INDICE

Pg.

I. II.

Introduccin .............................................................................................. Antecedentes generales............................................................................

1 2

2.1. Definicin............................................................................................. ....2 2.2. Deteccin de cepas productoras de Bacteriocinas............................. 2 2.3. Espectro de accin....................................................... ..................... 3 2.4. Clasificacin................................................................... .................... 4 2.5. Mecanismo de accin......................................................................... 8 2.6. Sntesis de Bacteriocinas por Bacterias Acido Lcticas..................... 9 2.7. Produccin de Bacteriocinas ............................................................. 10 2.8.Mtodos de Adicin de Bacteriocinas en Alimentos............................ 11 2.9. Legislacin.......................................................................................... 11 2.10. Ventajas y desventajas.......................................................................... 13 III. Aplicacin de las bacteriocinas en alimentos............................................ 3.1. Productos lcteos............................................................................... 3.2. Alimentos enlatados........................................................................... 3.3. Productos crnicos............................................................................. 3.4. Productos del mar.............................................................................. 3.5. Vino y cerveza.................................................................................... 3.6. Chucrut............................................................................................... 3.7. Otras aplicaciones.............................................................................. 3.8. Mtodos combinados......................................................................... IV. V. Expectativas futuras.................................................................................. 14 14 18 19 22 23 24 24 27 29

Bibliografa................................................................................................. 30

2 I. INTRODUCCION Actualmente hay una marcada tendencia de los consumidores a demandar alimentos naturales que no hayan sido sometidos a ningn tipo de procesamiento industrial o que sean mnimamente procesados y que no contengan aditivos qumicos. Muchos consumidores consideran que esos procedimientos interfieren con la calidad nutricional de los alimentos y que los aditivos qumicos son ms peligrosos para la salud que los microorganismos que pretenden controlar (8,21). Para satisfacer las demandas de los consumidores los fabricantes de alimentos estn interesados en producir alimentos mnimamente procesados, sin aditivos qumicos o que contengan la mnima cantidad, e inocuos, para cumplir con los parmetros de calidad y seguridad exigidos por los consumidores. Una de las estrategias propuesta por los investigadores para alcanzar este objetivo, es explorar la capacidad de los microorganismos inocuos, naturalmente presentes en los alimentos o artificialmente adicionados, de inhibir microorganismos que son indeseables, alterantes y patgenos. Este proceso se denomina Bioconservacin y cada vez es ms estudiado debido a su enorme potencial de aplicacin en una amplia gama de alimentos. Los microorganismos ms adecuados como bioconservantes son las bacterias cido lcticas (BAL), debido a su uso en alimentos fermentados y a que gozan de la categora GRAS (21). Las bacterias cido lcticas (que incluyen los gneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc y Pediococcus) han sido usadas por siglos en fermentaciones para preservar la calidad nutritiva de varios alimentos. Estas bacterias contribuyen a la preservacin de los productos fermentados como consecuencia de la produccin de metabolitos inhibitorios de la flora acompaante. Estos incluyen productos finales de la fermentacin tales como cidos orgnicos, perxido de hidrgeno, y diacetilo, acetaldehido, reuterina y bacteriocinas (8,20). El trmino bacteriocina fue acuado en 1953 especficamente para definir antibiticos proteicos del tipo colicina (producido por E. coli), pero ahora es aceptado para incluir pptidos inhibidores de cualquier gnero. El rol de las bacteriocinas en la naturaleza permanece incierto. Lo que s est claro es que las bacterias productoras de estos pptidos pueden tener una ventaja competitiva al inhibir la flora acompaante no productora de bacteriocina. Las bacteriocinas pueden ser explotadas por los procesadores de alimentos para proveer una barrera adicional al crecimiento de bacterias indeseable en alimentos (20). Las bacteriocinas son producidas por varias especies bacterianas, pero de particular inters para la industria de alimentos son aqullas producidas por bacterias cido lcticas por lo ya sealado (20). El potencial de estos pptidos descansa en la adicin al alimento del microorganismo productor de bacteriocina o una preparacin de sta, como una barrera adicional en la preservacin por mtodos combinados (8,15,20). El objetivo de este seminario es entregar antecedentes de las bacteriocinas y su potencial aplicacin en los alimentos.

3 II. ANTECEDENTES GENERALES DE LAS BACTERIOCINAS 2.1 Definicin Las bacteriocinas son pptidos microbianos de reducido tamao sintetizadas ribosomalmente, codificadas por plsmidos y liberadas extracelularmente, las cuales tienen un efecto bactericida o bacteriosttico sobre otras especies (usualmente familiares) (20). Las bacteriocinas han sido encontradas en todos los linajes de bacterias y ms recientemente han sido descritas como producidas universalmente por algunos miembros de Archaea. De acuerdo con Klaenhammer cit, por (12) el 99% de todas las bacterias pueden elaborar al menor una bacteriocina y la nica razn por la que no se han aislado ms es debido a la carencia de investigaciones. 2.2. Deteccin de cepas productoras de bacteriocinas La forma ms fcil de identificar cepas productoras de bacteriocinas es a travs de la tcnica de doble capa, que consiste en inocular las bacterias potencialmente productoras de bacteriocinas en placas con el medio ms adecuado (cruz o gota), y una vez que han crecido se cubren con una sobrecapa (6-8 ml) del mismo medio con 0,8% de agar, previamente inoculado con la bacteria indicadora y se deja crecer una noche para observar halos de inhibicin de crecimiento, esta tcnica deteccin en ingls de denominada spot -on -the lawn (Fig.1)

Fig. 1: Ejemplo de zonas de inhibicin utilizando la tcnica de spot on the lawn

Fuente: BURTNESS, J., 2001: Searching for BLIS Bacteriocin-Like Inhibitory Substances

4 2.3. Espectro de Accin La mayora de las bacteriocinas son bactericidas contra bacterias relacionadas cercanamente. Sin embargo, actualmente se ha visto que la mayor parte de las bacteriocinas producidas por bacterias lcticas exhiben actividad bactericida ms all de las especies relacionadas cercanamente o confinadas dentro del mismo nicho ecolgico que la productora de bacteriocina (4). La actividad inhibitoria de estos pptidos est confinada a bacterias Gram-positivas y la inhibicin de bacterias Gram-negativas no ha sido demostrada, esto puede ser explicado por un anlisis y comparacin detallada de la composicin de la pared celular de ambos tipos de bacterias. En ambos la membrana citoplasmtica est rodeada por una capa de peptidoglicano la cual es significativamente ms gruesa en las bacterias Gram-positivas. Las bacterias Gram-negativas poseen una capa adicional, denominada membrana externa la cual es impermeable a la mayora de las molculas. La presencia de poros en esta membrana permitir la libre difusin de molculas con un peso molecular inferior a 600 Da, sin embargo, la bacteriocina ms pequea producida por bacterias cido lcticas (BAL)tienen una masa molecular de 3 kDa y son por lo tanto muy grandes para alcanzar su objetivo (1). Es interesante notar que las bacterias Gram negativas son solo inhibidas por purificados de bacteriocinas de bacterias lcticas provistos de condiciones que debilitan la integridad de la pared celular, como la presencia de agentes qumicos (Ej. cidos orgnicos, EDTA y otros quelantes o condiciones medioambientales estresantes (Ej. pH, congelacin, calentamiento suave o alta presiones hidrostticas) permitiendo que la bacteriocina acceda a la membrana citoplasmtica (1,4,5,20). En general se puede decir que las bacteriocinas producidas por las bacterias Gram (+) tienen un espectro de accin ms amplio que las producidas por las bacterias Gram (-) y son a menudo activas contra un amplio rango de bacterias Gram (+) y algunas veces contra unas pocas bacterias Gram-negativas (18). La hetereogenidad en el espectro antimicrobiano de las bacteriocinas permite establecer tres grupos1 (4): Bacteriocinas con un estrecho espectro de accin: Restringido a cepas dentro de la misma especie productora de bacteriocina, tales como lactococina A (Holo et al., 1991) y caseicina 80 (Rammelsberg et la., 1990), o a especies dentro del mismo gnero, tales como lactocina 27 (Upreti,1994) y lactacina B (Barefoot y Klaenhammer, 1983) Bacteriocinas con espectro de actividad intermedio : Adems inhiben otros gneros de bacterias lcticas y bacterias Gram (+), incluyendo los patgenos L. monocytogenes, S.aureus, C. perfringens y C. botulinum . Este grupo incluye, entre otras, lactacina F (Muriana y Klaenhammer,1987), lacticina 481 (Piard et.al., 1990), plantaricina C (Gonzlez et.al, 1994) y plantaricina S y T (Jimnez - Daz et.al ., 1993)

Las citas mencionadas a continuacin provienen del J. Food Sci Tech Int 2001; 7(4):281-305

5 Bacteriocinas de amplio espectro antimicrobiano: Inhibe un amplio rango de bacterias Gram (+) incluyendo adems de los gneros mencionados arriba, Propionibacterium spp. Y Bacillus spp. Representativos de este grupo son la Nisina A y Z, las cuales tambin inhiben la germinacin de esporas de Clostridium spp. y Bacillus spp. ( Hurst, 1981; Harris et.al., 1992; Vanerbergh,1993; Cintas 1995; Cintas et.al., 1992), leucocina S (Lewus et.al., 1991) y enterococina L50 (Cintas et.al., 1995; 1998).

2.4. Clasificacin A pesar de la hetereogenidad fisicoqumica de las bacteriocinas de las bacterias lcticas, stas pueden ser dividas en cuatro clases (L.M.Cintas, 2001; 2 Klaenhammer, 1993 ) .En la tabla siguiente se muestra la clasificacin de las bacteriocinas, sus caractersticas generales y ejemplos respectivos (4, 20, 21). Tabla 1: Clasificacin de las bacteriocinas
Clase Clase I: Lantibiticos Subclase Caractersticas generales Ejemplos Pptidos de pequeo tamao molecular (< 5kDa), resistentes al calor,modificadas postransduccionalmente que contienen aminocidos no usuales tales como dehidroalanina, dehidrobutirina, lantionina y b.metillantionina. Subclase Ia Pptidos catinicos e hidrofbicos que forman Nisina, lactacina poros en membrana objetivo, molculas ms 481, carnocina UI49 flexibles en comparacin a Ib. y lactocina S Subclase Ib Pptidos globulares que no tienen carga neta o Mersacidina carga neta negativa Pequeos pptidos <10kDa, termoestables que no contienen lantionina, no modificados transducionalmente, hidrofbicos, con un alto contenido de aminocidos pequeos tales como glicina, usualmente catinicos y a menudo anfteras. Dentro de esta clase pueden ser definida 3 subclases. Subclase IIa Pptidos activos contra Listeria con una Pediocina PA-1, Bacteriocinas secuencia N-terminal comn. sakacinas A y P, como leucocina A, Pediocina bavaricina MN y curvacina A Subclase IIb Pptidos formadores de poros en membrana Lactococina G y M, celular, constituidos de 2 subunidades lactacina F importantes para la actividad Subclase IIc Pptidos activados por el grupo tiol, que Lactacina B requieren residuos de cistena reducida para tornarse activos. Pptidos de gran tamao molecular (>30 kDa), Helveticina V-1829, termolbiles acidofilina y lactacina A y B. Bacteriocinas complejas, compuestas por una Plantaricina S, fraccin proteica y una fraccin lipdica u Leuconocina, S, glucdica. lactocina 27 y pediocina SJ1.

Clase II:

Clase III Clase IV

E.De Martinis et.al, 2002 op.cit.

6 Debido a su abundancia y posibles aplicaciones en la industria de alimentos, las bacteriocinas pertenecientes a las dos primeras clases son las ms estudiadas. A continuacin se entregar un mayor detalle de estas dos clases (8). Clase I: Lantibiticos Los lantibiticos son producidos por BAL y tambin por otros gneros de bacterias. El principal lantibitico producido por BAL y mejor conocido a la fecha, es la nisina, la cual se tratar a continuacin con mayor detalle (8). La nisina es una protena que consiste de 34 aminocidos, la cual es estable a altas temperatura. La nisina es rpidamente inactivada en el intestino por enzimas digestivas y no es detectable en la saliva humana despus de 10 minutos del consumo . Es producida por ciertas cepas de Lactococcus lactis subesp. lactis, inhibe un amplio rango de bacteria Gram (+) incluyendo cepas o especies de estreptococos, estafilococos, lactobacilos, micrococos, Listeria y la mayora de las especies formadoras de esporas de Clostridium y Bacillus. Las bacterias Gramnegativas, levaduras y mohos normalmente no son afectados. La nisina es un lantibitico (tabla I), tiene un efecto bactericida sobre clulas sensibles, efectuando una rpida muerte dentro de un minuto de adicin. El objetivo de la nisina y molculas relacionadas ha mostrado ser la membrana citoplasmtica de clulas sensibles. La adsorcin no parece involucrar receptores especficos proteicos (como es el caso de colicinas), pero involucra la interaccin directa entre la molcula de nisina y la membrana. La accin de la nisina se debe a la insercin y formacin de poros (8, 20). La nisina fue originalmente propuesta para uso como antibitico, pero debido a su rango de inhibicin limitado, fue juzgado como no apropiada para uso teraputico. Sin embargo, la nisina es completamente degradada en el tracto digestivo y por lo tanto puede ser usada con seguridad como aditivo en alimentos. Su uso potencial como preservante en alimentos fue demostrado por primer vez en la manufactura de un queso tipo-suizo utilizando un cultivo productor de nisina (15). La forma de nisina ms comnmente utilizada por procesadores de alimentos es manufacturada por Aplin&Berret en Dorset, Inglaterra, y es comercializada bajo la marca Nisaplin, la cual tiene una alta y consistente actividad. Las propiedades fisicoqumicas de la nisina hacen que la estabilidad, solubilidad y actividad sean mayores a bajo pH. Varios estudios han demostrado que debido a la naturaleza catinica de la nisina, su actividad in vitro es mayor en la presencia de un alto porcentaje de lpidos de membrana cargados negativamente. La nisina es principalmente usada para prevenir la germinacin de esporas principalmente de Bacillus y Clostridium en una amplia variedad de alimentos (la aplicacin de la nisina y otras bacteriocinas ser tratada en la seccin III ). Algunas especies formadoras de esporas son ms sensibles que otras, por ejemplo B. stearothermophilus es ms sensible que B. cereus, B. megaterium o B. polymyxa. Adems la nisina es efectiva en prevenir la germinacin de esporas de Clostridium botulinum tipo A, B y E, pero los tipos proteolticos son ms resistentes que los no proteolticos. La sensibilidad incrementa mientras menor es el pH, mayor la temperatura, mayor el tiempo de

7 shock trmico y menor es la carga de esporas. La nisina es esporicida mas que esporasttico (20). Clase II: Bacteriocinas pequeas estables al calor La lactococina A, es quizs la mejor estudiada de las bacteriocinas clase II. Es producida por cepas de Lactoccus lactis, que adems pueden producir lactococina B y M. La lactococina A madura es un pptido hidrofbico de 54 aminocidos, bactericida contra otras cepas de lactococos. El modo de accin es similar al de la nisina, actuando sobre la membrana citoplasmticas de las clulas sensibles. La molcula ms probablemente interacta con un receptor de membrana especfico y se agrega para formar poros. A diferencia de la nisina, la lactococina es independiente del voltaje al otro lado de la membrana objetivo. Otro grupo de inhibidores pequeos estables al calor son las bacteriocinas como pediocina. Esta clase de bacteriocina comparte un nmero de propiedades con la pediocina PA-1 y pediocina AcH. Una de las caractersticas de este grupo es su alto grado de actividad contra la Listeria monocytogenes. Todos los pptidos son lineales (36-44 aminocidos) , y comparten una regin especfica de aminocidos N-terminal en la bacteriocina madura . Se ha demostrado que cuatro residuos de cistena en pediocina PA-1 , forman dos puentes disulfuro, dando a la molcula un grado de estructura secundaria. Cuando esos puentes se rompen , toda la actividad se pierde. Slo dos de los cuatro residuos de cistena de pediocina PA-1, se conservan en las otras bacteriocinas como pediocina, y al menos en la sakacina A y P, se cree que la formacin de puentes disulfuro no estaran involucrados. En recientes estudios se ha confirmado que la pediocina PA-1 tambin forma poros en la membrana citoplasmtica de cepas sensibles. Este dato sugiere que su actividad es voltajeindependiente, y depende de un receptor de membrana especfico, aunque no identificado (8). Las pediocinas son bacteriocinas producidas por bacterias cido lcticas (BAL) del gnero Pediococcus. El primer reporte sobre la produccin de pediocina data de 1975, cuando se encontr que P. pentosaceus inhiba el crecimiento y la produccin de cido de L. plantarum, y competidores indeseables en pepino fermentado en una mezcla de salmuera. El agente activo, denominado como pediocina A, inhiba un amplio rango de BAL como tambin varios clostridios, S.aureus, y B.cereus. Se han estudiado varias aplicaciones de la pediocina con respecto a la seguridad de los alimentos. En una seccin posterior se vern algunas de sus aplicaciones (15). Las sakacinas, son un grupo de bacteriocinas producidas por Lactobacillus sake, su descubrimiento se debi a la bsqueda intensiva por componentes antimicrobianos naturales capaces de incrementar la vida til de carnes crudas por inhibicin del crecimiento de los microorganismos de deterioro y el control de L. monocytogenes. Varios antimicrobianos diferentes son producidos por cepas de L.sake, las cuales residen normalmente e los productos crnicos. Esas cepas estn bien adaptadas a las condiciones en carnes y son los mejores competidores en este tipo de alimento (8).

8 En la tabla 2, se muestra una lista de bacteriocinas caracterizadas a la fecha (1999) pertenecientes a las clases I y II. Tabla 2: Bacteriocinas caracterizadas a la fecha (1999) provenientes de bacterias lcticas de las clases I y II.
BACTERIOCINA Clase I: Lantibiticos Nisina (A y Z) Lacticina 481 Lactocina S PRODUCTOR ESPECTRO DE TAMAO INHIBICION Amplio Amplio Amplio 34 27 37 35-37 25 FUENTE

Carnocina U149 Amplio Variacina Amplio Clase II: No lantibiticos, pequeos, estables al calor Lactococina A Lactococcus lactis Estrecho Lactococina A Lactococcus lactis Estrecho Lactococina M Lactococcus lactis Estrecho Lactacina F Lactococcus johnsonii Estrecho Leuconostoc Mesenterocina 52 B mesenteroides Estrecho Curvaticina FS47 Lactobacillus curvatus Medio bacteriocinas como Pediocina Sakacina A Lactobacillus sake Medio Sakacina p Lactobacillus sake Medio Carnobacterium Carnobacteriocina A, B piscicola Medio Pediocina ACPA-1 Pediococcus acidolactis Medio Leucocina A-UAL-187 Leuconostoc gelidum Medio Enterocina 1146/A

Lactococcus lactis Lactococcus lactis Lactococcus sake Carnobacterium piscicola Micrococcus varians

Leche Salsa fermentada Pescado Carne fermentada

54 47 48 57,48 32 31 41 41 53,46 44 37

Queso Queso Queso

Leche cruda Carne molida Carne Salsa fermentada Carne Carne Carne Carne y fermentada Jamn Leche de cabra

leche

Enterococcus faecium Medio 47 Carnobacterium Piscicolina 126 pisccola Medio 44 Leuconostoc Mesenterocina Y105 mesenteroides Medio 27 Fuente: http://www.foodscience.cornell.edu/fs406/BACTERIOCINS.doc

9 2.5. Mecanismo de Accin Las bacteriocinas pueden poseer un modo de accin bactericida o bacteriosttico sobre clulas sensibles, esta distincin depende fuertemente de varios factores, tales como dosis y grado de purificacin de bacteriocina, estado fisiolgico de las clulas objetivo (Ej. Fase de crecimiento) y condiciones experimentales (Ej. Temperatura, pH, presencia de agentes desestabilizadores de la integridad de la pared celular y otros componentes antimicrobianos, etc.). La mayora de las bacteriocinas ejercen un modo de accin bactericida contra los microorganismos sensibles, aunque la lactocina 27, leucocina A-UAL 87 y leucocina S se ha visto que ejercen una accin bacteriosttica. La actividad bactericida de bacteriocinas puede estar acompaada por lisis de clulas sensibles ( bacteriocinas bacteriolticas), como es el caso de nisina A, plantaricina C y enterococina EFS2. Las bacteriocinas que no provocan lisis bacteriana son las ms abundantes en la naturaleza (4). Las bacteriocinas ejercen su modo de accin bactericida por desestabilizacin y permeabilizacin de la membrana citoplasmtica (Fig. 2). El mecanismo de accin primario de las bacteriocinas consiste en la formacin de complejos poros transitorios o canales inicos en la membrana citoplasmtica de clulas sensibles. El contacto primario establecido entre bacteriocinas y clulas sensibles toma lugar a travs de interacciones no especficas con polmeros aninicos superficiales (cidos teico y cido lipoteico) usualmente constituyentes de la pared celular de bacterias Gram positivas. Varios autores han postulado que luego de las interacciones no especficas, los no lantibiticos requieren de la presencia de receptores especficos en la membrana citoplasmtica, sin embargo con respecto a este punto hay controversia. La composicin y distribucin de los fosfolpidos de la membrana (Ej. Composicin de las cabezas polares y cadenas hidrocarbonadas) influencian significativamente la eficacia de la asociacin de las bacteriocinas con la membrana citoplasmtica, su insercin y la subsiguiente formacin de poros (4). La formacin de poros y la consecuente prdida de la integridad de la membrana provoca una difusin pasiva hacia el exterior de molculas pequeas, tales como iones (Ej. potasio y fosfato), aminocido y ATP, a travs de la bicapa lipdica, lo cual resulta en la reduccin o disipacin de la fuerza motriz de protones, o al menos de uno de sus componentes ( potencial de membrana, pH gradiente pH). Los bajos niveles de ATP intracelular y la ausencia de iones y cofactores resultan en la inhibicin de la sntesis de macromolculas tales como DNA, RNA, protenas y polisacridos, lo cual junto con la imposibilidad de mantener el transporte activo de nutrientes conduce a la detencin del crecimiento microbiano y a la subsiguiente muerte celular. Con respecto al modo de accin secundario, luego de la despolarizacin de la membrana por formacin de poros habra in ingreso de agua osmoinducido a travs de los poros, lo cual conducira a un incremento en la presin osmtica que fomentara subsecuentemente la lisis celular por shock osmtico.

10 Estudios sugieren que para que la nisina forme poros, requiere que la clula objetivo tenga un ( interior negativo) y un pH (interior alcalino) (Okereke y Monteville, 1992)3. Existe debate con respecto al tipo de poros formados por la nisina, pero la mayora coincide con los modelos barrel stave o wedge like (Fig.3).. En el modelo barrelstave , cada molcula de nisina se orienta as misma perpendicular a la membrana, formando un canal inico que atraviesa la membrana (Ojcius y Young, 1991) 3. En el modelo wedge like, despus de un nmero crtico de molculas de nisina asociadas con la membrana, ellas se insertan concurrentemente, formando una cua (5) En un estudio realizado por R.O.Benecht y colaboradores, 2002, sugieren distintos modos de accin para la nisina Z, que puede ser especfico para el gnero y/o especie y puede incluir objetivos intracelulares nisina- especficos, esto demostrara las diferencias en la susceptibilidad y respuesta a la nisina Z en diferentes grupos bacterianos testeados, entre ellos la L. innocua (1).

Fig. 3: Interaccin de monmeros de bacteriocina (forma oval) con la membrana citoplasmtica a) mecanismo de formacin de poros b) modelo de accin detergente. (Montville et.al., 1995) Fuente: http://www.biotecnologia.com.br/bio29/alimentos.html

Fig. 4: Modelos de formacin de poros a) wedge- like b) barrel-stave (adaptado de Moil et.al., 1999) Fuente: http://www.biotecnologia.com.br/bio29/alimentos .html

2.6. Sntesis de bacteriocinas por BAL Los genes para la produccin de bacteriocinas activa estn usualmente en agrupaciones de opern. Los opern que contienen los genes para la produccin de lantibiticos estn bien estudiados. Los genes que codifican la produccin de bacteriocinas pueden estar localizados en el cromosoma o en un plsmido o transposon. Tpicamente los microorganismos poseen genes que codifican la estructura del pptido (Rauch y de Vos, 1992) 4, protena que ayudan en la sntesis
3 3

J.Cleveland and et al. , 2001 Cleveland, J et al., 2001

11 de la forma activa del pptido(Engelke et al., 1992) 4, protenas que ayudan en el transporte de la bacteriocina para que sta cruce la membrana(Klein et al., 1992) 4, protenas regulatorias (Klein et al., 1993) 4 y protenas que confieren inmunidad al microorganismo productor de bacteriocina ( Diet et al., 1996; . Engelke et al., 1994:; Klein y Entian, 1994; Qiao et al., 1996)4. Debido a que las bacteriocinas son codificadas por un gen estructural, los sitios activos y la relacin funcin- estructura, pueden ser examinadas por manipulacin gentica. Tcnicas moleculares permiten producir bacteriocinas anlogas con actividad incrementada y con especificidad alteradas. Adems estas tcnicas permiten traspasar los genes que codifican las bacteriocinas y le otorgan inmunidad a la bacteria productora de bacteriocina a otra cepa no productora de bacteriocina por un proceso conocido como conjugacin (5) 2.7. Produccin de Bacteriocinas Se deben desarrollar procesos rentables econmicamente en la produccin de bacteriocinas. Para lo cual es necesario optimizar la produccin y aumentar la estabilidad y actividad de las bacteriocinas. Adems, si se aumenta la capacidad de produccin de bacteriocinas in situ y la estabilidad de stas en los cultivos starter productores de bacteriocina adicionados a los alimentos, se mejorar la eficaciaen la prevencin del crecimiento de microorganismos alteradores y patgenos. Las fermentaciones debieran estar basadas sobre sustratos baratos, y estrategias de procesamiento apropiadas y de bajo costo a lo largo de la cadena productiva, para producir bacteriocinas tanto para uso directo como biopreservante de alimentos, como en biomasa para ser utilizada como cultivo starter para la produccin de la bacteriocina in situ. La mayora de las bacteriocinas son producidas durante la fase de crecimiento logartmico pero a menudo hay una disminucin pronunciada en la actividad al final de la fase logartmica debido a la degradacin proteica, adsorcin a la superficie celular, agregacin proteica, formacin de complejos, etc. Cantidades mximas de bacteriocinas pueden ser cosechadas recolectando stas en el pick de la actividad o usando condiciones que minimizan la adsorcin, por ejemplo bajando el pH. Las bacteriocinas pueden ser removidas de la fermentacin ya sea en forma continua utilizando adsorbentes o por batch. La produccin de bacteriocinas parece ser estimulada por factores de stress tales como la baja temperatura y competencia de microorganismos. Mientras ms baja es la tasa de crecimiento especfico de las BAL la produccin de acidez probablemente ser menor y la competencia ser menos exitosa necesitando de otros factores para competir como la produccin de bacteriocinas. Un protocolo ideal para la produccin de bacteriocina es aquel aplicable para la purificacin de bacteriocina a gran escala, teniendo bajos costos de produccin y bajos niveles de recuperacin, que resulten en una produccin superior a 50% y pureza mayor a 90% (20). 2.8. Mtodos de adicin de Bacteriocinas en alimentos
4 4

12 Las bacteriocinas se pueden aplicar por cuatro mtodos (10,20): Aplicacin de un cultivo puro de BAL viables productor de bacteriocinas. El xito de esta aplicacin depende de la habilidad de la BAL de crecer y producir la bacteriocina en la dosis requerida en el sistema alimenticio, bajo las condiciones extrnsecas e intrnsecas reinantes (Ej. temperatura, pH, etc.) Aplicar una preparacin semi-purificada de la bacteriocina. En este caso la dosis de bacteriocina puede ser ms precisa y por lo tanto su efecto es ms predecible. Sin embargo, las preparaciones semi-purificadas estn limitadas por las regulaciones nacionales respecto al uso de aditivos alimenticios. Preparacin cruda de bacteriocina, la cual es obtenida por crecimiento de la BAL productora de bacteriocina sobre un sustrato complejo natural (Ej. leche). Este mtodo evita el uso de un componente purificado y por otro lado permite el uso de una preparacin de actividad conocida y constante. Este mtodo es ahora empleado para produccin a escala industrial de nisina. Adicin de bacteriocina en pelculas plsticas para envasado (biofilms) lo cual permite una lenta liberacin o incorporacin al alimento de la bacteriocina.

2.9. Legislacin La legislacin existente en la mayora de los pases no favorece el uso de componentes naturales purificados obtenido desde fuentes naturales, a menos que esos componentes tengan la categora GRAS. Actualmente la nisina es la nica bacteriocina explotada comercialmente a gran escala, aprobada en 1988 por la FDA en USA , aunque sta ya se estaba usando en Europa ( La OMS aprob el uso de nisina en 1961) (T. OKeeffe y C.Hill, 1999), y permitida en al menos 50 pases para la inhibicin de clostridios en quesos y alimentos enlatados. Ninguna de las otras bacteriocinas conocidas a la fecha tienen un estatus legal aprobado completamente como aditivo de alimentos, aunque la aplicacin de una cepa productora de pediocina ( P.acidolacti) ha sido aprobado por la USDA para uso en tocino reducido en nitrito en la prevencin de produccin de toxina por germinacin de esporas de C. botulinum (15) . El uso de un cultivo starter productor de bacteriocina como ingrediente puede no requerir consideracin especial en los EE.UU. si el microorganismo es reconocido generalmente como seguro (GRAS) . Si un purificado de bacteriocina es usado como preservante, la sustancia debiera ser justificada como GRAS por la propia compaa de acuerdo al Cdigo de Regulacin Federal , pero la FDA se reserva el derecho de requerir justificacin de la aseveracin. Con la formacin de la Unin Europea, a los aditivos de alimentos se le ha asignado la letra E. La nisina est en la lista E234, y pueden tambin ser etiquetados como preservante nisina o preservante natural.

13 La USDA publica guas para estimar la seguridad de nuevos preservantes. Para aprobar que la bacteriocina sea aprobada como aditivo de alimentos, sta debe ser identificada qumicamente y caracterizada, y su uso y eficacia deben ser demostrado. El proceso de manufactura debe ser descrito y se deben entregar los mtodos usados para la cuantificacin y estandarizacin del pptido. Datos toxicolgicos y el destino de la molcula despus de la ingestin tambin deben ser presentados (5). En la tabla siguiente se muestran los mximos niveles de nisina en diferentes pases y los alimentos en que est permitido su uso. Tabla 3: Ejemplos de usos de nisina en diferentes pases.
Pas Argentina Australia Chile Estados Unidos Francia Gran Bretaa Mxico Rusia Unin Europea Alimento en el cual la nisina es permitida Quesos procesados Quesos, quesos procesados, conservas de tomates Queso Quesos untables procesados pasteurizados Queso procesado Queso, conservas y crema Nisina es permitida como aditivo Quesos procesados dietticos y conservas de hortalizas E234, puede tambin ser etiquetado como preservante natural Nivel mximo (UI/g) 500 Sin lmite 12.5 (mg/kg) 10.000 Sin lmite Sin lmite 500 8.000 Varios de acuerdo al producto y al estado miembro

Fuente: J. Cleveland et al., 2001.

14 2.10.- Ventajas y Desventajas de las Bacteriocinas

VENTAJAS Pueden reemplazar o permitir el uso de niveles ms bajos de i) preservantes qumicos que pueden ser considerados como no naturales, ii) antimicrobianos derivados de plantas tales como los aceites esenciales que se encuentran en el ajo que puede introducir fuertes sabores al alimentos y iii) antibiticos administrados en animales para la prevencin y/o tratamiento enfermedades. Preservantes naturales producidos principalmente por BAL, las cuales tienen una categora GRAS. No txicas. No se han reportado efectos txicos de las bacteriocinas. Estudios de toxicidad para nisina fueron llevados a cabo utilizando cantidades muy superiores a las que debieran ser usadas en alimentos, sin encontrar efectos txicos. Constituyentes normales de la dieta normal del hombre y animales, donde los productos crnicos y lcteos son especialmente ricos en BAL bacteriocignicas. DESVENTAJAS Un inconveniente en el uso de bacteriocinas es que estas son molculas hidrofbicas y por lo tanto pueden separar la fase grasa del alimento limitando su uso en alimentos . Sin embargo mientras la mayora de las bacteriocinas son ciertamente muy hidrofbicas, ellas son molculas relativamente pequeas y por lo tanto pueden rpidamente difundir hacia la fase acuosa del alimento. A menudo se observa la unin a la superficie del alimento y pobre actividad cuando cepas productoras de bacteriocinas son adicionadas al alimento. Dependiendo de la matriz alimenticia las bacteriocinas pueden tener otros inconvenientes como pobre solubilidad, distribucin no homognea de las molculas de bacteriocinas, sensibilidad a las enzimas del alimento, y el impacto negativo de altas concentraciones de sales u otros ingredientes adicionados que afectan la actividad o la produccin de la bacteriocina. La aparicin espontnea de cepas objetivo mutantes resistentes a la bacteriocina. Mutantes resistentes a la nisina de L.monocytgenes aparecen con una frecuencia de 10-6 a 10-8 . Sin embargo en alimentos pobremente procesados tales niveles elevados no debieran ser encontrados. La renuencia de la industria a incorporar nuevas metodologas, particularmente si ellas implican llevar a cabo costosos y sustanciales programas toxicolgicos que pueden ser necesarios para la introduccin de un nuevo antimicrobiano como un aditivo purificado.

Posibilidad de transpasar los genes productores de bacteriocina y de la inmunidad a cepas starter no productoras para la produccin in situ de la bacteriocina, lo cual es posible debido a que las bacteriocinas mejor conocidas estn bien caracterizadas genticamente. Inactivadas por proteasas de origen gstrico o pancretico durante el paso a travs del tracto gastrointestinal. Por lo tanto no deberan alterar la ecologa del tracto digestivo o resultar en riesgos relacionados con el uso de antibiticos comunes. Buena estabilidad trmica de la mayora de la bacteriocinas pudiendo permanecer activas despus del proceso trmico de los alimentos. Estabilidad de algunas bacteriocinas a las bajas temperaturas y a pH bajo, pudienso ser til en alimentos cidos y/o productos mantenidos o procesados a temperaturas bajas. Efectividad de las bacteriocinas en una amplia gama de alimentos, incluyendo quesos con alto contenido graso y carnes. Multipropsito. Las bacteriocinas pueden ser adicionadas a los alimentos para mejorar la calidad de stos, alargar su vida til y/o asegurar la inocuidad de stos. Fuente: http://www.foodscience.cornell.edu/fs406/BACTERIOCINS.doc HILL, C., 1999; SMID AND GORRIS, 1999.

15 III. APLICACIN DE BACTERIOCINAS EN ALIMENTOS 3.1. Productos Lcteos En quesos fermentados es difcil asegurar una distribucin pareja de un inhibidor a menos que este sea adicionado mientras la leche est an liquida. Uno de los problemas que se presentan al usar bacteriocinas de amplio espectro tales como nisina en productos fermentados es que los microorganismos starter probablemente sern inhibidos al igual que los microorganismos de deterioro y patgenos. Este problema puede ser remediado utilizando cultivos starter resistentes a la nisina, si la nisina es adicionada como un preservante exgeno, o usando starter como bacterias productoras de nisina con inmunidad innata (8). La nisina es usada en quesos procesados, pasteurizados para prevenir la germinacin de esporas tales como la del Clostridium tyrobutyricum que puede sobrevivir a tratamientos trmicos tan altos como (85-105C). Uno de los efectos ms impresionantes es la prevencin del gas tardo debido a la germinacin de esporas de clostridios. Esto ha sido reportado como un problema particular en quesos Suizo y quesos semi-duro Dutch, principalmente debido a la esporulacin de C. butyricum y C. tyrobutyricum (8). El uso de nisina permite adems que esos productos puedan ser formulados con altos niveles de humedad y bajos contenidos de NaCl y fosfato, y tambin permite el almacenamiento a cabinas sin refrigeracin sin riesgo de deterioro. El nivel de nisina usado depende de la composicin del alimento, probablemente de la carga de esporas, vida til requerida y la temperatura de almacenamiento (20). EL queso Cheddar reducido en grasa manufacturado con un productor de lacticina 3147 puede ser madurado a temperaturas elevadas debido a que la vasta mayora de bacterias cido lcticas no-starter causantes de deterioro son inhibidas por lacticina 3147, lo cual puede ser difcil de alcanzar con cultivos starter tradicionales debido al deterioro por poblaciones microbianas no-starter (22) Una cepa productora de lacticina 3147 fue usada como starter en queso Cottage al cual se le inocul 104 ufc/g de L. monocytogenes .La actividad de la lacticina 3147 fue detectada a lo largo de los 6 das de almacenamiento y fue asociada con una reduccin de 103 en el nmero de listerias en queso almacenado a 4C y la velocidad de muerte fue mayor en quesos almacenados a temperaturas mayores. Esos resultados demostraron la efectividad de la lacticina 3147 como un inhibidor de L. monocytogenes en un sistema alimenticio donde la contaminacin postmanufactura por este microorganismo puede ocurrir. Tambin se comprob la efectividad de una cepa productora de lacticina 3147 en inhibir L. monocytogenes en quesos madurados por mohos Esta cepa se inocul sobre la superficie de los quesos, los cuales pueden constituir in riesgo de contaminacin con listeria y permitir el crecimiento, ya que el pH de la superficie de los quesos madurados puede exceder a 7 (Fig.4). En quesos el control de las bacterias cido lcticas no-starter (BALNS) es deseable ya que estas han sido implicadas en el desarrollo de sabores extraos. Ensayos usando starter productores de bacteriocinas demostraron que despus de 6 meses

16 de maduracin de los quesos, los recuentos BALNS estaban en un nivel bastante bajo que no interferan con el desarrollo del sabor (Fig.5). Las bacteriocinas adems ayudan a acelerar la maduracin de los quesos. Quesos Cheddar manufacturados con un nuevo sistema starter utilizando una cepa productora de bacteriocina (lactococina A, B y M) junto al starter, exhibieron una mayor concentracin de enzimas intracelulares, indicando que la lisis de clulas starter habra ocurrido durante la manufactura y maduracin del queso. Esos quesos tambin exhibieron mayores niveles de aminocidos libres, indicando un mayor grado de proteolisis secundaria. Adems los quesos Cheddar manufacturados con el nuevo sistema starter recibieron mayor puntaje organolptico que el queso control (22). En quesos fermentados puede ser preferible usar bacteriocinas con un rango de actividad altamente especfico que no afecte la flora natural del queso incluyendo. Por ejemplo, enterocina 1146 (Enterococcus faecium) como varias de las bacteriocinas como-pediocina tales como sakacinas A y P (Lactobacillus sake), Leucocina A (Leuconostoc gelidium) son extremadamente activas contra la L. monocytogenes en niveles que no afectan los cultivos starter. En productos lcteos los cuales no requieren bacterias starter, bacteriocinas de amplio espectro sern preferidas (8) La nisina es tambin usada para extender la vida til de postres lcteos los cuales no pueden ser completamente esterilizados sin daar su apariencia, sabor o textura. La nisina puede incrementar significativamente la vida til de tales productos pasteurizados. La nisina es aplicada a la leche en la mitad Este donde tienen problemas de vida til debido al clima clido, la necesidad de transportar leche a largas distancias y debido a las pobres instalaciones de refrigeracin. La nisina puede doblar la vida til de tales productos a temperaturas de refrigeracin, ambiente y elevadas, y prevenir la germinacin de esporas termoflicas resistentes al calor que pueden sobrevivir a la pasteurizacin. La nisina tambin puede ser usada en leche evaporada (20). Benech, R. et al., (2002) compararon la actividad antibacteriana en queso Cheddar madurado por 6 meses a 7C de nisina Z encapsulada en liposomas versus la producida in situ por un starter compuesto de Lactococcus lactis productor de nisina, dos cepas de lactoccoccus tolerantes a la nisina y L. casei subesp. casei como flora secundaria. Los resultados mostraron que despus de 6 meses se mantena el 90% de la actividad inicial de la nisina Z encapsulada (280+/- 14 UI/g) mientras que slo el 12% para la nisina producida in situ por el starter nisinognico (300+/- 15 UI/g). Los investigadores concluyeron que la nisina contenida en liposomas puede proveer una herramienta til para mejorar la estabilidad, distribucin y disponibilidad de la nisina en quesos, y mejorar el control de bacterias indeseables en alimentos almacenados por largos periodos. La pediocina PA-1, producida por Pediococcus acidilacti se ha demostrado que inhibe L.monocytogenes en productos lcteos tales como queso crema, helado,

17 leche en polvo reconstituida (20). Pediocina PA-1 inhibi Listeria monocytogenes inoculada en queso cottage y queso crema por una semana a 4C, mientras se observ un rpido crecimiento hasta una alta densidad celular en las muestras control (sin bacteriocina). La actividad de la bacteriocina no fue afectada por la grasa o protenas presentes en el alimento, mientras se observ una accin sinrgica entre el efecto de la bacteriocina y el cido lctico (15). En un estudio realizado por Joosten, H y Nuez, M. (1996), se investig la prevencin de la formacin de histamina en quesos por bacteriocinas producidas por BAL. Se emplearon como starter (separadamente) en la elaboracin de quesos dos cepas de enterococos productores de bacteriocinas y una cepa de Lactococcus lactis productora de nisina . Los resultados obtenidos mostraron la inhibicin casi completa de L. buchneri (productor de histamina) el cual haba sido inoculado previamente a la leche en niveles de hasta 190 CFU/g . No hubo formacin de histamina en los quesos elaborados con starter productores de bacteriocinas, en cambio en los quesos control (sin bacteriocina) el L. buchneri alcanz niveles de hasta 1.1x108 CFU/g, y 200 mg de histamina por Kg. despus de cuatro meses de maduracin a 14 C. Esos resultados mostraron que es posible prevenir la formacin de histamina en quesos utilizando starter productores de bacteriocina (Tabla 5) . La lacticina 3147 es una bacteriocina de amplio espectro contra un rango de estafilococos y estreptococos causantes de mastitis. En un estudio llevado a cabo por Ryan, M. et al. (1998) se evalu in vitro la actividad de la lacticina 3147 contra patgenos causantes de mastitis incorporando sta en un sellante intra mamario. El sellante conteniendo lacticina 3147 exhibi excelente actividad antimicrobiana (Fig. 6 ) contra los patgenos causantes de mastitis, por lo tanto el uso de estos sellantes podra mejorar los tratamientos de prevencin de mastitis en vacas que no estn produciendo leche y reducir o eliminar el uso de antibiticos.

Fig. 4: Inhibicin de L.monocytogenes sobre queso madurado con mohos en presencia y ausencia de lacticina 3147.

18

Fig.5: Inhibicin de BALNS en queso Cheddar manufacturado en la presencia y ausencia de un cultivo starter productor de lacticina 3147.
10 8 6 4 2 0 0 5 15 30 45 60 90 120

Log (CFU/ml)

Bac. +; S.dysgalactiae M Bac -; S.dysgalactiae M Bac. -; S.aureus Bac. +; S.aureus

Tiempo (min.)
Fig. 6: Efecto bactericida de lacticina 3147 sobre Streptococcus dysgalactiae M y S.aureus. Lacticina 3147 fue adicionada a cultivos de Streptococcus dysgalactiae M a una concentracin final de 10.240 AU/ml y a 10 cultivos de S.aureus en una concentracin final de 1.280 AU/ml, Tabla 5: Inhibicin de formacin de histamina en queso por starters productores de bacteriocina L. buchneri St2A Starter productos de Histamina Histidina b Inoculo Densidad mximac bacteriocina (mg/kg)a (mg/kg)a (CFU/ml) (CFU/g) E. faecalis INIA 4-07 1,9 < 102 < 10 273 19 < 102 < 10 234 8 190 2 x 10 < 10 250 E.faecalis EFS 2 1,9 < 102 < 10 475 19 < 102 < 10 470 2 190 < 10 < 10 443 L. lactis ESI 561 1,9 < 102 < 10 167 19 < 102 < 10 173 190 < 102 < 10 213 d 6 Ninguno 1,9 1,5 x 10 177 63 7 19 3 x 10 194 21 190 1,1 x 108 214 < 10
a b c
d

Concentraciones de histamina e histidina fueron determinadas despus de 4 meses de maduracin en leche. en queso

el queso control fue elaborado con el starter regular, MAO11. 3.2. Alimentos enlatados

19 La nisina ha sido usada con xito en conservas de baja acidez (pH>4.6) y alta acidez (pH<4.6) para prevenir la germinacin de esporas de clostridios (15). La nisina puede ser adicionada en conservas en niveles de 100-200 UI/g. Para controlar termfilos formadores de esporas tales como Bacillus stearothermophilus y Clostridium thermosaccharolyticum, los cuales pueden sobrevivir y crecer en conservas almacenadas en altas temperaturas. Esta tambin permite una reduccin en los tratamientos trmicos mejorando por lo tanto la apariencia y sabor del producto final sin comprometer la seguridad de los productos y (8, 20). Esta es usada en conservas de papas, championes, guisantes, sopas y pudines de cereales. Debido a la actividad incrementada de la nisina a bajos niveles de pH, es idealmente apropiada para conservas de bajo pH tales como las conservas de tomates, para inhibir la flora de deterioro cido-tolerante tales como B. macerans y C. pasteurianum (20) . La nisina tambin se ha usado en conservas para prevenir el agriado plano producida por especies de Bacillus (8). 3.3. Productos crnicos La carne tiene un nmero de propiedades intrnsecas las cuales hacen que el uso de bacteriocinas sea ms problemtico que en alimentos lquidos. En particular es difcil alcanzar una distribucin homognea, puede haber problemas de solubilidad, las bacteriocinas pueden separar la fase grasa, o simplemente ligarse a las protenas crnicas (8) Bacteriocinas producidas por BAL asociadas con carnes y carnes fermentadas tales como Pediococcus, Leuconostoc, Carnobacterium y Lactobacillus spp. probablemente tendrn un potencial mucho mayor como preservantes crnicos (Stiles y Hasting, 1991; Shahidi, 1991;Yousef et.al., 1991) 6 Se han realizado estudios con nisina con el objetivo de reducir el nivel de nitritos en carnes. Sin embargo, los resultados muestran que se requieren altos niveles de nisina para alcanzar un buen control de Clostridium botulinum, lo cual puede deberse a la unin de la nisina con partculas crnicas, distribucin no homognea, pobre solubilidad en sistemas crnicos o posiblemente a la interferencia en la actividad de fosfolpidos crnicos (8,20). Sin embargo, se han obtenido mejores resultados que el uso convencional de 156 ppm de nitrito combinando niveles reducidos de nitrito (120 ppm) con 100-250 ppm de nisina A (1). Luckansky et al. (1992)5 inocul una cepa productora de pediocina y otra no productora de pediocina en pasta de vienesa la cual fue subsecuentemente inoculada con un cctel de 4 cepas de L. monocytogenes . El nmero de listerias permanecieron altos (105/g) en las vienesas que contenan la cepa no productora de pediocina, mientras que la vienesa que contena la cepa productora de pediocina el nmero de listerias descendi a menos de 10 2/g. Adems, la pediocina producida sobrevivi al proceso de coccin al final de la fermentacin y fue detectable a lo largo de los 60 das de almacenamiento a 4C. Estos mismos investigadores
5

Hill, C., 1999.

20 desarrollaron una forma de gelatina de pediocina, producida por una bacteria cido lctica, que protege a los hot-dog de la contaminacin con Listeria (15). Inculos de bajo nivel de Pediococcus lactis productor de pediocina PA-1 se han usado en bacn reducido en nitrito para prevenir la germinacin de esporas de Clostridium botulinum y la subsiguiente produccin de toxina (20) Sakacina A, una de las bacteriocinas como pediocina , tambin ha sido usada para controlar el crecimiento de L. monocytogenes en carne molida pasteurizada (Schillinger, 1994)6. La presencia de un cultivo productor de sakacina A previno el crecimiento de un alto inoculo de L. monocytogenes a 8C, mientras en la ausencia del productor de sakacina A los niveles incrementaron desde 10 5 a 109/g en 10 das. Resultados similares se encontraron en pat de cerdo inoculado con un cctel de listerias (8). La leucocina A, cuyo productor fue aislado desde carne, tiene aplicaciones potenciales en carnes envasadas al vaco. Tales productos son almacenados a bajas temperaturas en condiciones anaerbicas, posiblemente con adicin de cidos orgnicos. Sin embargo, las bacterias alterantes de la carne son psicrtrofas, anaerobias facultativas y cido tolerantes; por lo tanto es necesario controlarlas utilizando hurdles adicionales, tales como el uso de bacterias lcticas bacteriocignicas, las cuales deben ser capaces de competir con la carga microbiana indgena relativamente alta de la carne cruda. La ventaja de la leucocina A sobre la nisina, es la estabilidad en sistemas crnicos y que puede ser producida durante el almacenamiento refrigerado sin cambios organolpticos indeseables bajo condiciones aerbicas y anaerbicas por largos periodos de tiempo. Esta previene el deterioro debido a la produccin de sulfuro por Lactobacillus sake (20). MING, X. et.al. (1997), produjeron polvos lcteos ricos en bacteriocina para aplicarlos en film de envasado para alimentos. La disponibilidad de estos polvos hace posible cubrir envolturas celulsicas y bolsas plsticas ampliamente utilizadas en productos crnicos con una delgada capa de film antimicrobiano. El envasado vaco y humedad de las carnes al interior de las bolsas hace posible un excelente contacto entre la superficie crnica y la bacteriocina. En la figura 7 se muestra la inhibicin por polvos de pediocina en una concentracin de 7.75 mg/cm 2 aplicados en bolsas de envasado de carne inoculada con L. monocytogenes. Los resultados mostraron que las bolsas cubiertas con pediocina fueron efectivas en inhibir L. monocytogenes en productos frescos y procesados . El crecimiento fue diferente (p<0.05) entre las muestras control y las muestras tratadas despus de 2 semanas a 4C. La L.monocytogenes inoculada no creci en bolsas cubiertas con pediocina, mientras el mismo inculo creci hasta 106 en muestras control. Lactobacillus sake Lb674, una BAL aislada originalmente de carne que produce la bacteriocina sakacina 674, la cual es idntica a la sakacina P y muy similar a la pediocina PA-1 fue inoculada en niveles de 10 5-106 CFU/g en vienesa tipo Bologna envasadas al vaco almacenadas a 7C, L.sake Lb674 produjo cantidades detectables de bacteriocina y retras completamente el crecimiento de L.monocytogenes, mientras las BAL no productoras de bacteriocina no inhibieron el crecimiento de este microorganismo (Fig.8). El uso de sakacina 674 purificada

21 exhibi un marcado efecto inicial contra L.monocytogenes e inhibi su crecimiento durante el almacenamiento de esta carne fermentada (1). Scannel, A., (2000) estudi el efecto de lacticina 3147 y nisina sobre la vida til de vienesa de cerdo fresca y la habilidad que tienen para controlar patgenos (C. perfringens DSM 756, Salmonella Kentuchy AT1) y no patgenos (L. inonocua DPC 1770). Los resultados obtenidos mostraron que no haba diferencia significativa en la actividad de ambas bacteriocinas contra las cepas objetivo usadas, ambas bacteriocinas fueron significativamente mejor que metabisulfito de sodio contra cepas Gram-positivas. Adems los resultados indicaron sinergia de cidos orgnicos con bacteriocina contra Salmonella Kentuchy y L.innoccua, siendo particularmente ms efectivo en la inhibicin de C.perfringens. Adems, lacticina 3147 combinada con citrato de sodio (CS) o lactacto de sodio (LS) obtuvieron RT en placa significativamente menores durante el periodo del ensayo (Fig 9 y10). El estudio sugiri que lacticina 3147 combinado con LS o CS puede ser utilizado como un efectivo preservante contra patgenos de origen alimenticio, y puede funcionar como una alternativa al metabisulfito de sodio. Debido a que la lacticina 3147 es estable al calor, permanecera activa despus de la coccin de la vienesa y la protegera de la contaminacin y proliferacin de un amplio rango de patgenos y microorganismos alterantes. Lo cual es particularmente importante en casos donde la vienesa cocinada es mantenida por algn tiempo antes del consumo (Ej: Establecimientos de catering e instituciones). Adems la lacticina 3147, combinada con LS o CS mantiene bajos los recuentos totales a lo largo del almacenamiento, extendiendo la vida til sin comprometer la seguridad microbiolgica del producto. La pediocina AcH (PA-1) se ha demostrado que controla exitosamente el crecimiento de L. monocytogenes en pollo crudo. El uso de 2.400AU/g de pediocina result en 2.8 log CFU/g de L. monocytogenes despus de 28 das de almacenamiento a 5C, mientras que el pollo control tena una carga de 8.1 log CFU/g. La pediocina se liga al pollo crudo, pero no al cocinado. Sin embargo, cuando al pollo crudo con pediocina es cocinado, la actividad de la pediocina es retenida. Los autores sugieren que la pediocina debiera ser aplicada al pollo antes de ser cocinado para que la efectividad sea mxima (Goff et al., 1996) 6 En la Universidad de Melbourne en Australia, Berrie Davidson ha investigado la accin de la piscicolina producida por una BAL sobre Listeria. La piscicolina ha sido patentada, y pronto ser usada en productos crnicos y como enjuague para ensaladas verdes o piezas de pollo (15).

J.Cleveland et al., 2001

22

Figura 7: Inhibicin de L.monocytognes inoculada en carne por efecto de polvos de pediocina aplicado en las bolsas de envasado. Promedio de determinaciones en triplicado en una muestra de carne. Promedio de diferentes carnes control y tratadas (p<0,05) despus de un tiempo de almacenamiento igual o superior a 2 semanas a una temperatura de 4C.

Figura 8: Crecimiento de L.monocytogenes en vienesa tipo Bologna a 7C en la presencia de BAL no productoras de bacteriocinas (bac -) y BAL productoras de bacteriocinas (L bac +), y la progresin del pH durante el almacenamiento. La vienesa fue artificalmente inoculada con un pool de 4 servares diferentes de L.monocyttogenes . BAL bac -: un pool de 20cepas BAL no productoras de bacteriocinas aisladas de muestras de carne. BAL +: sakacinas 674 producida por la cepa L.sake Lb674

23 3.4. Productos del Mar Taylor et al., (1990)7 demostr que el tratamiento con nisina A de bacalao, arenque, y filetes de caballa ahumada inoculado con esporas de Clostridium botulinum retrasaba la produccin de toxina en 5 das a 10 C, pero slo en medio da a 26 C. El tratamiento con nisina no interfera con el crecimiento de las bacterias no patgenas y en todas las muestras la toxina botulnica fue formada antes que el deterioro fuera evidente (1). El efecto de la nisina Z, carnocina UI49 y bavaricina A sobre el crecimiento bacteriano y vida til de camarn en salmuera fue evaluado y comparado con el efecto de una solucin de sorbato/potasio y control sin preservantes (Einarsson y Lauzon, 1995). Tpicamente este producto contiene 3 a 6% de sal y concentraciones de cido srbico y benzoico de 0.05% a 1%, con pH entre 5 a 6, y es almacenado a temperaturas entre 0 a 6C. La solucin de sorbato/benzoato preserv el camarn en salmuera por un periodo 59 das a 4.5C. La vida til de camarn en ausencia de preservantes fue de 10 das. De las tres bacteriocinas la ms efectiva fue la nisina Z tanto cruda como purificada extendiendo la vida til del camarn en salmuera a 31 das. Estos resultados indican que es posible preservar camarones en salmuera bajo refrigeracin utilizando preservantes naturales tales como la nisina Z por un periodo de 3 a 4 semanas, protegindolo adems de la posible contaminacin con L.monocytogenes (7). Duffes, F., (1999) estudi la inhibicin de L. moncytogenes en salmn ahumado en fro refrigerado envasado al vaco por bacteriocinas semi-purificadas y producidas in situ por Carnobacterium spp. Los resultados obtenidos demostraron que C. piscicola V1 ejerce un efecto un bactericida contra L. monocytogenes a temperaturas de refrigeracin de 4 y 8C, siendo la cepa ms efectiva de las utilizadas (C. piscicola V1, C.divergens V41 y C. piscicola SF668). Adems no se obsev deterioro debido al uso de las cepas productoras de bacteriocinas, lo que qued demostrado por los buenos resultados del anlisis sensorial y una baja produccin de aminas biogenas (Fig. 11). El estudio concluy que cepas bacteriocignicas de Carnobacterium pueden ser utilizadas en el futuro para controlar el crecimiento de L. monocytogenes debido a su habilidad para crecer y producir bacteriocinas bajo las condiciones reinantes en el alimento. Adems los resultados mostraron que la aplicacin de divercina V41 (producida por C. divergens V41) como nico aditivo para controlar L.monocytogenes es prometedora. Las bacteriocinas tambin se pueden utilizar para mejorar la seguridad y alargar la vida til de salmn fresco refrigerado. La combinacin de nisina y Microgard (MG) junto con un pH de 4,2 redujo la poblacin aerbica total de salmn fresco refrigerado en 2 log.(p<0.05) e increment su vida til a 6C en 3-4 das en comparacin al control. Tambin se redujo el crecimiento de L.monocytogenes inoculada en salmn congelado-descongelado e increment su vida til de 5 a 10 das a 6C. El tratamiento con bacteriocina no afect el pH superficial o color del pescado (Fig.12).
7

Abee, T., et al., 1995

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Fig. 12: Evaluacin del tratamiento ptimo de bacteriocina sobre L.monocytogenes (CFU/g) en salmn fresco almacenado a 6C envasado al vacio y sin vacio. El salmn fue tratado 6 das despus de la captura.Vaco (V).Control: ; V-Control: ; Mg + Nis.: ;; V-MG +Nis: .

Fig. 11:: Eficacia de C. piscicola V1 y piscicocina, adicionada como substancia semipurificada, contra L.monocytogenes en salmn ahumado en fro refrigerado envasado al vaco almacenado a 8C (a) y 4C (b). , L. monocytogenes sola (control); , L. monocytogenes en cocultivo con C.piscicola V1; , L. monocytogenes en presencia de piscicocinas; , < (10 UFC/g). Cada punto es el promedio de tres determinaciones. Las barras indican las desviaciones estndar.

3.5 Vino y Cerveza La resistencia de las levaduras a la nisina permite que sta pueda ser usada para controlar el deterioro por BAL en cervezas y vinos (20) La fermentacin malolctica es una importante caracterstica de algunos vinos. Esta fermentacin debe ser controlada para alcanzar una alta calidad del producto. En varios vinos tintos la conversin de malato dicarboxlico a lactato monocarboxlico es una consecuencia deseable del crecimiento de las bacterias cido lcticas tales como Leuconostoc oenos o Pediococcus damnosus. Esta conversin puede conducir a una elevacin del pH entre 0,1-0,3 unidades, y tambin tiene un efecto sobre las caractersticas sensoriales del vino. Donde la fermentacin malolctica es deseada el vino puede ser inoculado con cepas seleccionadas de Leuconostoc oenos. Sin embargo en ciertos vinos blancos esta misma fermentacin tiene un efecto negativo sobre la calidad del vino y es indeseable. La nisina puede ser usada para promover la calidad de ambos tipos de vinos (Daeschel et al., 1991) 8. Por ejemplo, se puede
8

HILL, C., 1999

25 adicionar al vino despus de la fermentacin por levaduras, nisina y Leuconostoc. oenos resistente a la nisina. La nisina prevendr el crecimiento de todas las BAL indeseables, no interfiriendo en la fermentacin malolctica debido a la adicin deliberada del starter resistente a la nisina. Alternativamente, la nisina sola puede ser adicionada para prevenir el crecimiento de todas las BAL, y por lo tanto asegurar la ausencia de fermentacin malolctica en el desarrollo del vino. Un beneficio adicional en ambos casos, es que la fermentacin del vino por BAL salvajes es prevenida, ya que esta fermentacin indeseada puede ser una causa de defectos tales como mucosidad y exceso de acetato (8). La nisina puede tambin ser usada para reducir la cantidad de dixido de azufre usado en la elaboracin del vino para controlar las bacterias causantes de deterioro (20) El crecimiento de lactobacilos y pediococos en cerveza es una de las principales causas de deterioro, que conducen a una cerveza con demasiado desarrollo de acidez y con sabores extraos debido a la produccin de diacetilo. Se ha demostrado que la nisina puede ser usada para controlar este problema sin tener un efecto adverso sobre la calidad de la cerveza. La nisina adems puede reducir los tiempos de pasteurizacin e incrementar la vida til de las cervezas (8,20). 3.6. Chucrut La utilizacin de cepas productoras de nisina puede tener una aplicacin potencial en la produccin de chucrut. Se han aislado dos cepas productoras de nisina desde chucrut comercial. Las cepas productoras de nisina fueron utilizadas en fermentaciones modelo de chucrut, junto con Leuconostoc mesenteroides resistente naturalmente a la nisina. La fermentacin del chucrut es secuencial y depende del crecimiento inicial de L. mesenteroides heterofermentativo, seguido por lactobacilos y la produccin adicional de cido (8). Productores de nisina fueron exitosos en retrasar el inicio del crecimiento de Lactobacillus spp., sin afectar el crecimiento de L.mesenteroides (Harris et.al , 1992)9 3.7. Otras aplicaciones Cepas bacteriocignicas como Lactocococcus lactis ESCC 146 y P. pentosaceus ATCC 43200 pueden ser utilizadas para mejorar la seguridad y extender la vida til de alimentos cocinados refrigerados. El color, palatabilidad, textura, sabor y general la aceptabilidad completa de comida sois-vide no se ven afectados por la presencia de los cultivos (11). En un estudio con pur de papas pasteurizado se vio la efectividad de la nisina en el control del deterioro por Bacillus y Clostridium. Se inocul un cctel de esporas de C. sporogenes y C. tyrobutiricum en pur de papa cocinado envasado al vaco y pasteurizado e incubado a 8C y 25C. La vida til del pur se extendi a 25C en al menos 58 das con la adicin de 6.25 ug /g . En muestras control (sin nisina) almacenadas a 8C el Bacillus contaminante natural creci, pero las cepas de Clostridium no crecieron hasta que la temperatura fue elevada a 20C despus de 39 das. Mientras que en las muestras que contena nisina no hubo crecimiento, y la
9

HILL, C., 1999

26 vida til fue extendida al menos en 30 das con la adicin de 6.25 ug/g de nisina. En ensayos con un cctel de cepas de B.cereus y B.subtilis, 6.25 ug/g de nisina extendi la vida til al menos en 27 das en pur no envasado al vaco almacenado a 8C, una extensin similar en la vida til se observ a 25C utilizando 25 ug/g de nisina. Adems se observ que se mantuvieron niveles efectivos de nisina despus del proceso de elaboracin y una buena retencin de nisina a lo largo de toda la vida til. En otro estudio se vio la efectividad de nisina preparada en laboratorio y nisina comercial sobre C. botulinum en papas cocinadas. La nisina preparada en laboratorio disminuy los recuentos de C. botulinum en 2-3 log en 3 das de almacenamiento comparado al control. Bajo condiciones similares una solucin de nisina comercial (20 UI/ml) disminuy los recuentos en 3-4 log. Estos resultados sugieren que las bacteriocinas son potencialmente tiles en inhibir C. botulinum en hortalizas listas para comer y que pueden extender la vida til de esos productos cuando ocurren abusos de temperatura (16). Las bacterias lcticas junto con sus bacteriocinas son potencialmente tiles para garantizar la inocuidad de frutas y hortalizas mnimamente procesadas, especialmente cuando ocurren abusos de temperatura. Vescovo et.al (1996) 10 aisl una serie de cepas de BAL psicrtrofas desde ingredientes de ensaladas de hortalizas. De esas cepas se seleccionaron aquellas productoras de bacteriocinas activas contra una variedad de patgenos Gram negativos y Gram-positivos. Las cepas seleccionadas luego fueron utilizadas en un test de desafo en ensaladas con A. hidrfila, L.monocytogenes, Salmonella typhimurium y S.aureus. Mientras todos los patgenos fueron capaces de crecer en las ensaladas (con un inculo inicial aproximado de 105 ufc/g) en 6 das, ninguno fue detectado en 6 das en aquellas ensaladas inoculadas con las BAL productoras de bacteriocinas (3). Las bacteriocinas son tambin tiles en controlar el crecimiento de contaminantes Gram (+) en fermentaciones que dependen de microorganismos Gram-negativos u hongos, por ejemplo la produccin de cidos orgnicos, polisacridos, aminocidos y vitaminas (20). En la tabla 6 se muestra un resumen de algunas sugerencias de aplicaciones de bacteriocinas en alimentos y en la tabla 7 se muestran ejemplos de uso efectivo de nisina en alimentos.

Tabla 6: Bacteriocinas como preservantes en alimentos: ejemplos de aplicaciones sugeridas

10

BREIDT, F. Y FLEMING, H., 1997

27 Bacteriocina Aplicacin
Nisina A Pediocina AcH Incorporacin de nisina al interior de ingredientes ligantes de carne (Fibrimex) Uso de pediocina Ach producida por L..plantarum WHE 92 para rociar la superficie de queso Munster al comienzo del periodo de maduracin Uso de Ent. faecalis productor de enterocina como cultivo starter para la produccin de queso Manchego. Uso de Bre. lines como cultivo starter en la produccin de queso untable rojo Uso de nisina para controlar L. monocytogenes en queso Ricota Uso de piscicolina 126 para controlar L. monocytogenes en pasta de jamn condimentada Uso de Leu. gelidum UAL 187 productor de leucocina para controlar deterioro en carne

Conclusin
La adicin de nisina puede reducir bacterias indeseables en productos crnicos reestructurados. El spray previene el crecimiento de L. monocytogenes y puede ser usado como un tratamiento antilisterial El uso de Ent. faecalis INIA4 como starter inhibe L.monocytogenes Ohio, pero no L. monocytogenes Scott A. Reduce en 2 ciclos logartmicos L. ivanovi y L. monocytogenes La nisina inhibe efectivamente L.. monocytogenes por 8 semanas Ms efectiva que bacteriocinas disponibles comercialmente La inoculacin de carne de vacuno envasada al vaco con el cultivo productor de bacteriocina retrasa el deterioro por L. sake hasta 8 semanas. Lactocina 705 inhibe el crecimiento de L. monocytogenes en carne molida

Referencia
Cutter y Siraguza, 1998 Ennahar et al., 1996

Enterocina 4

Nunez et al., 1997 Eppert et al., 1997 Davies et al., 1997 Jack et al., 1996 Leisner et al., 1996

Linocina M-18 Nisina A Piscicolina 126

Leucocina A

Lactocina 705

Uso de lactocina 705 para reducir el crecimiento de L. monocytogenes en carne molida Pediocina AcH El uso de P. acidilacti La adicin de P. acidilacti (Ped +) productor de pediocina inhibe como cultivo starter contribuye a L. monocytogenes una reduccin efectiva de L. monocytogenes durante la manufactura de vienesa de pollo en verano Pediocina Expresin de opern en S. Aplicacin potencial en la cerevisiae preservacin de productos horneados y vinos. Pediocina AcH Adicin de pediocina en la Controla el crecimiento de L. preparacin de pollo crudo monocytogenes por 28 das a 5 C Pediocina PA-1 Uso de una cepa de P. Pediocina contribuye efectivamente acidilacti (Ped. +) como a la inhibicin de L. cultivo starter en fermentacin monocytogenes de vienesa Enterocina Adicin de enterocina a Control del crecimiento de L. jamn, chancho, pechuga de monocytogenes bajo diferentes pollo, pat y vienesa inoculada condiciones Fuente: J. Cleveland et al., 2001

Vignolo et al., 1996 Baccus-Taylor et al., 1993

Schoeman et al., 1999 Goff et al., 1996 Foegeding et al.,1992 Aymerich et al., 2000a,b

Tabla 7: Ejemplos de uso efectivo de nisina en alimentos

Alimento Microorganismo objetivo Concentracin efectiva de nisina Referencias

28
(UI/ml) Queso Cottage Queso Ricota Leche descremada Vienesa tipo Bologna Vacuno magro Fuente: J. Cleveland et al., 2001 L. monocytogenes L. monocytogenes Esporas de B. Cereus L. sake y L. curvatus Bro. thermosphacta 2.000 100 4.000 1.000 400 Ferreira y Lund, 1996 Davies et al., 1997 Wandling et al., 1999 Davies et al., 1999 Cutter y Siraguza, 1998

3.8. Uso de Bacteriocinas en Mtodos Combinados o Tecnologa Hurdle La tecnologa hurdle combina diferentes mtodos de preservacin para inhibir el crecimiento microbiano. La tabla muestra que las bacteriocinas a menudo ejercen sinergia con otros tratamientos, y pueden ser usadas como una barrera para mejorar la seguridad de los alimentos. Una comprensin del modo de accin de cada barrera individual permite la combinacin ms efectiva de tratamientos. Por ejemplo la aplicacin de campos de pulsos elctricos (PEF), que incrementa la permeabilidad de la membrana clula, ha sido usado junto con nisina, la cual tambin acta a nivel de membrana celular (Terebiznik et al., 2000) 11. Aunque las bacterias Gram-negativas, levaduras y mohos no son sensibles en general a la accin de bacteriocinas de BAL, en presencia de agentes quelantes, surfactantes o shock osmtico (alta concentracin de sal) pueden volverse sensibles. Utilizando nisina en mtodos combinados apropiados se puede inactivar Salmonella y otras especies Gram-negativas (4, 8,15, 20)

Tabla 8: Uso de bacteriocinas en Mtodos Combinados.

Bacteriocina Nisina A
11

Otros factores N2;CO2;bajas

Efecto Referencias Efecto sobre L.monocytogenes;incremento Szabo y

CLEVELAND, JENNIFER, 2001

29
temperaturas Pediocina AcH en la fase lag (400 UI/ml);inhibicin del crecimiento (1250 UI/ml) . Presin Combinacin de presin (345 MPa), hidrosttica y altas temperaturas (50 C) y bacteriocinas temperaturas actan sinrgicamente en la inhibicin de S.aureus, L. monocytogenes , E. coli O157:H7, L.sake y Leuc. Mesenteroides. Lactoperoxidasa de leche (LP) y baja temperatura Nisina producida por L. lactis acta sinrgicamente con LP en la reduccin de L. monocytogenes. Cahill,1998 Kalchayanand et al.,1998

Nisina A

Rodriguez et.al., 1997 Cutter y Siragusa,1998

Nisina A

Gel de alginato de Nisina inmovilizada en gel es liberada Calcio ms efectivamente que nisina pura y suprime el crecimiento de Bro. thermosphacta sobre carcasas de carne vacuna. Pediocina AcH Diacetato de sodio Combinacin de Pediocina y diacetato de sodio trabaja sinrgicamente contra L.monocytogenes tanto a temperatura ambiente como a bajas temperaturas. Nisina Esteres de Sinergia contra L. monocytogenes, S. sucrosa de cidos aureus, B.cereus y L. plantarum grasos Nisina Dixido de Accin sinrgica contra L. monocytogenes Carbono resistente y no resistente a nisina. Nisina Campo de pulsos Accin sinrgica contra B.cereus (0.06 elctricos ug/ml) de nisina y 16.7 kV/cn, 100 us duracin de PEF) Nisina Envasado en Combinacin fue ms efectiva que atmsfera tratamiento slo en prevenir crecimiento modificada (AM) de L. monocytogenes. Pediocina Ach Emulsificador Pediocina AcH posee mayor actividad /Tween 80) o listericida en leche descremada, encapsulacin de mantequilla o carne cuando est presente pediocina en en forma encapsulada o acta en la liposomas. presencia de Tween 80 Fuente: J. Cleveland et al., 2001

Schlyter et al., 1993 Thomas et.al., 1998 Nilsson et.al., 2000 Pol et.al , 2000 Fang y Lin, 1994 Degnan et al., 1993

V. EXPECTATIVAS FUTURAS El uso de bacteriocinas no debera ser visto como una forma primaria de preservacin de los alimentos, sino ms bien, como una barrera adicional en el

30 crecimiento de los microorganismos, tanto alteradores como patgenos, en la preservacin por mtodos combinados. Las bacteriocinas sirven como una barrera bactericida ayudando a reducir los niveles de contaminacin bacteriana, mientras que la aplicacin de mtodos de preservacin bacteriostticos como el uso de envasado en atmsfera modificadas o la reduccin de la actividad de agua ayuda a inhibir la flora resistente a la bacteriocina (8, 20). El uso de bacteriocinas en alimentos probablemente depender de la economa de la produccin de bacteriocina a una escala industrial. Por ejemplo, no es difcil imaginar la aplicacin de bacteriocinas de BAL en productos fermentados, pues sta puede ser introducida al alimento a cero o bajo costo a travs del uso de un starter productor de bacteriocina. Adems, esta aplicacin tiene las ventajas de: asegurar una distribucin uniforme a travs de todo el alimento, obtener probablemente un pH inferior a 5.5 en el producto asegurando una mayor efectividad para la mayora de las bacteriocinas (las cuales actan mejor a pH cidos), y por ltimo las BAL tienen una categora GRAS en la produccin de alimentos fermentados. En cambio, es ms difcil imaginar instancias donde el efecto protector de la bacteriocina adicionada en forma purificada sea costo-efectivo, adems de la dificultad de asegurar una distribucin homognea a travs de todo el alimento. Sin embargo, tales aplicaciones han sido identificadas para la nisina, y por lo tanto son tambin posibles para otros purificados de bacteriocina. El uso actual de Microgard (derivado de leche fermentada) como un ingrediente en alimentos en base a leche, es un ejemplo de la adicin de bacteriocinas a bajo costo. Anlisis genticos de opern de bacteriocina continuarn abriendo caminos en la aplicacin de bacteriocinas, ya que la habilidad de sobreproducir el inhibidor tendr impacto en trminos de costo-eficiencia. Ciertamente el futuro de las bacteriocinas no consistir en descubrir la bacteriocina perfecta para todas las aplicaciones, sino ms bien en identificar nuevas bacteriocinas para tareas especficas, con estabilidad, espectro de accin y modo de accin caractersticos (8). Entre las reas de estudio actuales y futuras para aplicaciones potenciales y uso seguro de las bacteriocinas en la preservacin de alimentos, podemos mencionar (1): a) Estudios continuos de las propiedades fsicas y qumicas, modo de accin, relacin estructura-funcin de las bacteriocinas. b) Investigaciones adicionales de la presencia natural de cepas bacteriocignicas en alimentos y estudios toxicolgicos, que provean bases ms slidas para el uso seguro de bacteriocinas en la cadena alimenticia. c) Investigaciones acerca de la accin sinrgica de estos componentes con tecnologas avanzadas (como por ejemplo, campos de pulsos elctricos y altas presiones hidrostticas) pueden resultar en reemplazo de preservantes qumicos, o permitir procesamientos menos severos (Ej. calor), manteniendo la calidad e inocuidad de los alimentos.

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