Introdução

A colorimetria é um método de análise baseado na medida da intensidade da

cor, com a finalidade de determinar a concentração de analitos em amostras. O
instrumento utilizado é o espectrofotometro.

O espectrofotometro permite
seleccionar o comprimento de onde, da
radiação adequada á analise de um
determinado componente; medir a
intensidade I do feixe emergente que
corresponde a um determinado feixe
incidente –lo- convertendo o sinal recebido
no detector em medida de Absorvância
para o comprimento de onda em analise e
determina a concentração de uma espécie Fig.1.Diagrama da absorção de um feixe de luz
em solução a partir de um gráfico de atravessando uma célula
variação transmitância em função da concentração de varias soluções-padrões: Lei
de Beer-Lambert.

A percentagem de transmitância – T- é
dada pela equação:

%T= (It/Io) x100 Io – luz incidente

A transmitância relaciona-se com a IT – luz transmitida
absorvância na seguinte equação: ελ – Coeficiente de extinção
molar ao comprimento de onda
A= log (/T)= - log T
λ
A Lei de Beer-Lambert pode ser traduzida c – concentração da substância
pela seguinte equação: (em moles/l)
l – distância percorrida pela luz
Aλ = ελ.c.l
através da substância
Se o coeficiente da absorção não for
conhecido, a concentração desconhecida pode ser determinada utilizando uma recta
– Recta de Calibração – a recta é construída a partir das absorvâncias, a um dado
comprimento de onda, das várias soluções-padrão que possua o analito absorvente,
que representa a relação linear entre a absorvância e a concentração.

É importante referir, que é sempre necessário verificar a linearidade da lei de

Beer-Lambert na recta de calibração, isto porque, se a concentração de situar fora
da zona de linearidade, terá que ser necessário proceder á diluição das soluções.

1
 Fig.2. Exemplo de uma recta de calibração

Nesta experiencia pretende-se calcular a quantidade de nitritos presentes no

fiambre. Os nitritos ao combinarem-se com as aminas secundárias e terciárias
presentes na carne, são consideradas precursoras na síntese de N-nitrosaminas, estas
possuem actividade teratogénica e mutagénica, sendo potenciais carcinogénicos. Daí
o excesso de consumo de nitritos é considerado um factor de risco para o homem,
podendo este vir a ter cancro. A ingestão em excesso pode provocar também a
vasodilatação, relaxamento dos músculos lisos, rubores na face, desconforto
gastrointestinal, cefaleias, cianose e vómito.

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 Material

 Balança Analítica Mettler  Placa de Aquecimento

Toledo AB204-S  Pompettes

 Espectrofotómetro  Pipeta Graduada 5ml

 Balões Volumétricos 50ml,  Proveta 100ml

200ml, 250ml  Vidro de Relogio

 Banho-maria  Funil de líquidos

 Células Descartáveis  Gobelet 200ml

 Erlenmeyer 250ml  Vareta de vidro

 Pipetas Volumétricas 1ml, 2ml,

5ml e 10ml

Fig.3. Preparação do material

Reagentes
 Amostra de fiambre
 Solução de tetraborato de sódio deca-hidratado a 5% m/v
 Solução de ferrocianeto de potássio tri-hidratado a 15% m/v
 Solução de acetato de zinco dihidratado a 30% m/v
 Reagente sulfanilamida a 0,5% m/v
 Reagente NED a 0,5% m/v
 Solução padrão de nitrito de sódio (NaNO2) a 0,2 g/l

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 Procedimento Experimental

Amostra de fiambre estudada era de carne de porco.

1º Preparação dos Reagentes

 Solução de tetraborato de sódio deca-hidratado a 5% m/v: dissolveu-se 12,5g

de Na2B4O7.10H2O em água até perfazer o volume de 250ml.
 Solução de ferrocianeto de potássio tri-hidratado a 15% m/v: dissolveu-se 37,5g
de K4Fe(CN)6.3H2O em água até perfazer o volume de 250ml.
 Solução de acetato de zinco dihidratado a 30% m/v: dissolveu-se 150g de
Zn(CH3COO)2.2H2O em 15ml de ácido acético glacial e 250ml de água e até
perfazer o volume de 500ml.
 Reagente sulfanilamida a 0,5% m/v: dissolveu-se 1,25g de C6H8N2O2S em
250ml de solução de ácido clorídrico (1+1). A solução é estável por 1 a 2 meses.
 Reagente NED a 0,5% m/v: dissolveu-se 1, 25g de dicloridrato N-(1-
Naftil)etilenodiamina (C12h16Cl2N2) em 250ml de água. Guardou-se num
frasco escuro e com refrigeração. A solução é estável por uma semana e
deverá ser desprezada quando apresentar alteração de cor.
 Solução padrão de nitrito de sódio (NaNO2) a 0,2 g/l: Pesou-se 200mg de
nitrito de sódio, previamente seco por 1 hora a 105ºC, dissolveu-se em água
até perfazer o volume de 1000ml. Esta solução padrão stock é estável por 2
semanas, se mantida a 4ºC.

Fig.4. Reagentes já prontos a usar em Hotte.

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2ºPreparação da amostra de fiambre

 Mediu-se 100ml de água ionizada, colocou-se num gobelet de 200ml e

aqueceu-se a cerca de 80ºC, numa placa de aquecimento.
 Numa outra placa, colocou-se uma outra placa de aquecimento uma
panela com água a aquecer.
 Triturou-se numa picadora 5 fatias de fiambre.
 Pesou-se 10g de fiambre na balança analítica já triturado para um
gobelet de 200ml e adicionou-se 5ml de solução de tetraborato de
sódio e misturou-se com uma vareta de vidro.
 De seguida, preparou-se um branco com todos os reagentes
adicionados á amostra, mas onde não foi adicionada a amostra.
 Acrescentou-se á amostra e ao branco 50ml de água aquecida,
medidos com uma proveta.

Fig.5. Adição de 50ml de água aquecida á amostra branco.

 Colocou-se em banho-maria os gobelets com a amostra e o branco,

durante 5 minutos. Agitou-se regularmente com o auxílio de uma
vareta de vidro.

Fig.6. Branco e Amostra em banho-maria.

 Transferiu-se o conteúdo dos gobelets para balões volumétricos de

200ml com o auxílio de um funil de líquidos e vareta de vidro.

5
 Lavou-se os gobelets com água
desionizada e transferiu-se a água das
lavagens para os balões volumétricos.
 Deixou-se arrefecer o conteúdo dos
gobelets e adicionou-se 5ml de solução
de ferrocianeto de potássio.
 Homogeneizou-se agitando por
rotação.
 Adicionou-se 5ml de acetato de zinco
aos balões volumétricos.
 Homogeneizou-se agitando por
inversão.
 Deixou-se repousar por 15min. e em
cada 3min agitava-se.
 Filtrou-se o conteúdo do balão que
continha a amostra para um erlenmeyer Fig.7. Filtração da Amostra para um balão
volumétrico.
de 250ml.
 Com uma pipeta volumétrica pipetou-se 10ml da amostra e do branco
para dois balões volumétrico de 50ml.
 Embrulhou-se ambos com papel de prata e identificou-se.
 Adicionou-se aos dois balões 5ml de reagente sulfanilamida, agitou-se
por rotação e deixou-se reagir por 5min.
 Adicionou-se em seguida, 3ml de reagente NED e agitou-se por
inversão. Perfez-se o volume final com agua desionizada e
homogeneizou-se por inversão.
 Deixou-se em repouso durante 15min até ocorrer a mudança de cor
para um tom rosa claro.
 Por fim, agitou-se bem, perfez-se o volume total com agua
desionizada e aguardou-se 15min até ocorrer o desenvolvimento da cor
para um tom arroxeado.

Fig.8. Identificação da Amostra e do Branco.

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 3º Preparação das Soluções Padrão

Solução padrão de trabalho de nitrito de sódio (NaNO2) a 8μg/mL:

 Pipetou-se 10 ml da solução padrão stock de nitrito de sódio a 0,2 g/L para

um balão volumétrico de 250 ml e perfez-se o volume com água desionizada.

 Preparou-se cinco soluções padrão de nitrito de sódio (A a E) com

diferentes concentrações.

 Para isso, identificou-se cinco balões volumétricos de 50 ml e a cada balão,

adicionou-se os volumes de reagentes que constam na tabela nº1 a seguir, na
ordem indicada.

 Após cada adição homogeneizou-se por rotação o balão. Depois de

adicionados todos os reagentes, agitou-se bem por inversão e perfez-se o
volume total com água desionizada e aguardou-se 15 minutos para observar
o desenvolvimento da cor.

Sol.
Padrão de
Solução Conc. trabalho Sulfanamida Esperar NED
Padrão (mL) 5 min.
(μg/mL) 0,8 μg/mL (mL)

(mL)

A 0.16 1 5 3

B 0.32 2 5 3

C 0.64 4 5 3

D 0.96 6 5 3

E 1.12 7 5 3
Tabela 1

4º Leitura da absorvância

 Ligou-se o espectrofotómetro 15 minutos antes de efectuar as leituras e

ajustou-se o comprimento de onda a 540 nm.
7
 Nas medições efectuadas usou-se sempre a mesma célula para a leitura
do branco e de todas as amostras.

 Ajustou-se a absorvância ao valor zero, com a solução de branco. Mediu-

se a absorvância de cada solução padrão (leu-se da menos concentrada para
a mais concentrada) e da amostra de fiambre.

 Registou-se os valores obtidos no caderno.

Fig.9 - Leitura do Branco – Espectrofotómetro.

Fig. 10 - Célula descartável

Fig. 11 - Leitura da Amostra - Espectrofotómetro

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 Registo de Resultados

Solução Abs540nm Média Abs

Padrão A

(0,16 (μg/mL) 0,183 0,183

Padrão B

(0,32 (g/mL) 0,342 0,342

Padrão C

(0,64 (μg/mL) 0,675 0,675

Padrão D

(0,96 (μg/mL) 1,663 1,663

Padrão E

(1,12 (μg/mL) ------------- ------------

0,234
Amostra de fiambre
0,232 0,232
0,231
Tabela 2 - Leitura da Absorvância e da média da Absorvância

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 Cálculos
Massa de fiambre: 10,0280g

10g de
[NaNO2] 50ml Borax
fiambre

Balão
50ml de H2O Volumétrico Filtrou-se
200ml

10ml Sol.
Erlenmeyer 250 Pipetou-se
Amostra
Diluição x5
Factor de

Balão
Volumétrico
ABS
50ml

Fig.12 - Fluxograma da concentração da solução da amostra de fiambre.

Amostra de fiambre

C1V1=C2V2  9 x 10 =0,25 x 50 ou 0,25 μg/mL x 50

Solução Padrão A

Solução Padrão B


10
 

Solução Padrão C

Curva de Calibração
1,8
1,6 y = 1,7967x - 0,2185
1,4 R² = 0,9217

1,2
Absorvância

1
0,8 ABS
0,6 Linear (ABS)
0,4
0,2
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Concentração (μg/ml)

Gráfico 1: Curva de Calibração - Absorvância vs Concentração Sol.Padrao

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 Discussão de Resultados

Durante a preparação da amostra de fiambre, após ter sido adicionada a

solução Borax, observou-se uma mudança de cor. A amostra passou a cor rosa.

Podemos observar através do Gráfico 1, que a Lei de Beer-Lambert não é

verificada, isto é, não é directamente proporcional à concentração do composto na
solução.

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 Conclusão

Foi nos possível determinar com o espectrómetro a absorvância das soluções

padrão e com os valores dados pelo aparelho, podemos construir um gráfico - Curva
de Calibração - onde foi possível definir a concentração de nitritos da nossa amostra
de fiambre.

Concluímos que o valor da nossa amostra ultrapassou em 25,897 Kg o valor

máximo permitido por lei – Decreto-Lei n.º 33/2008 de 25 de Fevereiro: Teor máximo
de resíduos (expresso em NaNO2) é de 100 kg.

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 Bibliografia
 Protocolo Experimental
 http://plato.if.usp.br/1-2004/fap0181d/Lei%20de%20Beer.htm
 http://alunos.fam.ulusiada.pt/~a31720204/Trabalhos%20Lusiada/Quimica.pdf
 http://www.dq.fct.unl.pt/cadeiras/iqv/download/IQVida_TP2_v04_set.pdf
 http://www.dqb.fc.ul.pt/cup/bioquimica_lcs/2009-2010/tp_p/Sol_Probl_3.pdf
 http://www.scribd.com/doc/34765651/Termos-e-Significados-em-analises-
espectrofotometricas-UV-Visivel

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