BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari mengenai makhluk hidup yang
mikroskopis dan tidak dapat dilihat mata biasa. Untuk itu, dalam melakukan analisis
mikrobiologi dikenal sebutan analisis mikroskopis, yaitu analisis yang dilakukan
terhadap jasad renik yang tidak terlihat oleh mata biasa. Oleh karena itu, butuh alat
bantu yang digunakan agar kita dapat melihat jasad renik tersebut.
Mikroskop adalah salah satu alat bantu yang digunakan untuk melakukan analisis
mikroskopis. Dalam penggunaannya, sebelumnya harus dipersiapkan preparat untuk
analisis mikroskopis. Jika kita ingin mempelajari mikroorganisme individual, kita
harus dapat memeriksa sel-sel tunggal. Untuk dapat melakukannya, kita harus
mengoleskan sel-sel tunggal tersebut dan melihatnya melalui mikroskop.
Sel bakteri dan mikroorganisme lainnya diamati dengan bantuan mikroskop.
Terutama sel bakteri selain selnya sangat kecil, juga transparan dan tidak berwarna.
Setelah metode pewarnaan diketahui dan dikembangkan. Pengamatan bakteri menjadi
lebih muda. Bahkan hasil pewarnaan itu dapat digunakan untuk pewarnaan lebih
lanjut dan mendalam. Diantaranya digunakan dalam penentuan jenis atau identifikasi.
Banyak metode pewarnaan yang dapat dilakukan dan setiap metode mempunyai
tujuan-tujuan tertentu. Untuk itu, analisis mikroskopis akan dibahas lebih lanjut di
makalah ini.
1.2 Rumusan Masalah
Adapun rumusan masalah dari makalah ini adalah sebagai berikut.
- Bagaimanakah penggunaan mikroskop untuk melakukan analisis
mikroskopis ?
- Bagaimanakah persiapan smear, pewarnaan sederhana, dan penempelan zat
basah ?
- Bagaimanakah pewarnaan diferensial dilakukan ?
- Bagaimanakah pewarnaan diferensial tambahan dilakukan ?
1.3 Tujuan
 Adapun tujuan dari pembuatan makalah ini adalah sebagai berikut.
- Mengetahui prosedur penggnaan mikroskop
- Mengetahui proses-proses persiapan smear, pewarnaan sederhana, dan
penempelan zat basah
- Mengetahui proses pewarnaan diferensial
- Mengetahui proses pewarnaan diferensial tambahan
1.4 Prinsip
1.5 Manfaat
Adapun manfaat pembuatan makalah ini adalah menambah ilmu dan wawasan
mengenai analisis mikroskopis bagi penyusun pada khususnnya dan bagi pembaca
pada umumnya.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Mikroskop

Bagian-bagian dari mikroskop cahaya: 1. lensa okuler, 2. lensa objektif, 3. lensa objektif
yang lain, 4. pengatur fokus, 5. pengatur fokus secara halus, 6. papan letak
objek/sampel/preparat yang dilihat, 7. sumber cahaya, 8. kondensor cahaya, 9. penjepit
sampel

Mikroskop cahaya atau dikenal juga dengan nama "Compound light microscope"
adalah sebuah mikroskop yang menggunakan cahaya lampu sebagai pengganti cahaya
matahari sebagaimana yang digunakan pada mikroskop konvensional. Pada mikroskop
konvensional, sumber cahaya masih berasal dari sinar matahari yang dipantulkan dengan
suatu cermin datar ataupun cekung yang terdapat dibawah kondensor. Cermin ini akan
mengarahkan cahaya dari luar kedalam kondensor.

Jenis lensa
Mikroskop cahaya menggunakan tiga jenis lensa, yaitu lensa obyektif, lensa okuler, dan
kondensor.

Lensa obyektif dan lensa okuler terletak pada kedua ujung tabung mikroskop sedangkan
penggunaan lensa okuler terletak pada mikroskop bisa berbentuk lensa tunggal
(monokuler) atau ganda (binokuler). Pada ujung bawah mikroskop terdapat tempat
dudukan lensa obyektif yang bisa dipasangi tiga lensa atau lebih. Di bawah tabung
mikroskop terdapat meja mikroskop yang merupakan tempat preparat.

Sistem lensa yang ketiga adalah kondensor. Kondensor berperan untuk menerangi obyek
dan lensa-lensa mikroskop yang lain.

Cara kerja
• Lensa obyektif berfungsi guna pembentukan bayangan pertama dan menentukan
struktur serta bagian renik yang akan terlihat pada bayangan akhir serta
berkemampuan untuk memperbesar bayangan obyek sehingga dapat memiliki
nilai "apertura" yaitu suatu ukuran daya pisah suatu lensa obyektif yang akan
menentukan daya pisah spesimen, sehingga mampu menunjukkan struktur renik
yang berdekatan sebagai dua benda yang terpisah.

• Lensa okuler, adalah lensa mikroskop yang terdapat di bagian ujung atas tabung
berdekatan dengan mata pengamat, dan berfungsi untuk memperbesar bayangan
yang dihasilkan oleh lensa obyektif berkisar antara 4 hingga 25 kali.

• Lensa kondensor, adalah lensa yang berfungsi guna mendukung terciptanya

pencahayaan pada obyek yang akan dilihat sehingga dengan pengaturan yang
tepat maka akan diperoleh daya pisah maksimal.
Jika daya pisah kurang maksimal maka dua benda akan terlihat menjadi satu dan
pembesarannyapun akan kurang optimal.

Preparasi sediaan

Persiapan preparat di dalam mikroskop cahaya terbagi menjadi dua jenis, yaitu :

• Preparat Non-permanen, yang dapat diperoleh dengan menambahkan air pada

sel hidup di atas kaca objek, kemudian diamati di bawah mikroskop.
• Preparat permanen, yang dapat diperoleh dengan melakukan fiksasi yang
bertujuan untuk membuat sel dapat menyerap warna, membuat sel tidak bergerak,
mematikan sel, dan mengawetkannya.
• Tahap selanjutnya, yaitu pembuatan sayatan, yang bertujuan untuk memotong
sayatan hingga setipis mungkin agar mudah diamati di bawah mikroskop. preparat
dilapisi dengan monomer resin melalui proses pemanasan karena pada umumnya
jaringan memiliki tekstur yang lunak dan mudah pecah setelah mengalami fiksasi,
kemudian dilanjutkan dengan pemotongan menggunakan mikrotom. Umumnya
mata pisau mikrotom terbuat dari berlian karena berlian tersusun dari atom karbon
yang padat. Oleh karena itu, sayatan yang terbentuk lebih rapi. Setelah dilakukan
penyayatan, dilanjutkan dengan pewarnaan, yang bertujuan untuk memperbesar
kontras antara preparat yang akan diamati dengan lingkungan sekitarnya. Setiap
pewarna mengikat molekul yang memiliki kespesifikan tertentu, contohnya :
Hematoksilin, yang mampu mengikat asam amino basa (lisin dan arginin) pada
berbagai protein, dan eosin, yang mampu mengikat molekul asam (DNA dan
rantai samping pada aspartat dan glutamat).

2.2 Persiapan Smear, Penempelan zat basah, dan Pewarnaan Sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak

digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk
mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan
basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat
alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel
bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah
memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin.

2.3 Pewarnaan

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal
tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat
terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi.

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen
selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen.
Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun
pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam
dan pewarna basa

Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif.
Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif,
sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka
sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif. Contoh pewarna asam
misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan
basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh
dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna
basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lain.

Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa
pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan
untuk mengamati morfologi, baik bentukmaupun susunan sel. Teknik pewarnaan
yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang
lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri
gram positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam.
Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora dan
nukleus.

Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan
bekerja serta mengikuti aturan dasar yang belkau yakni sebagai berikut:
mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk
membuat apusan dari bakteri yang diwarnai.

mempersiapkan apusan.

Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis.
Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat.

Biakan Cair.

Suspensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca
obyek. Lalu diapuskan pada kaca obyek selebar ... cm. Biarkan mengering diudaraata
diatas api kecil dengan jarak 25 cm.

Biakan Padat.

Bakteri yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan
seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca
obyek, lalu denganjarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada
tetesan air dan apusan. Biarkan mengering diudara.

Fiksasi dengan pemanasan.

Apusan bakteri pada akaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat, dapat terhapus
pada waktu proses pewarnaan lebih lanjut. Proses peletakan apusan pada kaca obyek
dapat dilakukan diantaranyadengan cara memanaskan diatas api.
 2.4 Macam-Macam Pewarnaan
1. Pewarnaan sedehana
- Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)
- Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang
kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi
jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri
dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel
bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)).
2. Pewarnaan diferensial
- menggunakan lebih dari satu macam zat warna
- Tujuan untuk membedakan antar bakteri
- Contoh: Pw. Gram, Pw. Bakteri Tahan Asam
Pewarnaan Diferensial terdiri dari :
1. Pewarnaan Gram

Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas
dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram
negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen
pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai
dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent).
Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen
dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila
komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci.
Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna
pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.
Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri
itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara
keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan
terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai
adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat
dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).
Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus
pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar
dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan
indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar
belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat
warna (Hadioetomo, 1990).
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan
dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan
untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam
sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah
satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran
100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel
bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan
menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan
membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka.
Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang
berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif.
Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna
memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan
negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara
lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll.
Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).
Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur
pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.
- Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.
- Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.
Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan
mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) :
- Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek.
- Fiksasi olesan pada kaca objek.
- Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna
atau reagen (pewarnaan diferensial.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung
(bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni).
Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.
- Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
- Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
- Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia
yang ada akan dapat diketahui.
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan
memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut
berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan
mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita
memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985).

2. Pewarnaan Acid-Fast

3. Pewarnaan Granula Metakromatik

Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatikyang terdiri atas

volutin,granula glikogen serta granula lemak. Granula metakhromatik sering
ditemukan pada jenis-jenis kuman patogen tertentu dan berbentuk khas untuk kuman
tersebut. Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik yang tersebut
di dalam sediaan mikroskopik. Misalnya kuman difteri mempunyai granula
metakhromatik karena bila diwarnai dalam sediaan, granula tersebut akan berwarna
lain dari pada zat warna yang digunakan. Misalnya bila diwarnai sediaan kuman
difteri dengan zat warna biru metilen,granula Babes-Ernst akan berwarna coklat tua.
Pada spesies kuman tertentu, granula metakhromatik terletak pada tempat-tempat
khas di dalam sel kuman.
Disamping material nukleus, sitoplasma bakteri mungkin mengandung inklusi sel-
kepingan-kepingan kecil material yang tidak menjadi bagian utuh struktur sel. Butiran
khusus ini yang rupanya bertindak sebagai sumber fosfat dan energi disebut butiran
metakromat karena akan menyerap warna merah apabila diwarnai dengan biru
metilen. Butiran metakromat disebut juga kolektif volutin.
Pewarnaan Granula dapat dilakukan dengan metode selain Neisser yaitu :
1. Metode Albert’s
2. Metode Much Weis (Mycobacterium tuberculose).

3. Pewarnaan khusus
- Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri→ kapsul, spora, flagel dll

Pewarnaan Khusus terdiri dari :

1. Pewarnaan Negatif

Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat
dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan
mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar
belakang hitam (Campbell dan Reece, 2005).
Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri.

2. Pewarnaan Kapsul

Beberapa jenis bakteri dan amoeba hijau-biru mengeluarkan bahan-bahan

yang amat berlendir dan lengket pada permukaan selnya, melengkungi
dinding sel. Bila bahan berlendir tersebut kompak dan tampak sebagai suatu
bentuk yang pasti ( bundar/lonjong) maka disebut kapsul, tetapi bila tidak
teratur bentuknya dan menempelnya pada sel kurang erat maka disebut selaput
lendir.
Kapsul dan lendir tidaklah esensial bagi kehidupan sel, tapi dapat berfungsi
sebagai makanan cadangan, perlindungan terhadap fagositosis ( baik dalam
tubuh inang maupun dialam bebas ) atau perlindungan terhadap dehidrasi.
Kemampuan menghasilkan kapsul merupakan sifat genetis, tetapi produksinya
sangat dipengaruhi oleh komposisi medium tempat ditumbuhkannya sel-sel
yang bersangkutan. Komposisi medium juga dapat mempengaruhi ukuran
kapsul. Ukuran kapsul berbeda-beda menurut jenis bakterinya dan juga dapat
berbeda diantara jalur-jalur yang berlainan dalam satu spesies.
Pada beberapa jenis bakteri adanya kapsul sebagai petunjuk virulensi. Semua
kapsul bakteri tampaknya dapat larut dalam air. Komposisi kimiawi kapsul
ada yang berupa glukosa ( misalnya dektrosa pada leokonostok
mesendteroides), polimer gula amino (misalnya asam hialuronat pada
Staphylococcus piogenik), polipeptida (misalnya polimer asam D-glutamat
pada Bacillus antraksis) atau kompleks polisakarida protein ( misalnya B
disentri).
Simpai biasanya diperlihatkan dengan cara pewarnaan negatif atau modifikasi
dari cara itu. Salah satu pewarnaan simpai (kapsul) ini ( metode Welch)
meliputi pemberian larutan kristal ungu panas disusul kemudian dengan
pencucian dengan larutan tembaga sulfat. Tembaga sulfat ini digunakan untuk
menghilangkan zat warna berlebihan karena pencucian biasa dengan air akan
melarutkan simpai. Garam tembaga memberi pula warna pada latar belakang,
sehingga sel dan latar belakang akan tampak biru tua dan simpai berwarna
biru yang lebih muda.

3. Pewarnaan Spora

Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan
diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar baik lagi
bagi mereka, maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. Spora
lazim disebut endospora ialah karena spora itu dibentuk di dalam sel.
Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk dari pada
bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif. Sporulasi dapat dicegah,
jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru.
Endospora dibuat irisan dapat terlihat terdiri atas pembungkus luar, korteks
dan inti yang mengandung struktur nukleus. Apabila sel vegetatif membentuk
endospora, sel ini membuat enzim baru, memproduksi dinding sel yang sama
sekali baru dan berubah bentuk. Dengan kata lain sporulasi adalah bentuk
sederhana diferensiasi sel, karena itu, proses ini diteliti secara mendalam
untuk mempelajari peristiwa apa yang memicu perubahan enzim dan
morfologi.
Spora biasanya terlihat sebagai badan-badan refraktil intrasel dalam sediaan
suspensi sel yang tidak diwarnai atau sebagai daerah tidak berwarna pada sel
yang diwarnai secara biasa. Dinding spora relatif tidak dapat ditembus, ini
pula yang mencegah hilangnya zat warna spora setelah melalui pencucian
dengan alkohol yang cukup lama untuk menghilangkan zat warna sel
vegetatif. Sel vegetatif akhirnya dapat diberi zat warna kontras. Spora
biasanya diwarnai dengan hijau malachit atau carbol fuchsin.
Spora kuman dapat berbentuk bulat, lonjong atau silindris. Berdasarkan
letaknya spora di dalam sel kuman, dikenal letak sentral,subterminal dan
terminal. Ada spora yang garis tengahnya lebih besar dari garis tengah sel
kuman, sehingga menyebabkan pembengkakan sel kuman.

4. Pewarnaan Flagella

Tujuan
Mempelajari dasar dasar kimiawi dan kinerja prosedur pewarnaan flagella

BAB III

METODE

BAB IV

KESIMPULAN DAN SARAN