LISIS CELULAR utilizando un buffer de lisis que

Cultivo CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL utilizando

contenga algún detergente como el tritón x –
celular de un gradiente de densidad de sacarosa para que
100 (debido a que mi proteína de interés es una
monocitos todas las proteínas de la misma densidad
proteína de membrana celular y para sacarla de
incluída mi proteína de interés “TLR4” se
la bicapa de fosfolípidos habrá que solubilizarlos
coloquen en el gradiente donde igualen su
con el detergente) y además inhibidores de
densidad, así excluyéndose proteínas
proteasas.
contaminantes de otra densidad.

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD.- Una vez obtenida la fracción de

interés del gradiente de densidad, esta fracción se someterá a la
separación y purificaciión de la proteína utilizando una columna de
afinidad con perlas de sepharosa acopladas con una Anticuerpo
monoclonal comercial Anti – TLR4 (©1999-2010 Cell Signaling
Technology, Inc.), el cual al ser específico de la proteína de interés,
esta se unirá con gran afinidad y se eluirán primero todas aquellas
proteínas que no se unan a las perlas de la columna. Posteriormente
se eluirán las proteínas de interés .

Realizar una electroforesis de las proteínas eluídas y de marcadores

de pesos moleculares , Teñir con azul de Comassie y posteriormente ELECTROFORESIS DE DOBLE DIMENSIÓN.-
tranferir las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa para la fracción de interés del gradiente de densidad
realizar WB. se puede someter también a una electroforesis
2D para separar las proteínas por punto
isoeléctrico y peso molecular, e identificar la
proteína mediante análisis del gel en una base
WESTERN BLOT.- tranferir las proteínas del gel a
de datos .
una membrana de nitrocelulosa previamente
bloqueada e incubar con un Ac monoclonal anti –
TLR4, seguido de un Ac secundario acoplado a
una peroxidasa por ejemplo, y revelar con el
sustrato correspondiente de la enzima. Así
observar una banda del complejo
inmunoprecipitado correspondiente a la proteína
de interés TLR4.
 PARA DETERMINAR LA INTERACCIÓN DE
LA PROTEÍNA TLR4 CON OTRAS
LLEVAR A CABO LA PROTEÍNAS, utilizar una base de datos (DIP
CUANTIFICACIÓN DE (Database of Interacting Proteins;http://dip.doe-
LA PROTEÍNA mbi.ucla.edu) o realizar una
Del gel de la electroforesis cortar el punto OBTENIDA MEDIANTE coinmunoprecipitación, precipitando el TLR4
donde se ubica la proteína de interés y EL MÉTODO DE con un Ac específico moclonal anti – TLR4 y
digerirla con una enzima determinada para BRADFORD posteriormente separar el precipitado del
crear pequeños fragmentos de polipeptido y REALIZANDO UNA sobrenanate, realizar una elelectroforesis y
mandarla a secuanciar mediante CURVA DE un WB utilizarndo un Ac primario específicos
espectrometría de masas “MALDI TOF” e CALIBRACIÓN CON contra TLR4 y otros Ac´s contra las
identficar la proteína de interés TLR4 en base BSA. proteínas de las cuales ya se sabe
a su secuencia de a.a. interactúan con TLR4, si se observa la
interacción de estos Ac con el complejo
inmunoprecipitado entonces quiere decir que
se precipitaron junto con el TLR4 esas otras
proteínas que interactúan con este receptor.

Me interesé en los receptores TLRs ya que son cruciales en la respuesta inmune innata, puesto que reconocen moléculas
propias de microorganismos e inician la respuesta innata al activar la producción de mediadores de la inflamación. La
compleja distribución de patrones de expresión de TLRs y las diferencias en las respuestas generadas por los distintos tipos
de TLRs suponen tanto retos como oportunidades para que se desarrollen nuevas vacunas y fármacos. En la actualidad el
desarrollo de fármacos que actúan sobre los TLRs se centra en el uso de ligandos agonistas y antagonistas. Se están
estudiando numerosos usos de agonistas de TLRs, como adyuvantes en vacunas, como terapia antimicrobiana y en la
terapia de alergias y de cáncer. Algunos antagonistas de TLR4 para el tratamiento de la sepsis ya se encuentran en
avanzados ensayos clínicos. Estos antagonistas inhibirían el reconocimiento de los lipopolisacáridos bacterianos por parte de
TLR4 evitando la respuesta inflamatoria.