o gel concentrador e o gel separador, que
é usado na técnica para separação de proteínas (gel de poliacrilamida).
A malha do gel de agarose é mais larga que a malha do gel de poliacrilamida, assim, o
gel de agarose permite a passagem, por exemplo, de DNAs com dezenas e até mesmo
centenas de quilobases, mas não diferem no peso de pares de bases específicos. Já o gel
de poliacrilamida pode separar um único par de bases, mas apenas em moléculas com
tamanhos de até algumas centenas de pares de bases. Por isso são usadas as enzimas de
restrição anteriormente à técnica de separação em eletroforese, pois quebram as
partículas em pedaços conhecidos.
Gel de Agarose
agarose*
Gurupi/2010
UFT 24
Para a visualização do DNA a técnica pode ser acrescentada de brometo de etídeo que é
um análogo de base que se intercala na molécula de DNA e emite fluorescência violeta
quando exposto aos raios UV. Na sua presença ocorre redução de velocidade de
migração, pois o DNA aumenta o seu tamanho e muda de forma.
A forma do DNA pode ser circular superenovelada (I), circular relaxada (II) e linear
(III). A forma I migra mais rápido que a forma III em géis comuns. A forma II é a mais
lenta de todas.
Gel de Poliacrilamida
Gurupi/2010
UFT 25
DNA
Gurupi/2010
UFT 26
G-C tem 3 pontes de H e A-T tem 2 pontes de H. Portanto DNA com muito G-C é mais
estável que DNA com muito A-T.
Há um padrão na configuração do DNA:
Adenina e Guanina são moléculas maiores ligadas ao açúcar. Timina e Citosina são
moléculas menores ligadas ao açúcar.
Cada molécula de açúcar liga-se a um fosfato que se liga a outra molécula de açúcar.
O tamanho da ligação entre açúcar –fosfato – açúcar é de 3.4 A.
O tamanho da ligação entre aprox. 10 grupos de ligações de pares de bases é de 34 A.
Isso muda para aprox. 11 pares de bases em alta concentração de sal ou desidratando o
DNA. “In vivo “ou “in vitro” essa situação pode ocorrer se houver formação de
heterodúplices como DNA-RNAc ou dúplices RNA-RNA.
O giro da fita é pela direita, mas certas seqüências giram para esquerda (zDNA- DNA
zigue-zague).
Segmentos específicos no DNA podem sofrer mudanças de sentido.
Gurupi/2010
UFT 27
Uma mesma molécula de DNA pode se apresentar sob três formas ou topoisômeros
distintos.
A forma do DNA pode ser circular superenovelada (I), circular relaxada (II) e linear
(III).
Uma bactéria como a E.coli contém aproximadamente 4 milhões de pares de bases em
seu genoma. O genoma humano é composto por aproximadamente 3 bilhões de pares de
bases. A salamandra africana contém cerca de 50 bilhões de pares de bases e o lírio tem
cerca de 250 bilhões de pares de bases.
Em procariotos a maior parte do DNA parece ser codificante, já em eucariotos, grande
parte são seqüências repetidas ao longo de todo o genoma (DNA - não codificante).
Gurupi/2010
UFT 28
Sentido 5’- 3’
O fósforo diéster liga o carbono 5’ ao carbono 3’ do outro açúcar na fita. Quem se liga à
T, G, A ou C é o açúcar, sempre pelo carbono 1’.
A ligação do fósforo diéster e o açúcar se dá no sentido 5’-3’, o que faz com que a
torção da fita fique para a direita.
Gurupi/2010
UFT 29
PROTEÍNAS
Gurupi/2010
UFT 30
RNA
O RNA é formado por nucleotídeos compostos por açúcar, fosfatos e uma das quatro
diferentes bases orgânicas.
O RNA difere química e estruturalmente do DNA.
Diferença química: no lugar do açúcar desoxirribose, o
RNA contém ribose e no lugar da Timina, o RNA contém
Uracila.
Diferença estrutural: apesar das bases do RNA também
poderem formar pares complementares, o RNA geralmente
é formado por apenas uma única fita de esqueleto açúcar-
fosfato e bases. Embora seja capaz de parear com fitas simples não forma dupla hélice.
Síntese do RNAm
Assemelha-se à replicação do DNA.
A dupla hélice de DNA é desenrolada e as bases são expostas. Nucleotídeos que estão
no meio separados se pareiam com os nucleotídeos complementares da fita. A Uracila
se pareia com a Adenina. Ligações fosfodiésteres são formadas entre os nucleotídeos e o
RNAm recém sintetizado possui uma seqüência de bases que é exatamente completar à
fita molde de DNA.
O processo de usar uma fita molde de DNA para criar uma
molécula de RNAm complementar é chamado de
transcrição.
Os RNA transportadores e ribossomais não são traduzidos
em proteínas.
Diferenças entre transcrição e replicação
Na replicação do DNA ambas as fitas são usadas como
molde para geração de duas novas fitas para duas novas
hélices.
Na transcrição, apenas uma fita simples de RNA é
produzida e a nova molécula de RNAm é liberada do molde conforme é sintetizada e a
Gurupi/2010
UFT 31
dupla hélice de DNA volta a enrolar-se à medida que “solta” a fita de RNAm
sintetizada.
Essa síntese só é possível através das RNA
polimerase.
Ação da RNA polimerase
A hélice do DNA contém milhões de pares de
bases. A RNA polimerase reconhece o início e o
término dos pares de bases que são os constituintes
de um gene, e a partir daí liga os códons complementares e para de ligá-los quando há
uma sequencia no DNA que indica o término do gene.
Essa sequencia de pares de bases no DNA que indica o começo de genes é chamada de
promotor e a que indica o término de genes é o terminador.
RNAt
O ribossomo reconhece o RNAm e o prende na posição adequada para que seus códons
sejam “lidos” corretamente. A tarefa é traduzir o código que o RNAm trás do DNA em
aminoácidos e estes serão agrupados e determinarão a proteína formada.
No RNAt há um anticódon que é o complementar do RNAm que só se liga a uma
sequencia específica de três bases. Na outra extremidade do RNAt está um aminoácido
que é ligado a esse RNAt através de uma enzima, a aminoacil sintetase. Assim o
aminoácido correto correspondente ao códon do RNAm é trazido ao ribossomo e pode
ser ligado à cadeia de aminoácidos em uma sequencia específica que determinará a
proteína. Esse processo é a tradução.
Tradução em bactérias
Gurupi/2010
UFT 32
Enzimas purificadas a partir dos organismos nos quais foram inicialmente identificadas.
A nomenclatura é feita pelas iniciais desse organismo, incluindo a sua linhagem, e por
algarismos romanos que indicam a ordem em que foi encontrada a cepa. Exemplo:
EcoR I, primeira enzima isolada de Escherichia coli, cepa R.
Para evitar a desnaturação das enzimas numa reação, a concentração de proteína nunca
deve ser inferior a 0,1 mg/mL. A fração V da albumina bovina (BSA) é uma fonte de
proteína neutra para estabilizar a enzima.
Geralmente são classificadas de acordo com os tipos de reações que elas catalisam.
Gurupi/2010
UFT 33
NUCLEASES E RIBONUCLEAES
Nucleases são responsáveis pela quebra enzimática da ligação fosfodiéster do DNA e às
vezes do RNA também e as ribonucleases são responsáveis pela quebra enzimática da
ligação fosfodiéster do RNA.
As nucleases têm atividade exonucleásicas ou endonucleásica, as ribonucleases têm
atividade endorribonucleásica.
Gurupi/2010
UFT 34
NUCLEASES
Dentre outras, estão incluídas as endonucleases de restrição ou enzimas de restrição.
Reconhecem pequenas regiões de 4 a 8 pb específicas do DNA, chamadas de sítio de
restrição, e clivam estas regiões em ambas as fitas de DNA.
Levam o termo “restrição” porque algumas enzimas específicas clivam o DNA exógeno
que o bacteriófago implanta na célula bacteriana. Para que essa enzima não clive o
próprio DNA, existem enzimas modificadoras que metilam o DNA endógeno,
modificando o sítio de restrição, impedindo ligação de enzimas clivadoras.
Há enzimas de restrição que clivam o mesmo sítio no DNA, mas que foram isoladas de
microrganismos diferentes, estas são chamadas de isosquizômeros.
As endonucleases de restrição I e III clivam o DNA fora do sítio de especificidade,
enquanto as do tipo II clivam dentro do próprio sítio.
Gurupi/2010
UFT 35
Nuclease Bal 31
Nuclease S1
São endonucleases de fita simples que atuam melhor em DNA de fita simples do que
em RNA de fita simples.
São aplicadas para análise de híbridos de DNA-RNA para identificação de íntrons, ma
identificação da seqüência terminal dos transcritos (S1 Nuclease Mapping) e na
remoção de bases salientes para produção de bases abruptas (a diferença está na forma
como as extremidades foram clivadas).
A ação dessa nuclease é interrompida com a adição de EDTA.
Desoxirribonuclease I (DNAse I)
Nuclease Microcócica
Têm atividade nucleásica não específica sobre DNA e RNA fita simples ou dupla.
São aplicadas para remoção de ácidos nucléicos de extratos celulares e para estudos em
cromatina.
Gurupi/2010
UFT 36
Exonuclease III
São específicas para DNA fita dupla com terminal 3’-OH, atuando como exonuclease
3’- 5’; removem grupos fosfatos da região 3’ terminal de DNA fita simples e DNA fita
dupla através da ação da parte 3’ fosfatase que apresenta e funciona como endonuclease
atuando assim especificamente para RNA e híbridos DNA-RNA.
São aplicadas como End-labelling de DNA fita dupla que têm extremidades abruptas;
geram subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento; fazem deleção controlada
de seqüências a partir de extremidades de DNA fita simples ( em conjunto com uma
endonuclease específica para fita simples, como a Nuclease S1) e em técnicas de
mutagênese.
RIBONUCLEASES
Ribonuclease A (RNAse A), Ribonuclease H (RNAse H), Ribonuclease T1.
São usadas para eliminar RNA, ou quando se mapeia, quantifica ou sequencia um RNA.
Para o sequenciamento de RNA é preciso usar uma combinação de RNAses que clivam
em seqüências específicas, como as RNAses T1, U2 e CL3.
Ribonuclease A (RNAse A)
Ribonuclease H (RNAse H)
Gurupi/2010
UFT 37
São aplicadas para eliminar de fita de RNAm após a síntese da primeira fita do DNAc (é
a fita de DNA sintetizada a partir de um molde de RNA – DNA complementar), para
facilitar a síntese da segunda fita de DNAc.
Ribonuclease T1
DNA POLIMERASES
Gurupi/2010
UFT 38
Os fragmentos Klenow
Algumas DNA polimerases tiram nucleotídeos da extremidade 5’ (exonuclease) ou
3’(exonuclease também). Quando ela corta a partir da extremidade 5’, pode ser
aproveitada junto com a DNAse I que corta o DNA de fita dupla para marcar a molécula
pela técnica de nick translation.
Quando a atividade de retirar nucleotídeos a partir da extremidade 5’ é indesejada, trata-
se a DNA polimerase I com uma protease que elimina a porção N- terminal da molécula
que tem atividade de retirada de nucleotídeos.
Por engenharia genética é possível obter o gene de DNA polimerase I truncada
(quebrada) na porção N-terminal. Quando o gene é transcrito, resulta uma polimerase
sem a porção N-terminal que recebe o nome de fragmento grande da DNA polimerase
de E. coli (por ser obtido através deste vetor) ou fragmento Klenow.
Quando a polimerase não se dissocia do DNA molde e adiciona nucleotídeos
continuamente a partir de um primer, diz-se que esse processo é a processividade da
polimerase. A maioria das polimerases tem baixa processividade, sendo uma das
exceções a T7 DNA polimerase que é usada para incorporar milhares de nucleotídeos
em reações de sequenciamento de DNA.
DNA Polimerase I
Gurupi/2010
UFT 39
Fragmento Klenow
Gurupi/2010
UFT 40
T4 DNA Polimerase
Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples e
iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH.
Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 3’-5’ (ação exonucleásica), degradando
ativamente o DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH.
Não age retirando nucleotídeos no sentido 5’-3’.
É aplicado em end-filling e marcação de DNA fita dupla com extremidade 5’ saliente;
na marcação de DNA fita dupla pela técnica de replacement synthesis; na geração de
subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento e em gap-filling na manutenção
sítio-dirigida.
T7 DNA Polimerase
Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples
iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH.
Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 3’-5’(ação exonucleásica) degradando o
DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH.
Não retira nucleotídeos no sentido 5’-3’.
É aplicado no sequenciamento de DNA pelo método da terminação em cadeia e na
síntese da segunda fita de DNA.
Esta enzima substitui a Polimerase Klenow quando se deseja mais rapidez e afinidade
pelo molde de DNA.
Há um aversão dessa enzima (Sequenase) que não possui a capacidade de retirada de
nucleotídeos da extremidade 3’-5’, sendo ideal pra o sequenciamento de DNA, pois é
altamente processiva.
Gurupi/2010
UFT 41
Age como DNA polimerase 5’-3’requerendo molde de RNA fita simples ou fita dupla e
um iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH.
Não possui atividade exonucleásica.
Pode agir no sentido 5’-3’ e 3’-5’ como
exorribonuclease degradando
especificamente o componente de RNA dos
híbridos DNA-RNA. Essa atividade é
denominada “atividade tipo RNAse H”
Gurupi/2010
UFT 42
Terminal Transferase
Enzima isolada de timo de novilho que catalisa a incorporação de dNTP
(ribonucleotídeo) a uma extremidade 3’-OH de DNA sem necessidade de molde. Essa
capacidade foi utilizada para tornar compatíveis as extremidades de insertos e vetores de
clonagem através da construção de extremidades homopoliméricas complementares.
RNA POLIMERASES
São as principais enzimas responsáveis pela
transcrição do DNA em RNA. Catalisam a
adição de ribonucleotídeos a uma extremidade
3’-OH sem a necessidade de um iniciador
anelado.
As RNA polimerases são divididas em três
classes: DNA - dependentes; DNA –
independentes e RNA – dependentes RNA –
dependentes(Replicases).
Gurupi/2010
UFT 43
DNA– dependentes
Podem ter origem bacteriana ou viral.
Bacteriana:
RNA polimerase DNA - dependentes
RNA polimerase de E. coli responsável pelo reconhecimento das regiões -10 e -35 do
promotor bacteriano. Têm baixa processividade “in vitro”, portanto são preferíveis as
RNA polimerases dos vírus SP6, T7 e T3.
RNA polimerases DNA – independentes
Poli (A) polimerase isolada de E. coli que não requer molde de DNA e que adiciona
resíduos de AMP a uma extremidade 3’-OH de RNA a partir de ATP.
Polinucleotídeo fosforilase foi a enzima chave para a síntese das moléculas de RNA que
permitiu a elucidação do código genético. Age como a Poli (A) polimerase, mas a partir
de precursores de NDP.
Gurupi/2010
UFT 44
Polinucleotídeo Fosforilase
Adiciona ribonucleotídeo a uma extremidade 3’-OH de um RNA aceptor.
É aplicada na síntese artificial de moléculas de RNA.
LIGASES
As ligases catalisam a formação de uma ligação fosfodiéster entre grupos justapostos 3’-
OH e 5’-PO4.
A reação ocorre entre moléculas de DNA fita dupla
com extremidades abruptas ou coesivas.
Podem ser de origem bacteriana ou viral.
A DNA ligase de E. coli de origem bacteriana usa como
fonte de energia o NADH.
A T4 DNA ligase de origem viral usa como fonte de energia o ATP, por isso são
preferenciais em clonagens moleculares para ligar extremidades abruptas.
A RNA ligase une moléculas de RNA ou DNA fita simples na presença de ATP.
Há evidências de que a T4 RNA ligase estimula a atividade da T4 DNA ligase na
ligação de extremidades abruptas.
T4 DNA Ligase
Catalisa a formação da ligação fosfodiéster entre extremidades adjacentes 3’-OH e 5’-
PO4 intramolecularmente em regiões de corte (nicks) ou entre extremidades coesivas ou
abruptas.
É aplicada entre moléculas de DNA para clonagem de fragmentos.
Gurupi/2010
UFT 45
T4 RNA Ligase
Catalisa a formação da ligação fosfodiéster entre extremidades 3’-OH e 5’-PO4 de DNA
fita simples e RNA fita simples.
È aplicada na união de moléculas de DNA fita simples ou RNA fita simples; no
aumento de eficiência da T4 DNA ligase em ligações de extremidades abruptas e na
marcação da extremidade 3’-OH de RNA.
FOSFATASES E QUINASES
Fosfatases são empregadas para desfosforilar extremidades 5’-PO4 de vetores de
clonagem para evitar o religamento dos mesmos após a adição da DNA ligase na
presença de insertos, assim aumenta o número de clones transformantes contendo
insertos clonados no vetor.
Podem agir em associação com as Quinases, pois a Polinucleotídeo Quinase transfere
um grupo fosfato terminal do ATP (y fosfato) à extremidade 5’-OH das extremidades
defosforiladas. Esse grupo terminal pode ser marcado radiotivamente.
As quinases também podem trocar o grupo 5’-PO4 do DNA para o ADP, mas essa
reação é menos eficiente que a atividade de transferência do grupo fosfato do ATP ao
5’-OH.
Fosfatases
Gurupi/2010
UFT 46
Quinases
T4 Polinucleotídeo Quinase
5’quinase: transfere y- fosfato de ATP para uma extremidade 5’-OH de DNA fita
simples, DNA fita dupla, RNA fita simples ou RNA fita dupla.
3’fosfatase: remove grupos fosfato da extremidade 3’ de DNA fita simples, DNA fita
dupla, RNA fita simples ou RNA fita dupla.
São usadas na marcação de extremidade 5’ de DNA ou RNA para sequenciamento de
DNA pela técnica de Maxam-Gilbert; no sequenciamento de RNA e na remoção de 3’-
PO4.
SOLUÇÃO TAMPÃO
Soluções capazes de manter o pH constante mesmo que pequena quantidade de ácido ou
base seja a ela adicionada.
Para a escolha do tampão:
a) escolher um sistema ác/bas conjugado com pKa (da base ou do ácido ) mais próximo
possível do pH desejado.
pKa: ponto de inflexão da curva de neutralização de um grupamento ácido ou básico.
Gurupi/2010
UFT 47
TAMPÃO DE CORRIDA
A composição e a força iônica do tampão de corrida influenciam na migração e na
qualidade do resultado de uma eletroforese. Em baixa força iônica, a migração é muito
lenta, e em extrema força iônica provoca uma alta condutividade elétrica, que gera calor
e pode levar à desnaturação das partículas analisadas.
Os tampões mais utilizados são: TAE e TBE
TAE (TRIS-ACETATO-EDTA)
Tem baixo custo, mas capacidade tamponante menor que o TBE.
Não deve ser utilizado em corridas longas nem em altas voltagens. Caso seja necessário
seu uso nesses casos, deve-se trocar o tampão no meio da corrida.
O TAE promove uma corrida cerca de 10% mais rápida quando o DNA apresenta-se
sob a forma linear ou supernoveladas.
CTAB 2%
Gurupi/2010
UFT 48
NaCl 5M
Precipitação do DNA
Neutralizante
Gurupi/2010
UFT 49
INCUBAÇÃO EM BANHO-MARIA
Hidrólise do RNA
-Mercaptoetanol 0,2%
Antioxidante: O DNA deve ser protegido da ação de compostos fenólicos, como
peroxidades e polifenoloxidades que oxidam o DNA (a contaminação por
compostos fenólicos pode ser evidenciada pela coloração do DNA marrom).
Ação: quebra parte do dissulfeto para a molécula ficar linear, eliminando a
contaminação por fenóis.
PVP (POLIVINILPIRROLIDONA)
Também antioxidante, evita a oxidação de polifenóis, eliminando a
contaminação por fenóis.
BROMETO DE ETÍDEO
É um análogo de base que se intercala na molécula de DNA e emite
fluorescência violeta quando exposto aos raios UV. Na sua presença ocorre
redução de velocidade de migração, pois o DNA aumenta o seu tamanho e muda
de forma.
Gurupi/2010
UFT 50
DPEC
Inibidor de RNA. Para extração de RNA, é comum tratar as soluções com dietil
pirocarbonato (DEPC) de forma a desnaturar RNAses. Entretanto, em certos
casos e situações, apenas a esterilização em autoclave já é suficiente para
inativar ribonucleases. Não é necessário tratar o tampão de extração. Todos os
tubos de centrífugas, cadinhos, almofariz, pipetas (plásticas ou de vidro) devem
ser autoclavadas e secadas antes do uso, ou tratados com DEPC.
Não misturar DEPC e TRIS. Caso o protocolo necessite de TRIS livre de
RNAse, usar água livre de RNAse.
PROTEÍNA K
Alguns protocolos incorporam proteases (proteinase K) para facilitar a separação
do DNA das proteínas da cromatina.
ETANOL OU ISOPROPANOL
Recuperação dos ácidos nucléicos totais por precipitação em álcool (etanol ou
isopropanol).
Gurupi/2010
UFT 51
Tampão USO:
7,0 ml tampão fosfato monobásico
12,0 ml tampão fosfato dibásico
181 ml água destilada
Por último: 12 g bissulfito
Gurupi/2010
UFT 52
PROCEDIMENTO:
Macerar em nitrogênio líquido 3g de tecido vegetal.
Transferir para tubo de polipropileno com 15 mL de tampão CTAB pré aquecido
a 65ºC.
Incubar a 65ºC e agitar a cada 10 min por 30 min suavemente.
A agitação suave emulsifica as fases formadas preservando o DNA.
Adicionar 1 volume de clorofórmio( álcool isoamílico) ou trisol e agitar o tubo
manualmente ou com agitador por 10 min.
Centrifugar por 10 min a 5000g (8000 rpm)
Transferir o sobrenadante para outro tubo.
Repetir a extração com clorofórmio ou trisol e agitar o tubo manualmente ou
com agitador por 10 min
Centrifugar por 10 min a 5000g (8000rpm)
Quanto mais repetição, mais pura a amostra, mas com menos DNA.
Opcionalmente, adicionar RNAse a uma concentração final de 100mg/ml e
incubar a 37ºC por 30 min.
Adicionar 0,6 volume de isopropanol gelado ou 2,5 volumes de etanol absoluto
gelado. Misturar suavemente por inversão do tubo.
Se o complexo DNA-CTAB formar uma rede filamentosa visível, recuperar esse
DNA com um gancho feito de pipeta de Pasteur. Caso o DNA não aparecer ou
ficar floculento, centrifugar a 10000 g (12.000 rpm) por 20 min e descartar o
sobrenadante.
Sempre que possível, evitar a centrifugação por levar a uma co-precipitação de
DNA e polissacarídeos.
Lavar o precipitado com aproximadamente 5 mL de etanol 70%. Se o
precipitado se soltar do fundo, centrifugar por 3 min a 10000g (12.000 rpm) para
“grudar” o precipitado no fundo do tubo.
Secar invertendo o tubo em papel toalha ou em câmera de fluxo laminar.
O precipitado não deve conter resíduos de isopropanol ou secar demais, por que
pode dificultar a ressuspensão do DNA.
Gurupi/2010
UFT 53
Clorofórmio
Gurupi/2010
UFT 54
O DNA de plantas será extraído de acordo com protocolo modificado de Doyle e Doyle
(l990). Esse método foi adaptado de um método proposto por Saghai-Maroof et al.
(1984). Ler considerações em Ferreira e Grattapaglia (1995) (pg 121 a 139).
Gurupi/2010
UFT 55
1. Coletar as amostras de folhas jovens e saudáveis das plantas, evitando áreas atacadas
por pragas e doenças. De modo geral devem-se lavar as folhas em água corrente,
usando, sempre que necessária água sanitária e/ou sabão. Enxaguar, e em seguida rinsar
em água destilada, e secar com papel toalha. Esse material pode ser congelado,
liofilizado, seco em estufa a aproximadamente 4oC, ou usado diretamente.
2. Utilizar cerca de 150 mg de lâminas de folha frescas ou 50 mg de folhas liofilizadas
ou secas. As amostras serão trituradas em almofariz na presença de nitrogênio líquido.
Uma possibilidade é utilizar discos foliares cortados com a tampa dos microtubos
Eppendorf de 1,5 ml. O material pode ser triturado em cadinho e transferido para o
tubo, ou diretamente no tubo usando um micro-pistilo.
3. O material será transferido para um tubo de centrífuga, e 650 1 do tampão de
extração será adicionado:
10 ml
2% CTAB 0,2 g do produto
1.4 M NaCl 2,8 ml do estoque 5 M NaCl
100 mM Tris-HCl (pH 8,0) 1 ml estoque 1 M Tris Cl pH 8,0
20 mM EDTA, pH 8,0 400 l do estoque 0,5 M EDTA, pH 8,0
1% polivinilpirrolidona MW10,000 0,1 g do produto
Gurupi/2010
UFT 56
8. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, com cuidado para não
pipetar a interfase. Caso o volume da fase superior não for superior à fase
intermediária com fragmentos de tecido, adicionar mais tampão e misturar
vigorosamente e re-centrifugue.
9. Adicionar 200 l.tubo-1 do tampão de extração sem proteinase K e -mercaptoetanol,
e adicionar 650 l de clorofórmio: álcool isoamil (24:1), misturando até formar uma
emulsão.
10. Microcentrifugar a solução por 5 minutos a 12000 rpm.
11. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, com cuidado para não
pipetar a interfase.
12. Repetir esses três passos anteriores mais uma vez.
13. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, e adicionar um
volume igual de isopropanol.
14. Centrifugar o DNA por 5 minutos a 12000 rpm.
15. Lavar o pellet com 1 ml de Etanol 70% para remover sais por duas vezes, e secar ao
ar ou sob vácuo num dessecador.
16. Ressuspender o DNA em 20 l de tampão TE contendo ribonuclease [RNAse]
(10g.ml-l). A RNAse deve ser fervida dependendo da origem comercial. Várias
preparações são contaminadas por DNAses, que são inativadas pela fervura,
enquanto que as RNAses não são (demonstrando a resistência dessas enzimas). Em
geral prepara-se estoque dissolvendo 100 mg de RNAse em 10 mM de Tris-HCl (pH
7,5) e 15 mM NaCl; aquecer em água fervente por 15 minutos e resfriar lentamente
a temperatura ambiente. Fazer alíquotas de 1 ml e armazenar a –20oC.
Gurupi/2010
UFT 57
Soluções e material
TBS
Tris-HCl 20mM; pH7.4
NaCl 150mM
Proteinase K
Tampão de extração
Tris HCl 10 mM ; pH 8.0
EDTA 0,1M
SDS 0,5%
RNAse a 20 g/mL
Dissolvida em tampão acetato de sódio 50 mM; pH 4.8 e fervida em banho-maria por
vinte minutos para eliminar qualquer DNAse contaminante. Conservar em eppendorf de
1,5 mL a -20ºC.
Fenol equilibrado
1 volume de fenol
1 volume de Tris 1M
B-Hidroxiquinolina 0,1% (p/v)
B-Meracaptoetanol 0,2% (p/v)
Gurupi/2010
UFT 58
Solução equilibrada com Tris-HCl 100mM; pH8.0; EDTA 1mM; NaCl 200mM
Etanol absoluto
TE
Tris-HCl 10mM; pH8.0
EDTA 1mM; pH 8.0
Glicose 1,47 g
Método
Gurupi/2010
UFT 59
Gurupi/2010
UFT 60
O DNA de fita simples absorve mais que o DNA de fita dupla helicoidal por que as
bases estão encontradas no interior das hélices. Essa informação permite monitorar por
espectrofotometria o momento da desnaturação da fita dupla, que é de rápida transição,
que é caracterizada por aumento da absorbância da mistura analisada (efeito
hipercrômico).
Ao contrário dos peptídeos, as bases aminadas nos ácidos nucléicos são cromóforos
fortes. As 5 bases encontradas no DNA ou RNA absorvem entre 250 e 280nm. O padrão
de absorção típico de proteínas é a 280nm. O padrão de absorção típico de DNA é a
260nm.
*Razão ótima entre A260/ A280
DNA 1,8 - 1,9
RNA 1,9 – 2,0
Quando há proteínas, esses valores são diminuídos.
Campos aromáticos (fenóis) também interferem e eles são usados na purificação de
DNA e RNA.
Espectrofotometria para avaliação de pureza, e quantificar a partir do passo 8.
Gurupi/2010
UFT 61
Se o aparelho não for de feixe duplo, zerar com o branco em cada comprimento de
onda.
7. *Avaliar a pureza: A260 /A280 >ou igual 1,8
A320< 0,1 . A260
8. Calcular a [DNA] ou [RNA] conforme a fórmula mais conveniente
*A relação entre A260nm e A280nm (DO260/DO280) fornece uma estimativa da pureza dos
ácidos nucléicos. Soluções puras de DNA e RNA possuem valores de DO 260/DO280 entre
1,8 e 2, respectivamente. Se existe contaminação com fenol ou proteínas, a relação
DO260/DO280 será muito menor, e a precisão nas quantidades de ácidos nucléicos será
baixa.
Gurupi/2010
UFT 62
2. Fazer uma solução diluída em água da amostra de DNA (1:100, 1: 500, ou até 1:
1000).
3. Zerar o instrumento com água em Abs320nm.
4. Fazer leituras de Abs230nm, AbS260nm, Abs280nm e Abs320nm
5. Estimar a concentração de DNA pela fórmula
Porque a diferença dos sintéticos: como a estrutura molecular modifica a absorção, tem
que adaptar a fórmula, pois os sintéticos de DNA só são obtidos na forma Cis e os
normais são Trans.
Gurupi/2010
UFT 63
Gurupi/2010
UFT 64
Reagentes requeridos:
Etanol
Citrato de sódio 0,1 M em 10% de etanol
Etanol 75%
NaOH 8 mM
1. PRECIPITAÇÃO DE DNA
Gurupi/2010
UFT 65
Seguindo estas duas lavagens, suspender o pellet de DNA em 75% de etanol (1,5-2 mL
de etanol 75% por 1 mL de reagente Trizol), estocar por 10-20 minutos entre 15 e 30ºC
(com agitação periódica) e centrifugar a 2.000 xg por 5 minutos entre 2 a 8ºC.
Uma lavagem adicional em solução de citrato de sódio a 0,1 M (em etanol 10%) é
requerida para grandes pellets contendo 200g de DNA ou grandes quantidades de
material que não DNA.
3. REDISSOLVENDO O DNA
Gurupi/2010
UFT 66
Pegar uma alíquota da preparação de DNA solubilizada em NaOH 8 mM, misturar com
água e a solução final medir a A260.
Calcular o teor de DNA usando o valor A260 por duplo traçado de DNA.
Uma unidade A260 equivale a 50 g de duplo traçado de DNA/mL.
Para calcular o número de células em amostras analisadas, admitir que uma porção de
DNA por 1 x 106 células humanas diplóides (e de ratos e camundongos) originais
equivalem a 7,1 g, 6,5 g e 5,8g respectivamente.
Aplicações:
Gurupi/2010
UFT 67
1. A fase fenólica e interfase podem ser estocadas entre 2 e 8ºC durante a noite.
2. Amostras suspensas em etanol 75% podem ser estocadas entre 2 e 8ºC por
meses.
3. Amostras dissolvidas em NaOH 8 mM podem ser estocadas toda a noite entre 2
e 8ºC. Para estocagem de longos períodos ajustar o pH para 7-8 e ajustar a
concentração de EDTA para 1 mM.
ISOLAMENTO DE DNA
* Baixo rendimento
Homogeneização incompleta ou lise de amostra.
Pellet de DNA final não dissolvido completamente.
* Degradação do DNA
Gurupi/2010
UFT 68
* Outras aplicações:
Primariamente usar para amplificação em PCR, ajustando o pH para 8.4.
Para digestão do DNA com restrição de endonucleases, ajustar o pH para o valor
desejado, usar 3-5 unidades de enzima por micrograma de DNA e permitir que a reação
seja feita até 3-24 horas dentro das condições ótimas da enzima em particular.
Tipicamente 80-90% do DNA é digerido.
Gel de Eletroforese
A eletroforese em gel permite o fracionamento eficiente de ácidos nucléicos, e possui
um importante papel analítico, e às vezes um papel preparativo. A matriz de separação
usada é normalmente agarose e seus derivativos. Outra possibilidade empregada é o gel
de poliacrilamida, usada normalmente para o fracionamento de moléculas de baixo peso
molecular (i.e. < 1 kilopares de base). O poder de resolução da poliacrilamida permite a
detecção de diferenças de tamanho de até um par de bases, comumente usada em géis de
sequenciarnento e microssatélites. Os géis podem ser nativos (sem tratamento) ou
desnaturantes (com a adição de uréia, formamida etc.) para evitar a formação de
estruturas secundárias, evitando a interferência na mobilidade através do gel.
Gurupi/2010
UFT 69
Os ácidos nucléicos migram com base nas diferenças de peso molecular. De modo
geral, todos ácidos nucléicos possuem aproximadamente uma densidade de carga por
base, e a conformação da molécula em geral é semelhante. Portanto, a dificuldade de
penetração no gel é proporcional ao peso molecular. A mobilidade é aproximadamente
inversamente proporcional ao logaritmo do peso molecular.
Gurupi/2010
UFT 70
Gurupi/2010
UFT 71
13. Após a corrida, transferir o gel para uma bandeja contendo brometo de etídeo em
água (10 l de uma solução 10 mg/ml de brometo de etídeo em 500 ml de água) e
agitar com cuidado por 20 minutos - BROMETO DE ETÍDEO É
CARCINOGÊNICO E MUTAGÊNICO - USE LUVAS SEMPRE QUANDO
MANIPULÁ-LO.
14. Observar sob luz ultravioleta no transiluminador. Observar a presença de rastros
indicadores de RNA; formação de banda simples de DNA; comparar a intensidade
das bandas das amostras; detectar a presença de degradação e/ou contaminação
nas amostras.
Gurupi/2010
UFT 72
Para utilizar o PCR é preciso conhecer a seqüência de uma região curta do DNA em
cada extremidade da seqüência maior que se deseja copiar. Essas seqüências curtas são
usadas para especificar os primers de oligonucleotídeos.
O método consiste em ciclos repetidos de desnaturação, anelamento e síntese de DNA.
O DNA de dupla hélice com a seqüência a ser copiada e amplificada é misturada com
excesso de molar de dois oligonucleotídeos de DNA de hélice única (os primers).
O primeiro primer é idêntico à extremidade 5’ da fita de DNA a ser copiada e o segundo
primer é idêntico à fita de DNA de sentido inverso na extremidade 3’.
Gurupi/2010
UFT 73
Início:
Desnaturação do DNA de dupla hélice em altas temperaturas e resfriamento para se
reanelar.
Gurupi/2010
UFT 74
A DNA polimerase I irá estender a extremidade 3’ de cada primer ligado para sintetizar
o complemento dos moldes de DNA de hélice única (a).
Variação do PCR
PCR-Transcriptase reversa ou RT-PCR
Usa o RNA extraído da amostra e dele se faz cópia do DNA.
O DNA é replicado como no PCR normal.
O RT-PCR é usado para análises de translocações cromossômicas.
Gurupi/2010
UFT 75
PROCEDIMENTO:
Macerar em nitrogênio líquido 3g de tecido vegetal.
Transferir para tubo de polipropileno com 15 mL de tampão CTAB pré aquecido
a 65ºC.
Incubar a 65ºC e agitar a cada 10 min por 30 min suavemente.
A agitação suave emulsifica as fases formadas preservando o RNA.
Adicionar 1 volume de trisol e agitar o tubo manualmente ou com agitador por
10 min.
Centrifugar por 10 min a 5000g (8000 rpm)
Transferir o sobrenadante para outro tubo.
Repetir a extração com trisol e agitar o tubo manualmente ou com agitador por
10 min
Centrifugar por 10 min a 5000g (8000rpm)
Quanto mais repetição, mais pura a amostra, mas com menos DNA.
Adicionar 0,6 volume de isopropanol gelado ou 2,5 volumes de etanol absoluto
gelado. Misturar suavemente por inversão do tubo.
Se o complexo RNA-CTAB formar uma rede filamentosa visível, recuperar esse
DNA com um gancho feito de pipeta de Pasteur. Caso o RNA não aparecer ou
ficar floculento, centrifugar a 10000 g (12.000 rpm) por 20 min e descartar o
sobrenadante.
Sempre que possível, evitar a centrifugação por levar a uma co-precipitação de RNA
e polissacarídeos.
Lavar o precipitado com aproximadamente 5 mL de etanol 70%. Se o
precipitado se soltar do fundo, centrifugar por 3 min a 10000g (12.000 rpm) para
“grudar” o precipitado no fundo do tubo.
Secar invertendo o tubo em papel toalha ou em câmera de fluxo laminar.
O precipitado não deve conter resíduos de isopropanol ou secar demais, por que
pode dificultar a ressuspensão do RNA.
Gurupi/2010
UFT 76
Trisol
Gurupi/2010
UFT 77
Gurupi/2010
UFT 78
Sempre usar luvas descartáveis. A pele muitas vezes contém bactérias e fungos que
podem contaminar uma preparação de RNA e ser uma fonte de RNAses.
Vidros devem ser esterilizados a 150ºC por 4 horas e plásticos devem ser embebidos em
0,5 M de NaOH por 10 min, lavado cuidadosamente com água e autoclavado.
Gurupi/2010
UFT 79
Clorofórmio
Álcool Isopropílico
Água livre de RNAse ou solução SDS 0,5% ( Para preparar água livre de RNAse,
extrair água em garrafas de vidro livre de RNAse. Adicionar DEPC 0,01% (v/v). Deixar
parado durante a noite e autoclavar. A solução de SDS pode ser preparada usando
DEPC tratado e água autoclavada).
1. HOMOGENEIZAÇÃO
a) Tecidos
Homogeneizar amostras de tecido em 1 mL de reagente Trizol por 50-100 mg de tecido
usando um vidro- Teflon ou forte homogeneização (Polytron, ou Tissumizer ou
equivalente). O volume da amostra não pode exceder 10% do volume de reagente Trizol
usada para homogeneização.
b) Células de cultivo em meios de crescimento
Lisar celular diretamente no disco de cultura adicionando 1 mL de reagente Trizol para
3,5 cm de diâmetro do disco, passando as células lisadas diretamente para uma pipeta. A
porção de reagente Trizol adicionado é baseado na área do disco de cultura (1 mL por
10 cm2) e não no número de células presentes. Uma porção insuficiente de reagente
Trizol pode resultar em contaminação do isolado de RNA com DNA.
c) Células de cultivo em suspensão
Fazer um pellet celular por centrifugação. Lise celular no Trizol por repetidas
pipetagens. Usar 1 mL do reagente por 5 – 10 x 10 6 células animais , vegetais ou
leveduras, ou por 1 x 107 células bacterianas. Lavando as células antes de adicionar
Trizol poderia ser evitado, todavia isto aumenta de possibilidade de degradação de
RNAm. Ruptura de algumas células fúngicas e bactérias podem requerer o uso de
homogeneizador.
Opcional:
Um passo do isolamento adicional pode ser preciso para amostras com alto conteúdo de
proteínas, gordura, polissacarídeos ou material extracelular tal como músculos, tecido
gorduroso, e partes tuberosas de vegetais.
Gurupi/2010
UFT 80
2. FASE DE SEPARAÇÃO
Incubar a amostra homogeneizada por 5 min entre 15 a 30ºC para permitir completa
dissociação do complexo núcleo-protéico.
Adicionar 0,2 mL de clorofórmio para 1 mL de reagente Trizol.
Tampar os tubos de amostras com segurança.
Misturar vigorosamente manualmente por 15 segundos e incubá-los entre 15 a 30ºC
entre 2 e 3 min.
Centrifugar as amostras por não mais de 12.000 xg por 15 min entre 2 e 8ºC.
Seguindo a centrifugação, a mistura isolada dentro do pouco vermelho, fase fenol-
clorofórmio, na interfase, e uma descolorida fase aquosa superior.
O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa.
O volume de fase aquosa é por volta de 60% do volume de reagente Trizol usado para
homogeneização.
3. PRECIPITAÇÃO DE RNA
Transferir a fase aquosa para um tubo novo, e salvar a fase orgânica se desejar isolar
DNA ou proteína.
Precipitar o RNA da fase aquosa por mistura com álcool isopropílico.
Usar 0,5 mL de álcool isopropílico por 1 mL de reagente Trizol usado para iniciar a
homogeneização.
Gurupi/2010
UFT 81
Incubar amostras entre 15 a 30º C por 10 min e centrifugar por não mais de 12.000 xg
por 10 min entre 2 e 8ºC. O precipitado de RNA muitas vezes invisível antes da
centrifugação forma um gel como um pellet no lado e no fundo do tubo.
4. LAVAGEM DE RNA
Remover o sobrenadante.
Lavar o pellet de RNA uma vez com 75% de etanol, adicionando o mínimo de 1 mL dos
75% de etanol por 1 mL de reagente Trizol usado para a homogeneização inicial.
Misturar a amostra em vórtex e centrifugar por não mais que 7.500 xg por 5 min entre 2
e 8ºC.
5. REDISSOLVENDO O RNA
Gurupi/2010
UFT 82
ISOLAMENTO DE RNA
Gurupi/2010
UFT 83
* Baixo rendimento
Homogeneização incompleta ou lise de amostra
Pellet de RNA final não dissolvido completamente
* Degradação de RNA
* Contaminação de DNA
Gurupi/2010
UFT 84
Amostras usadas para o isolamento continham solventes orgânicos (ex: etanol, DMSO),
fortes tampões ou solução alcalina.
Gurupi/2010
UFT 85
Álcool isopropílico
Cloreto de Guanidina 0,3 M em 95% de etanol
SDS 1%
1. PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNA
Gurupi/2010
UFT 86
2. LAVAGEM DE PROTEÍNAS
Gurupi/2010
UFT 87
ISOLAMENTO DE PROTEÍNA
* Rendimento baixo
* Degradação de proteína
Gurupi/2010
UFT 88
QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Gurupi/2010
UFT 89
Resíduos aromáticos (Tyr, Phe, Trp) absorvem em torno de 280nm, portanto, na região
ultravioleta.
A absortividade das proteínas é muito baixa.
A absortividade da proteína depende do conteúdo de resíduos aromáticos. Portanto,
cada proteína requer um cálculo individual.
Absorvidade a A280 para BSA - 0,7 (em sol. a 1 mg/mL)
IgG - 1,35 (em sol. a 1 mg/mL)
IgM - 1,2 (em sol. a 1 mg/mL)
Prot. A estafilocóccica - 0,14 (em sol. a 1 mg/mL)
Extrato proteico - 1,0 (em sol. a 1 mg/mL)
Como as ligações peptídicas absorvem a 215nm, a concentração de proteínas pode ser
monitorada nesse comprimento de onda.
A absorvidade em 215nm é quinze vezes maior que a 280 nm e não depende, contudo
de aminoácidos aromáticos.
1mg/mL de proteínas: A280 = 1 e A215 = 15.
Mas a leitura a 215nm sofre influência da interferência de nucleotídeos livres ou ácidos
nucléicos presentes na amostra.
Por isso, pode ser “descontada” essa presença possível, considerando o componente de
absorção a 260nm:
Concentração de proteína (mg/mL) = 1,55 . A280 – 0,76 . A260.
Gurupi/2010
UFT 90
Reagente de Bradford:
100 mg de Coomassie Blue G 250
Dissolver em 50 mL de etanol a 95%.
Adicionar 100 mL de ácido fosfórico (H3PO=17M)
Completar com água para volume final de 200 mL. Estável a 4º por até 6 meses.
Tampão PBS
NaCl 150 mM
NaHPO4 10mM pH 7,2
Solução padrão de: Albumina Bovina (BSA) 1mg/mL em tampão PBS
Imunoglobulina G (IgG) 1mg/mL em tampão PBS
Método:
Gurupi/2010
UFT 91
TUBOS
REAGENTES 1 2 3 4 5 6 7 8
SOL. PADRÃO
DE PROTEÍNA 0 10 20 40 80 100 - -
(L)
Reagente Bradford
(L)
900 900 900 900 900 900 900 900
Gurupi/2010
UFT 92
7. Calcular a curva padrão com papel gráfico linear. Quotar cada ponto da curva de
calibração, determinar a melhor reta e calcular a concentração protéica da
amostra.
8. Para uma maior precisão, calcular a melhor reta matematicamente por regressão
linear.
Referências bibliográficas
Gurupi/2010