TEHNICA PCR

Scopul proiectului TEHNICA PCR- a fost implementarea metodelor de

analiza moleculara in domeniul biologiei sistematice, in cadrul Muzeului
National de Istorie Naturala “Grigore Antipa”, prin aplicarea tehnicii PCR si
a variantelor acesteia. Tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction, reactia
de polimerizare in lant) permite sinteza in vitro a unei secvente specifice
de ADN, folosind doua fragmente scurte de ADN (oligonucleotide, primeri)
care adera la cele doua catene complementare ale moleculei de ADN de
sintetizat, in pozitii care flancheaza regiunea de interes (tinta). Metoda este
intens folosita in cele mai diverse aplicatii din biologie si medicina.

In anul 1986, Mullis a descoperit metoda de amplificare in vitro a

acizilor nucleici, metoda denumita Reactia de Polimerizare in Lant (PCR,
Polymerase Chain Reaction).

Prin aplicatiile ei, tehnica PCR permite manipularea directa a

secventelor de acizi nucleici (ADN si ARN). Se poate realiza astfel
secventierea unui fragment ADN (determinarea ordinii de succesiune a
bazelor azotate in molecula de ADN), determinarea variatiilor existente
intre diferite molecule de ADN, modificarea secventei moleculelor de acizi
nucleici de interes. Pentru scopurile biologiei sistematice, determinarea
variatiei existente intre diferite molecule si secventierea ADN sunt insa
aplicatiile de mare interes in lamurirea statutului diferitelor specii si mai
ales in filogenia geografica.

Materiale si metode :

Materialul biologic

S-a utilizat material biologic provenit de la doi indivizi masculi de

Nyctalus noctula (Chiroptera).
 Extractia ADN genomic

Pentru extractia ADN genomic, au fost prelevate fragmente de tesut

cardiac de la indivizii analizati. Probele respective a fost mojarate in azot
lichid, pentru distrugerea tesutului si eliberarea (partiala) a celulelor.
Fiecare proba fost ulterior transferata in tuburi de centrifuga si s-au
adaugat 10 ml tampon de liza celulara (30mM TrisCl pH 7.5, 100mM NaCl,
1mM MgCl2, 0.5mM CaCl2, 0.5% Nonidet P40) pentru 1g de tesut initial.
Dupa omogenizare, probele au fost centrifugate pentru sedimentarea
nucleilor la 3000g, 4˚C, timp de 5 minute. Nucleii obtinuti au fost
resuspendati in acelasi volum de TE (10mM TrisCl, 1mM Na2EDTA, pH
7.5), s-a adaugat SDS 10% pana la o concentratie finala de 0.5% si s-a
incubat la 50˚C pentru 10 minute. Dupa racire la 37˚C, s-a adaugat RNAza
A la concentratia finala de 100μg/ml si s-a incubat pentru 30 minute la
37˚C. S-a adaugat EDTA la concentratia finala de 10mM si s-a incubat 10
minute la 50˚C. Ulterior s-a adaugat pronaza la concentratia finala de
100μg/ml si s-a incubat la 37˚C peste noapte. A doua zi au fost extrase
proteinele prin tratament cu amestecul fenol:cloroform 1:1. Dupa preluarea
fazei apoase, s-a adaugat acetat de sodiu la concentratia finala de 0.3M si
s-a amestecat bine. ADN-ul a fost precipitat prin adaugarea de 0.7 volume
etanol absolut. ADN precipitat a fost preluat cu o bagheta de sticla, s-a
trecut in etanol 70% pentru spalare, apoi a fost resuspendat in apa distilata
sterila.

Reactia PCR-RAPD
Pentru fiecare dintre cei trei primeri utilizati s-a realizat o reactie de PCR-
RAPD separata, intr-un volum final de 20μl,
Probele au fost supuse urmatorului ciclu de amplificare (Tabelul 3)
 Electroforeza, vizualizarea si fotografierea.

Dupa amplificare, produsii de reactie au fost amestecati cu tampon de

incarcare (40% glycerol, 0.01% albastru de brom fenol, 0.01% xilen cianol)
si aplicati pe un gel de agroza 2% in TBE 1X (100mM Tris, 2mM Na2EDTA,
~50mM acid boric, pH 8.3) cu 0.5μg/ml bromura de etidiu. Gelul a fost
supus electroforezei pentru 2 ore la 8V/cm. Vizualizarea s-a realizat pe un
transiluminator UV standard. Fotografierea gelului s-a realizat cu un aparat
Polaroid cu un film de tip 667, cu 1 secunda timp de expunere, diafragma
11.

Rezultate si discutii
In urma electroforezei produsilor de amplificare s-a obtinut urmatorul profil
de benzi

se observa ca pentru ambele probe examinate, primerii P2 si P3 nu

au produs nici un produs de amplificare. Nefunctionarea unor primeri intr-o
reactie PCR-RAPD este o situatie normala; motiv pentru care, in fiecare
caz in parte, primerii trebuiesc testati pentru a se constata randamentul in
reactie. Nu se poate stabili o corelatie intre temperatura de aliniere si/sau
continutul GC al fiecarui primer si randamentul sau in aceasta reactie.
Primerul P1 a produs in ambele cazuri un model de benzi asemanator, cu
produsi de reactie de aprox. 550bp, 450bp, respectiv 350bp. Studii
ulterioare pe un numar mai mare de indivizi vor evidentia daca primerul P1
produce modele diferite de benzi in cazul unor indivizi fata de altii. Aceasta
situatie ar face primerul P1 potrivit pentru utilizarea sa pentru generarea
unor markeri RAPD la specia Nyctalus noctula (Chiroptera).
Utilizarea PCR in diagnosticul prenatal

Diagnosticul prenatal are importanta pentru starea de sanatate a mamei dar mai
ales a fatului acesta putind fii purtatorul unor afectiuni grave care-i pun in pericol
atat calitatea vietii postpartum cat si viata in sine.

  Fatul poate fi purtatorul unor afectiuni mostenite de la parinti ,purtator de novo a

unei anomalii cromozomiale sau la nivel de gena , materialul sau genetic poate fii
modificat cu aparitia unor grave malformatii dupa infectii dobandite in timpul
sarcinii toate avand ca substrat  anomalii numerice sau structurale ale
cromozomilor si modificari ale genelor.

  Studiul acestor afectiuni cu rasunet cromozomial s-a facut mult timp prin metoda
cariotiparii care consta in prelevarea lichidului amniotic si punerea acestuia in
mediu de cultura cu obtinerea de metafaze si studierea lor. Metoda este eficienta si
inca  isi mentine actualitatea dar prezinta o serie de dezavantaje –timpul
indelungat pana la rezultate –in medie doua saptamani,sensibilitatea si
specificitatea relativ redusa a acestei metode in comparatie cu noile metode de
studiu molecular,aceasta metoda da informatii numai despre anomaliile
cromozomiale fara sa poata da informatii despre modificarile aparute la nivelul
genelor.

Folosirea  PCR in diagnosticul prenatal poate fi utila in

1)-determinarea anomaliilor cromozomiale –prima aplicatie

2)-in diagnosticul patologiei infectioase de sarcina care poate determina modificari

la nivelul fatului

3)-in decelarea unor boli congenitale s-au dobandite cu substrat genetic .

Biblografie :

: www.medicina-materno-fetala.ro

Student: Ganame Tamer

MG An 2
Gr 3