29 de Octubre de 2010

Separación de pigmentos fotosintéticos mediante disolventes orgánicos.

En esta práctica tenemos como objetivo separar los distintos

pigmentos cloroplásticos que hay en un vegetal, en este caso en las acelgas.
Para ello hemos triturado, en un mortero de vidrio, 15 gramos de
hojas de acelga a la cual le hemos retirado previamente los nervios
mayores. A este triturado le vamos añadiendo acetona, poco a poco, en
total 75ml, junto con una pizca de CaCO3, el cual neutraliza los
compuestos ácidos y evita la pérdida de Mg de las clorofilas. Cuando
tenemos toda esta mezcla (hojas, acetona, CaCO3) macerada, filtramos por
papel de filtro y desechamos los residuos sólidos que quedan y no
atraviesan el filtro.
En la solución que obtenemos contiene los pigmentos cloroplásticos
(clorofilas, carotenos, xantofilas) y numerosas moléculas incoloras, restos
celulares.
De esta solución, se cogen 60 ml y se llevan a un embudo de
decantación donde, se ha colocado previamente 90ml de éter de petróleo. A
continuación, hemos añadido 100ml de agua destilada con mucho cuidado
evitando que cayera directamente sobre la solución que se encuentra en el
embudo de decantación, por lo que hemos inclinado este embudo dejando
resbalar el agua por las paredes del embudo. Tras añadir el agua , se agita
suavemente y con cuidado para evitar la formación de una emulsión
separadora entre las dos capas, lo cual nos sería costoso eliminarla. Cuando
se reposa la mezcla del embudo de decantación, se observan dos capas , la
capa superior de éter de petróleo de un color verde oscuro, debido a que
contienen los pigmentos al ser éstos insolubles en agua; y la capa inferior
lavado de acetona y agua, de color claro en la que se encuentran los restos
celulares solubles en agua, que hemos desechado. La capa superior de éter
de petróleo, se repite el lavado con 100ml de agua dos veces más,
desechando siempre la capa inferior. Después de los tres lavados, se toma
una muestra de la capa de éter de petróleo, con una pipeta, de la parte más
superficial posible, ya que esta parte es más pura. (muestra 1)
A continuación, preparamos 75ml de metanol acuoso al 92%.
75·92/100= 69ml de metanol puro
Disolución final: 69ml de etanol puro + 6ml de agua destilada.
Esta solución de metanol se le añade al embudo de decantación que
contiene el éter de petróleo, y se agita. Este proceso de adición y agitación
lo realizó la profesora Blanca para evitar que nos estallase ya que esta
mezcla produce gases. La agitación se realizó con el embudo tapado,
cogido un tanto inclinado (con la llave hacia arriba) y tras una pequeña
agitación, rápidamente se abre la llave, en la campana y dirección hacia ella
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para expulsar los gases. Después de agitar se coloca en el soporte y se le

quita la tapa superior del embudo de decantación.
De nuevo observamos la división de la mezcla del embudo en dos
capas. Esto es debido a la fuerza polar del metanol capaz de disolver la
clorofila b y las xantofilas, son polares. La clorofila a y los carotenos, al
ser apolares continúan en el éter de petróleo. Esta distinción en dos capas
es por la composición de los pigmentos; la diferencia entre los dos grupos
de una capa y la otras es que en los compuestos de la capa superior no
tienen ningún oxígeno en sus estructuras, lo que los hace más apolares que
los otros dos, clorofila b y xantofilas, que si que tienen varios oxígenos en
sus estructuras.
Estas dos capas que acabamos de obtener las separamos en dos
eldermeyers, desechando la zona intermedia (un poco de ambas capas) para
asegurarnos de su perfecta separación. De estas nuevas capas tomamos
muestras con una pipeta a un tubo de ensayo, igual que en la muestra 1, de
la parte más superficial, que es la más pura.
Muestra 2: éter de petróleo clorofila a y carotenos. Color
verde claro
Muestra 3: metanol  clorofila b y xantofilas. Color verde
más oscuro que la muestra 2.
Dejamos apartada la muestra 3 y seguimos trabajando con la muestra
2, a la cual sometemos a una lavado con éter etílico y agua para el eliminar
el metanol. Es necesario tratar la muestra 2 con etílico porque para separar
la clorofila a de las xantofilas hay que someterlas a una hidrólisis alcalina
con KOH en metanol. Esta hidrólisis no tendría lugar con metanol porque
no reaccionaría sobre sí mismo (metanol con metanol= nada), pero sí con
éter.
Entonces, a 60ml de la mezcla 2 colocados previamente en el
embudo de decantación, le añadimos 60ml de éter etílico y 100ml de agua
destilada; el mecanismo es el mismo, dejándolo resbalar por las paredes del
embudo y agitarlo posteriormente. La capa acuosa inferior se llevará el
metanol, pero al tener un cierto grado de polaridad, no disuelve los
pigmentos y éstos se quedan en éter etílico, la capa superior. La capa
inferior, polar, se desecha.
Retomamos la muestra 3 que se había dejado apartada antes y la
trabajamos al tiempo de la muestra 2, de la siguiente manera:
 Tomamos 40ml de cada una de las muestra (2 y 3) y se
depositan en eldelmeyers diferentes, identificados de tal
manera que sepamos cuál es cuál.
 Añadimos a cada una de esa muestras 20ml de KOH al 30%
en metanol.
[preparación de 40ml de la solución: 30·40/100= 12gramos de
KOH]
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 Agitar durante 10 minutos en la campana

 Añadir nuevamente 30ml de agua destilada
 Agitar durante un minuto más
 Depositar en un embudo de decantación para separar las capas.
Tanto de la muestra 2 como de la muestra 3 desechamos la
capa inferior, la capa de metanol y agua junto con las
correspondientes clorofílidas, que son la parte polar de los
compuestos.
 De las capas superiores tomamos una muestra, con una pipeta,
de la parte más superfcial, ya que es la zona más pura.
o Capa superior muestra 2  muestra 4: éter de petróleo
con carotenos, color amaillo.
o Capa superior muestra 3  muestra 5: éter etílico con
xantofilas, color amarillo.

Por último, las 5 muestras un tubos de ensayo, se depositaron en la

nevera para trabajarlas en la siguiente práctica: separación de
pigmentos II.