TEKNIK IMUNOKIMIA

Terminologi
Antigen

Antibodi

Tapak Ikatan Antibodi (Antibody-binding site)

Determinan Antigen

Spesifisitas

Hapten Sampling
Afinitas Teknik pengambilan dan

penanganan spesimen

Metode & Teknik

Teknik Petanda Radioaktif

Teknik Petanda Enzim

Teknik Petanda Fluoresen

(petanda = label)
 TEKNIK IMUNOKIMIA
Reaksi Imunokimia
Reaksi Antigen-Antibodi
Competitive-Binding Reactions
Teknik Label Radioaktif
Radioimmunoassay [RIA]
Immunoradiometric Assay [IRMA]
Teknik Label Enzim
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay [ELISA]
Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique [EMIT]
Teknik Label Fluoresen
Substrate-Labeled Fluorescent Immunoassay [SLFIA]
Fluorescence Polarization Immunoassay [FPIA]
 Reaksi Antigen-Antibodi

Imunogen = Makromolekul yang dpt memberikan respon imun

dengan membentuk imunoglobulin (antibodi).

Antigen = Senyawa (makromolekul) yang terikat pada satu atau

lebih antibodi membentuk komplek Ag-Ab.

Antibody-binding site = Bagian molekul antibodi yang dapat

membentuk ikatan dengan antigen selama reaksi

antigen-antibodi berlangsung.

Determinan antigen = Bagian antigen yang dapat berikatan dengan

antibody-binding site

Spesifisitas reaksi antigen-antibodi = derajat pengikatan antibodi

terhadap antigen tertentu (mis. homolog antigen) tanpa

berikatan dengan molekul lain yang strukturnya sama.

 Reaksi Antigen-Antibodi

Hapten = Molekul bermassa rendah ( < 20.000 dalton, mis. obat )

yang berfungsi sebagai determinan antigen tunggal.

Afinitas = Kekuatan ikatan antara determinan antigen (atau hapten)

dengan suatu binding site dari antibodi tunggal.

Afinitas ikatan suatu antibodi dinyatakan dengan Tetapan Kesetim-

bangan (K), sebab ikatan non-kovalen antara antibodi dan antigen

bersifat reversible.

K = [Ab-Ag] / [Ab][Ag] = k / k
1 2
k
1
Ab + Ag Ab-Ag

k
2
 Competitive Binding Reactions
Prinsip : Pengikatan (spesifik) antigen terhadap antibodi adalah

proporsional terhadap konsentrasi antigen dalam larutan

baku (standard), pembanding (control), dan uji (sample).

Asumsi kondisi yang diharapkan :

1) Antigen dan antibodi homogen dan interaksi (kesetimbangan)

bersifat reversible.

2) Petanda antigen tidak mengganggu interaksi antigen-antibodi.

3) Antigen dan antibodi hanya membentuk komplek bimolekuler

(antigen dan antibodi bersifat univalen).

4) Komplek antigen-antibodi dapat dipisahkan sempurna dari

bentuk bebas antigen berpetanda.

Penyimpangan terhadap kondisi yang diharapkan tersebut tidak

mengubah sifat umum reaksi imunokimia kompetitif.

 Radioimmunoassay [RIA]

Radioimmunoassay adalah teknik imunokimia menggunakan

radioisotop untuk mendeteksi kuantitas antigen atau antibodi dalam spesimen cairan biologis; berdasarkan

pembentukan komplek Ag-Ab (endapan atau agregat tidak larut) yang dilakukan pada kondisi optimal.

RIA merupakan immunoassay heterogen yang memerlukan tahap pemisahan secara fisik bentuk bebas antigen

berpetanda dari bentuk lain antigen berpetanda yang terikat pada antibodi, dilakukan sebelum pengukuran

radioaktivitas petanda terikat.

Teknik :

• Solid-phase attachment

• Activated charcoal separation method

• Precipitation technique
 Radioimmunoassay [RIA]

Deteksi :

Radioisotop (atom atau unsur yang mengalami peningkatan jumlah

neutron dalam intinya sehingga ketidakstabilan inti akan berubah

spontan kembali ke bentuk stabil dengan memancarkan radiasi).

Radionuklida adalah inti radioisotop tidak stabil yang dapat meman-

carkan radiasi : partikel alfa, elektron positif/negatif, sinar gamma.

%B
x Logit B/Bo

x
x

Log konsentrasi antigen

Log konsentrasi antigen
 Immunoradiometric Assay [IRMA]

Immunoradiometric assay : metode untuk menentukan kadar antigen

dalam spesimen cairan biologis menggunakan antibodi yang diberi

petanda radionuklida. Kelebihan antibodi berpetanda menunjukkan

antigen yang terdapat dalam larutan berdasarkan reaksi non-kompetitif.

Teknik :

• Two-site solid-phase assay (sandwich technique)

• One-site fluid-phase assay

Aplikasi :

Protein serum, faktor koagulasi VIII, ferritin, thyroid-binding protein,

carcinoembryonic antigen (CEA), a-fetoprotein, IgE, ACP prostat,

Antigen spesifik prostat, hormon (TSH, prolaktin, hGH, hCG urin dan

hCG serum).
Enzyme immunoassay [EIA]
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Petanda enzim sebagai pengganti radioisotop untuk mengukur

pembentukan komplek antigen-antibodi, digunakan untuk kuantisasi

ligan berbobot mulekul besar (>30.000 dalton).

Petanda enzim terkonyugasi pada ligan, mis. antigen, antibodi spesifik

antigen tertentu,atau antibodi spesifik terhadap antibodi primer.

ELISA menggunakan solid phase, umumnya untuk reaksi kompetitif.

IEMA (immunoenzymetric assay) berdasarkan teknik sandwich untuk

reaksi non-kompetitif.

EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique) : metode

tanpa pemisahan dengan menggunakan petanda enzim terkonyugasi

pada hapten disertai reaksi deteksi menggunakan perubahan substrat

membentuk produk reaksi enzimatik.

 Teknik Petanda Fluoresen

SLFIA (substrate-labeled fluoresent immunoassay) : metode tanpa

pemisahan menggunakan petanda substrat fluorogen pada reaksi

enzim-substrat untuk menentukan komplek antigen-antibodi.

Banyak digunakan untuk kuantisasi TDM, hormon, IgG dan IgM serum

akibat infeksi virus.

FPIA (fluorescence polarization immunoassay) : metode tanpa

pemisahan berdasarkan reaksi kompetitif untuk menentukan hapten

berbobot molekul kecil (< 20.000 dalton). Dalam metode ini dipantau

reaksi antara hapten dan antibodi menggunakan petanda fluoresen

yang terkonyugasi pada suatu hapten.

Banyak digunakan pada pengukuran kuantitatif obat pada TDM,

drug abuse, hormon.

 Teknik Petanda DNA

Teknik hibridisasi asam nukleat digunakan pada pengukuran sampel atau spesimen kontrol yang membentuk hibrida

untai-ganda (double stranded) stabil dari DNA atau RNA untai tunggal yang terdapat dalam spesimen, yang berinteraksi

dengan untai-tunggal DNA probe komplementer (sebagai molekul petanda).

Untuk mendeteksinya DNA probe dikonyugasi dengan petanda (radioisotop, enzim, fluoresen, biotin) seperti pada

immunoassay.

DNA probe digunakan a.l. untuk deteksi cepat dan spesifik jasad

penyebab infeksi mis. bakteri atau virus, berdasarkan keunikan deret

basa DNA di dalam genom yang berbeda dari DNA inang (host).

Contoh : Mycoplasma pneumoniae, retrovirus HIV, adenovirus, cyto-megalovirus, hepatitis B, herpes simplex,

Chlamidya trachomatis.
 TEKNIK PETANDA KELAT
BERFLUORESENSI
Pembentukan kompleks lantanida (Eu, Tb) dg molekul
organik b-diketon pembawa fluoresensi.

• Rendemen kuantik mendekati batas teoritis

• Pita emisi berdekatan
• Pergeseran Stockes lebar (270 nm:Eu, 200 nm:Tb)
• Panjang gelombang eksitasi dan emisi terdpt di luar
daerah interferensi spesimen biologi
• Masa hidup fluoresensi 50-1000 mdetik (jauh lebih
lama dari fluorofor klasik.
 TEKNIK PETANDA SUBSTRAT
BERFLUORESENSI
Fluoresensi hanya muncul setelah reaksi hidrolisis
enzimatik terhadap senyawa bertanda.
Ada 3 contoh kopel reaksi enzim :
1. Umbeliferon – Esterase
2. b-galaktosil umbeliferon – b-galaktosidase
3. Flavin Adenin Dinukleotid (FAD) – Nukleotida
pirofosfatase
 TEKNIK PETANDA
LUMINISENSI KIMIA &
BIOLUMNISENSI
Terbentuk emisi sinar sebagai hasil reaksi
kimia/enzimatik terhadap substrat molekul
organik : luminol, dioksetan, turunan akridin,
imidazol.
Kelemahan : sifat hidrofob membatasi
pemakaian untuk makromolekul seperti
protein, kecuali jika hapten ber-BM kecil
akan terlarut setelah diberi petanda.