Práctica 1

Unidad 1. Introducción

Métodos y Técnicas Bioquímicas:

CENTRIFUGACIÓN1

A) OBJETIVOS

1. Analizar las bases teóricas de la Centrifugación y la utilidad de

ésta herramienta bioquímica.
2. Describir el manejo correcto de la centrifuga clínica.
3. Obtener suero y plasma sanguíneo.
4. Obtener un filtrado libre de proteínas.

PRERREQUISITOS

1. Conceptos básicos del movimiento circular.

2. Investigar la estructura y modo de acción del EDTA, del oxalato de sodio y del citrato de sodio en
la obtención de plasma, así como la concentración recomendada para usarlas como
anticoagulantes.

1. INTRODUCCIÓN

La Bioquímica es una disciplina experimental que pretende describir la estructura, organización y

funciones de las moléculas que forman a los seres vivos, así como los procesos que dirigen su
degradación y síntesis, en este sentido la Centrifugación es un método muy útil, pues permite separar
células, organelos y biomoléculas, en virtud de sus diferentes tamaños, pesos e inclusive formas, al
someterlas a determinadas fuerza de gravedad y velocidad relativamente altas.
El campo centrífugo (G), es la fuerza responsable del empuje que del centro a la periferia
experimentan los cuerpos que se mueven en una trayectoria circular, lo que ocasiona que un
determinado peso sea desplazado en dirección radial hacia fuera y sedimente. G está determinado
por la velocidad angular (w, rad s-1) del rotor y la distancia radial (r, cm) de la partícula al eje de
rotación, de acuerdo a la ecuación 1:

G = w2 r (1)

Si en la ecuación (1) se sustituye el valor de velocidad angular del rotor (w) en revoluciones por minuto
2πrpm
(rpm), [ w = ], queda la ecuación (2):
60

4π 2 ( rpm ) 2 r (2)
G=
3600
El campo centrífugo (G) es expresado generalmente en múltiplos de la
aceleración de la gravedad (g, 980 cm s-2) y se conoce como Campo
1
Universidad Autónoma Chapingo. Depto. de Zootecnia. Curso de Bioquímica 2011.

1
Centrífugo Relativo (RCF), de modo que si consideramos que la velocidad del rotor está en rev min-1
y es de 10 000 rpm y el radio de rotación o distancia radial “r” desde el centro de rotación al centro de
la columna de líquido en el tubo de centrífuga es de 5 cm, entonces al sustituir en la ecuación 3,
queda que el RCF es 5550 veces la aceleración de la gravedad (5550 g).

4π 2 ( r. p.m.) 2 r
R.C .F . = =1.11 x10 −5 ( rpm ) 2 r (3)
(3600 )( 980 )

Las gráficas denominadas nomogramas, combinan tres variables en forma de columna, de manera
que relacionando dos de ellas, es posible conocer la tercera. El nomograma utilizado en la
centrifugación (Fig 1), relaciona, el RCF, la velocidad del rotor (rpm) y el radio promedio de rotación
(r, cm), de manera que si se conocen, el radio y la velocidad, es posible estimar a partir de estos, el
campo centrífugo relativo (RCF) aplicado. En la figura 1 se indica que un RCF de 600 g se puede
conseguir con un rotor de 6 cm de radio y una velocidad de 3 000 rpm. Este valor de RCF se puede
confirmar, si se sustituyen los datos de radio y velocidad en la ecuación 3.

Figura 1. Nomograma que relaciona el radio, el campo centrífugo relativo, RCF y la velocidad del
rotor. (Williams B. y K. Wilson, 1976. Principles y Techniques of Practical Biochemistry.London: E.
Arnold).

En función de la magnitud del RCF, las centrífugas se clasifican en: centrífugas clínicas (500 - 4000
g), super centrífugas (4000 - 20 000 g) y ultra centrífugas (30 000 - 500 000 g).

2
En una centrífuga, las partículas a separar están normalmente en un medio líquido, contenido en un
recipiente llamado “camisa”, el que se coloca en el rotor.

En la figura 2 se presenta un esquema para separar por centrifugación, los diferentes componentes
de un homogenado de tejido. Así, para obtener células enteras se deberá aplicar al homogenado un
RCF de 600 g y para aislar mitocondrias, lisosomas y peroxisomas, el RCF deberá ser
aproximadamente de 20 000 g.

Figura 2. Esquema de centrifugación diferencial para un homogenado.

(http://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3).

Suero y Plasma

El suero sanguíneo es el líquido amarillento que se obtiene después de

centrifugar a 600 g, la sangre sin anticoagulante (tubo con tapón rojo).
El suero sanguíneo se diferencia del plasma en que no contiene
Fibrinógeno, proteína implicada en la formación del coágulo. En el
suero, el Fibrinógeno se transforma en fibrina, principal constituyente
del coágulo. La formación del coágulo está inhibida en sangre, pues
ésta contiene anticoagulantes naturales. Para obtener plasma, la
centrifugación de la sangre se realiza en presencia de algún
anticoagulante como EDTA (1-2 mg/cm3 de sangre), citrato de sodio,
oxalato de sodio o heparina, esto en función del análisis a realizar. Los
tubos con tapón morado contienen EDTA. El líquido amarillento
obtenido después de centrifugar a 600 g, representa el plasma
sanguíneo.
Debajo del plasma quedan sedimentados los glóbulos blancos, las Fracciones resultantes de
plaquetas y los glóbulos rojos. centrifugar sangre a 600g.

Las precauciones y los procedimientos de conservación de suero/plasma varían en cada caso, según
la naturaleza de la muestra y los parámetros que vayan a determinarse en ella. (Revisar referencias 1
y 4, apartados 4 y 8).

D) MATERIAL Y REACTIVOS

3
  Material
Pipeta Pasteur con bulbo, Centrífuga clínica con camisas para tubos de 13 x 100 mm, Balanza de dos
platillos, Tubos de ensaye de plástico cónicos y redondeados, Gradilla, Piceta, Pipetas graduadas de
1 y 10 cm3, Micropipeta automática, Tubos Vacutainer de 7 ml con tapón rojo y gel acelerador de la
coagulación, tubos con tapón morado, propipeta, regla de 10 cm.

 Reactivos
Sangre completa, Ba(OH)2 5%,
ZnSO4 5%, EDTA al 5%,

Balanza de dos platillos

E) METODOLOGÍA

E.1. Procedimiento para usar la Centrífuga Clínica

1. Los tubos conteniendo el material a centrifugar, se colocan

en las camisas apropiadas y utilizando una balanza de dos
platillos, se equilibran en peso. Esta operación deberá
realizarse en pares. De no seguir esta indicación, se
estará causando daño a la centrífuga. En la igualación de
peso, puede adicionarse agua entre la camisa y el tubo o si
es posible puede adicionarse más del material a centrifugar
al tubo que lo necesite.
2. Las camisas con los tubos, equilibradas en peso, se colocan
en el rotor o cabezal, una frente a otra dentro de la
centrífuga y se inicia la operación de la centrífuga. Esto
deberá hacerse gradualmente, hasta alcanzar la velocidad
requerida. Sí existen problemas de vibración, repetir el Centrífuga y rotor con camisas
balanceo de las camisas con los recipientes conteniendo las
muestras.
2. Permitir que la centrífuga frene por sí sola. ¡No frenar manualmente!, pues se daña el equipo y el
material puede resuspenderse nuevamente. No abrir la centrífuga cuando esté en movimiento.
3. Al final, dejar limpias las camisas, colocarlas en su lugar, desconectar el aparato, acomodar el
cable de forma segura y colocar la centrífuga en su lugar.

E. 2 Obtención de suero sanguíneo (Coles, 1989, Bateman, 1970)

1. Extraer 3 cm3 de sangre y depositarla

cuidadosamente en un tubo de centrífuga
SIN anticoagulante, (tubo con tapón rojo y
con gel acelerador de la coagulación).
2. Dejar coagular la sangre a temperatura ambiente,
por 10 minutos, posteriormente, centrifugar
el contenido del tubo a 600 g por 20 minutos.
3. Separar el suero (fase superior amarillenta),
transferirlo a un tubo de plástico, graduado, seco
y químicamente limpio. Medir el volumen de
suero para calcular el %.
4. Refrigerar el suero a 4°C o en congelación, si Tubos para obtención de: plasma (1er tubo,
este procedimiento no efecta al análisis. tapón morado, suero (2° y 3° tubos, tapón rojo).
E.3 Obtención de plasma sanguíneo http://www.sanmarcovet.it/pagina.asp?
m1=211&m2=1025

4
1. Extraer 3 cm3 de sangre y depositarla cuidadosamente en un tubo de centrífuga CON
anticoagulante. Como anticoagulante pueden usarse oxalato de sodio o Etilendiamino
tetraacético disódico, (EDTA) en una concentración de 1-2 mg por cm 3 de sangre (tubo con tapón
morado). Mezclar suavemente por inversión y centrifugar la mezcla a 600 g, por 20-30 minutos.
NOTA: Verificar el radio de rotación de la centrífuga y la velocidad a aplicar para obtener el RCF
deseado.
2. Con una pipeta Pasteur, transferir el plasma (fase superior amarillenta) a un tubo de plástico,
graduado, limpio y seco. Determinar el volumen de plasma para calcular el %.
3. Refrigerar el plasma a 4°C o congelar, si este procedimiento no efecta al análisis.

E. 4 Preparación de un filtrado libre de proteínas para determinar glucosa2

1. Pipetear 0.5 cm3 de plasma o suero a un tubo de 16 x150 mm. Agregar 1.0 cm3 de ZnSO4 al 5%,
1.0 cm3 de Ba(OH)2 al 5% y 7.5 cm3 de agua destilada. Se observará la formación de un
precipitado consistente principalmente de proteínas.
2. Tapar el tubo muy bien y mezclar fuertemente para romper los grumos
3. Centrifugar el tubo por 10 minutos a 600 g.
4. Con una pipeta Pasteur o con una micropipeta automática o por decantación, transferir el
sobrenadante a un tubo limpio y seco. Este líquido, incoloro y sin partículas, representa un
“Filtrado libre de proteínas”. El suero obtenido mediante este método, queda con una dilución
1:20, la que debe ser considerada en los cálculos para glucosa. Guardar en refrigeración mientras
se realiza el análisis de glucosa.

CÁLCULOS Y RESULTADOS

1. Medir el volumen de suero o plasma y calcular el porciento, multiplicando por 100 el cociente de
dividir, los cm3 de suero/plasma entre los cm3 de sangre. Comparar el % de plasma obtenido con
la diferencia de 100 y el % de Hematocrito. (Consultar referencia 4).

AUTOEVALUACIÓN

1. Explicar las bases del funcionamiento de la centrífuga.

2. Dibujar y describir los componentes principales de la centrífuga.
3. Describir los pasos básicos para el uso correcto de la centrífuga clínica.
4. Definir suero y plasma.
5. Explicar el efecto de la aplicación de un RCF de 600 g sobre la sangre.
6. Obtener el factor de 1.11 x 10-5 de la ecuación 3.
7. Explicar el significado de aplicar un RCF de 5000 g a un homogenado.
8. De acuerdo la metodología propuesta para obtener el Filtrado libre de proteínas, explicar sus
características, su composición y sus posibles usos.
9. Es posible separar membranas plasmáticas a partir de un homogenado de tejido, si se aplica un
campo centrífugo relativo (R.C.F.) de 20,000 g. Utilizando el nomograma, indicar dos condiciones
de radio y velocidad del rotor con las que puede alcanzarse este campo centrífugo relativo.
10. A partir de la ecuación correspondiente, calcular el RCF necesario para separar macromoléculas,
si el radio del rotor es 11 cm y la velocidad de rotor es 35,000 rpm.
11. Describir cómo centrifugaría un homogenado de músculo cardíaco para aislar ribosomas.
12. A partir del experimento E4, explicar el efecto del pH sobre las proteínas.
13. Plantear cómo hacer diluciones de suero 1:3, 1:10 y 1:200, utilizando NaCl al 1%.
14. Para obtener un filtrado libre de proteínas con dilución 1:10, ¿qué cantidades de reactivos y de
suero se deberán medir?

2
Tietz W. N. 1976. Fundamentals of Clinical Chemistry. Philadelphia:W.B. Saunders.

5
15. Definir diez conceptos clave para la presente práctica.

F) BIBLIOGRAFÍA

1. Bateman, J. V. 1970. Nutrición Animal. Manual de Métodos Analíticos. México, D.F.: Herrero,
Hnos. Los capítulos 3 y 14 son especialmente útiles para este curso, pues tratan información
general del laboratorio. Algunos de los métodos empleados en Bioquímica, son descritos en el
capítulo 3. En el capítulo 14, se tratan algunos aspectos sobre la obtención y conservación de las
muestras de sangre, que son de interés para la presente práctica.
2. Coles, H. E. 1989. Diagnóstico y Patología en Veterinaria. 4ª Ed. México, D.F.: Ed. Nueva
Editorial Interamericana. El capítulo 1, expone el material básico para integrar un laboratorio
clínico, así como las observaciones que deben seguirse para obtener una muestra biológica
procedente de un animal enfermo y como enviarla al laboratorio. El capítulo 6 incluye temas
como: recolección y manejo correcto de muestras de sangre, de suero y plasma, filtración y
centrifugación, uso de pipetas, colorimetría y control de calidad, entre otros.
3. Manual de cuidado de equipo de laboratorio clínico. Recuperado el 8 de enero de 2010, de
http://www.scribd.com/doc/529159/Manual-de-Cuidado-de-Equipo-de-Laboratorio-clinico. El
apartado IV contiene algunas recomendaciones sobre el cuidado de la centrífuga, así como sus
principales componentes.
4. García, S. Y. 2009. Composición de la sangre. Recuperado el 14 de enero de 2011 de:
http://www.mailxmail.com/curso-laboratorio-obtencion-muestras/muestras-sangre-extraccion-
procedimientos-previos