Professional Documents
Culture Documents
BIOSINTEZA L-ASPARAGINAZEI
L-asparaginaza este o enzima care, din punct de vedere farmacologic, este activa ca
agent chimioterapic antineoplazic, fiind folosita in special in pediatrie, in tratamentul leucemiilor
limfoblastice acute. Importanta terapeutica a L-asparaginazei se datoreaza actiunii sale
antitumorale si antileucemice. Aceasta se bazeaza pe proprietatea enzimei de a descompune
prin hidroliza L-asparagina in acid L-aspartic si amoniac, oprind dezvoltarea celulelor leucemice
prin carenta in L-asparagina, respectiv prin inhibarea sintezei proteice in celulele tumorale, care
necesita aport de L-asparagina exogena, intrucat sunt lipsite de posibilitatea de a-si sintetiza
acest aminoacid.
Dintre numeroasele microorganisme testate in ceea ce priveste capacitatea de a
produce L-asparaginaza intra- sau extracelular se detaseaza bacteriile E. coli, Erwinia sp.,
Pseudomonas sp., Bacillus subtilis.
La scara industriala L-asparaginaza se obtine prin procedee biotehnologice, utilizand ca
microorganisme producatoare tulpini de E. coli sau Erwinia sp.
Escherichia coli produce doua forme ale acestei enzime, denumite L-asparaginaza 1
(EC1) si L-asparaginaza 2 (EC2), dintre care, doar EC2 poate fi utilizata in mod eficient in
terapia cancerului.
EC2 difera de cealalta forma prin cateva caracteristici biochimice si fizico-chimice, dintre
care cele mai importante sunt prezentate in tabelul urmator:
Mediile de cultivare lichide preparate la nivel de laborator se pot utiliza pentru obtinerea
culturilor de microorganisme ce sunt folosite ca material de insamantare (inocul de laborator) in
bioreactoarele industriale. In cazul in care anumite tulpini de E. coli sunt folosite pentru obtinerea
unor enzime de interes farmaceutic, cum ar fi penicilin-G-acilaza, aspartaza sau asparaginaza,
se recomanda ca in compozitia mediilor de cultura folosite in diferitele trepte de fermentatie sa
se introduca anumite substante (inductori), care favorizeaza biosinteza acestor enzime.
1
Materii prime:
- extract de porumb (50% s.u.)
- sulfat de amoniu (calitate p.a.)
- inductor: L-asparagina
- NaOH 40%
- HCl 2N
Sticlarie si aparatura:
- baloane Erlenmayer (100 – 750 ml)
- fiole de cantarire
- mensura (1 000 ml)
- cilindrii (20 – 1000 ml)
- pipete (1 – 10 ml)
- balanta analitica
- pH-metru sau hartie indicatoare de pH
- autoclav de laborator
Mod de lucru:
In functie de capacitatea baloanelor Erlenmayer in care se va efectua bioprocesul la nivel
de laborator, se prepara un volum de mediu corespunzator unui procent de 20% din volumul
total al balonului.
Compozitia mediului de cultura este urmatoarea:
- extract de porumb - 3,0% (g/v)
- sulfat de amoniu - 0,1% (g/v)
- L-asparagina - 0,05% (g/v)
Se prepara o solutie stoc de extract de porumb (50% g/v S.U.), de concentratie 10%. In
acest scop extractul de porumb se cantareste intr-o fiola de cantarire adecvata, dupa care se
reia cantitativ cu apa comuna intr-o mensura, se omogenizeaza si se aduce la semn, pentru
realizarea concentratiei sus-mentionata. Din aceasta solutie se repartizeaza per balon volumul
corespunzator concentratiei de extract de porumb prevazuta in reteta de mediu. Apoi se prepara
in mod similar solutia stoc de sulfat de amoniu 10% g/v, L-asparagina 1% g/v. De mentionat ca
pentru prepararea solutiilor de inductori este necesara ajustarea pH-ului in domeniul 6,5-7,
pentru dizolvarea completa a substantelor respective.
Din solutiile stoc de sulfat de amoniu si inductori se repartizeaza per balon un volum
corespunzator concentratiei prevazute in formula de mediu pentru ingredientele respective.
Dupa reunirea ingredientelor se corecteaza pH-ul mediului in fiecare balon la valoarea
optima ceruta de microorganism (de regula cu solutie NaOH 40% sau HCl 2N, dupa caz).
In final, dupa corectia pH-ului, solutia se aduce la volumul final corespunzator necesitatilor
respiratorii ale microorganismului (in cazul bacteriei E. coli, facultativ aeroba, se lucreaza cu un
volum de mediu reprezentand 20% din volumul total al balonului).
Baloanele cu mediul de cultura astfel preparat, se inchid cu dopuri bacteriologice, se
acopera cu hartie si se leaga cu sfoara, dupa care se sterilizeaza in autoclav, la 120 0C, timp de
30 min.
2
LP 2. TRASAREA CURBEI ETALON PENTRU DETERMINAREA AZOTULUI CU
REACTIV NESSLER
Principiul metodei
Reactivul Nessler (iodura mercurica de potasiu in mediu alcalin) este utilizat pentru
determinarea colorimetrica a azotului anorganic in concentratii variind in domeniul 5-100 μg N.
Ca solutie standard pentru trasarea curbei etalon se folosese o solutie de (NH 4)2SO4. Reactivul
Nessler reactioneaza cu sarea de amoniu formand o solutie de culoare galbena care se
determina spectrofotometric la λ = 450 nm.
Reactivi si aparatura
- Reactivul Nessler: 4,55 g HgI2 (2,72 g HgCl2) + 3,49 g KI se
dizolva in 5 ml apa distilata. Se cantaresc 11,2 g KOH si se dizolva in 14 ml apa
distilata. Ultima solutie (cea de KOH) se adauga peste solutia de HgI 2 si KI
obtinandu-se o solutie care se aduce intr-un balon cotat la 100 ml cu apa distilata si
se lasa la rece pentru sedimentarea precipitatului format.
- Solutie standard de sulfat de amoniu (0,01M): 10 μmoli
(NH4)2SO4/ml = 20 μmoli NH3/ml (solutie A)
Mod de lucru
Din solutia standard de sulfat de amoniu (solutia A) se prepara o dilutie 1:5 (solutie B)
prin dilutia solutiei A, dupa cum urmeaza: 5 ml solutie standard se aduc la 25 ml intr-un balon
cotat cu apa distilata (solutia B). Din solutia B se prepara dilutii, conform tabelului de mai jos.
In fiecare proba se adauga cate 0,4 ml reactiv Nessler. Dupa agitare, probele se lasa 10
minute, la temperatura camerei pentru “dezvoltarea culorii”, dupa care se citeste densitatea
optica la λ = 450 mn a probelor 1-10 fata de apa distilata. In final, se traseaza curba etalon, in
coordonatele x = nr. μmoli NH3/ml proba si y = extintia la λ = 450 mn.
3
LP 3. DETERMINAREA ACTIVITATII ENZIMATICE A L-ASPARAGINAZEI
Principiul metodei
Metoda utilizata pentru determinarea activitatii enzimatice a L-asparaginazei din mediul
de fermentatie se bazeaza pe principiul determinarii unuia dintre produsii de reactie rezultati din
actiunea enzimei asupra substratului specific.
Determinarea activitatii L-asparaginazei se efectueaza printr-o metoda
spectrofotometrica, bazata pe determinarea amoniacului rezultat in urma actiunii enzimei asupra
L-asparaginei, printr-o reactie de culoare caracteristica acestuia. Amoniacul reactioneaza cu
reactivul Nessler si formeaza un compus colorat a carei absorbtie se determina
spectrofotometric la =450 mn.
Activitatea enzimatica a L-asparaginazei se mai poate determina si prin evidentierea
formarii acidului L-aspartic prin cromatografie pe hartie, urmata de reactia de culoare cu
ninhidrina, stabilizarea coloratiei cu clorura de cadmiu, extractia culorii cu solutie
hidrometanolica si determinarea intensitatii absorbtiei produsului rezultat la λ=550 nm.
O unitate internationala de activitate L-asparaginazica este definita ca fiind cantitatea de
enzima care catalizeaza formarea unui µmol de amoniac/minut in conditii standard de analiza
(L-asparagina 1%, temperatura 370C, pH=5,0, timp de reactie 30 minute).
Reactivi:
- suspensie mediu fermentat de E. coli
- tampon acetat pH=5, 0,1M
- acid tricloracetic 15%
- solutie L-asparagina 1% (in tampon acetat pH=5, 0,1M)
Aparatura si sticlarie:
- baie termostat
- centrifuga
- spectrofotometru UV VIS
- eprubete
- pipete 1, 2, 5, 10 ml
- cuve pentru centrifuga
Mod de lucru:
Protocolul de lucru pentru determinarea activitatii L-asparaginazei este prezentat in
tabelul de mai jos:
Proba Martor
- suspensie enzima 0,25 ml - suspensie enzima 0,25 ml
- tampon acetat 0,1M, pH=5 0,25 ml - tampon acetat 0,1M, pH=5 0,25 ml
- solutie L-asparagina 1% 1,5 ml - TCA 15% 0,5 ml
- solutie L-asparagina 1% 1,5 ml
Incubare la 370C, 30 min
- TCA 15% 0,5 ml
Centifugare 4000 rpm, 20 min
- solutie supernatant 0,1 ml - solutie supernatant 0,1 ml
- apa distilata 9,5 ml - apa distilata 9,5 ml
- reactiv Nessler 0,4 ml - reactiv Nessler 0,4 ml
Citire 450 nm
Lipazele (E.C. 3.1.1.3) sunt enzime care fac parte din clasa hidrolazelor, subclasa
esterazelor (3.1). Esterazele sunt hidrolaze care acţionează asupra legăturilor esterice dintre
acizii organici, acidul fosforic şi acidul sulfuric si diferiţi alcooli sau fenoli.
In functie de provenienta lor, lipazele pot fi clasificate in:
lipaze de origine animala
lipaze de origine vegetala
lipaze de origine microbiana
Lipazele sunt carboxil-ester hidrolaze care se deosebesc de celelalte esteraze prin faptul
ca au proprietatea unica si specifica de actiona la interfata ulei-apa dintr-un mediu eterogen
(emulsii), catalizand reactia de hidroliza a esterilor glicerolului sau a altor alcooli cu acizi grasi cu
catena lunga, cu formare de acizi grasi liberi si glicerina sau alcoolul corespunzator.
Mecanismul hidrolizei trigliceridelor de către lipaze poate fi prezentat prin reacţia:
5
2. Biosinteza lipazelor cu Yarrowia lipolytica
Prepararea inoculului
Mod de lucru:
Din cultura de întreţinere obtinuta anterior se prepară o suspensie în apă distilată sterilă.
2 ml suspensie se însămânţează în 20 ml mediu YPG lichid, repartizat in flacoane Erlenmayer
de 100 ml, sterilizat in prealabil prin autoclavare la 121 0C, 20 minute. Cultura inocul se dezvolta
timp de 20-24 h, la 280C, în condiţii de agitare continuă la 240 rpm.
6
Mediu YPG - lichid (% g/v):
- Glucoza 2%
- Peptona 2%
- Extract de drojdii 1%
pH = 6
Cate 100 ml din mediul astfel preparat se repartizeaza în flacoane Erlenmeyer de 500 ml
si se sterilizeaza prin autoclavare la 1210C, 20 minute. Dupa racire, mediile se insamanteaza cu
inocul, in proprotie 10% si se incubeaza la 28 0C, 48 h, sub agitare intensa la 240 rpm. Periodic
(din 6 in 6 ore) se efectueaza determinari de densitate optica, pH si activitate lipazica in mediul
de fermentatie.
7
LP 5. DETERMINAREA ACTIVITATII LIPOLITICE
Principiul metodei
Determinarea activităţii lipazice se efectueaza titrimetric, prin dozarea acizilor grasi
eliberati in mediul de reactie in urma actiunii enzimei asupra substratului, uleiul de masline.
Cantitatea de acizi grasi formata se determina prin titrare cu o solutie diluata si standadizata de
NaOH, in prezenta de fenolftaleina (viraj incolor → rosu, pH = 8,2 - 10) ca indicator. Volumul
solutiei de NaOH necesar pentru neutralizarea acizilor grasi eliberati este proportionala cu
activitatea lipazica.
O unitate de activitate lipazică este definită ca fiind cantitatea de enzima care elibereaza
prin hidroliza trigliceridelor din uleiul de masline, 1 µmol de acid gras, in conditiile analizei
(temperatura = 370C, pH = 7, timp de reactie = 60 minute).
Reactivi:
1. substrat: ulei de masline preparat sub forma de emulsie in solutie apoasa de guma
arabica
a) se dizolva 16,5 g guma arabica in 130 ml apa distilata.
b) dupa solubilizarea completa se dilueaza pana la 165 ml cu apa distilata.
c) se adauga 20 ml ulei de masline si 15 g gheata sfaramata
d) amestecul obtinut se omogenizeaza bine pe agitator
Observatie: Substratul se prepara proaspat, innainte de utilizare
2. solutie tampon citrat 0,2 M pH = 7
3. solutie de clorura de calciu 0,6%
4. preparat enzimatic: pulbere sau lichid de fermentatie
5. reactiv pt. stoparea reactiei = amestec etanol : acetona (1 :1)
6. solutie de NaOH 0,1M cu factor determinat, preparata cf. FR X
7. solutie indicator de fenolftaleina, preparata cf. FR X
Mod de lucru:
Reactia enzimatica se efectueaza intr-un pahar Erlenmeyer de 100 ml, comparativ cu o
proba martor, conform urmatoarei scheme de lucru:
Proba Martor
10 ml emulsie substrat 10 ml emulsie substrat
2 ml sol. CaCl2 2 ml sol. CaCl2
5 ml sol. tampon citrat 5 ml sol. tampon citrat
1 -5 ml lichid de fermentatie 20 ml reactiv de stopare
- 1-5 ml lichid de fermentatie
0
Incubare 60 minute la 37 C, sub agitare la 170 rpm
20 ml reactiv de stopare -
Titrarea aciditatii cu sol. NaOH 0,1N, in prezenta fenolftaleinei
(0,2 ml fenolftaleina la 20 ml solutie de titrat)
8
Calculul activitatii:
unde: VP = volumul de solutie de NaOH 0,1 N cu care s-a titrat proba (ml)
VM = volumul de solutie de NaOH 0,1 N cu care s-a titrat martorul (ml)
F = factorul solutiei de NaOH 0,1 N
100 = factor care include transformarea volumului de solutie de NaOH 0,1 N in μmoli
acizi grasi corespunzatori
g = cantitatea de enzima pulbere luata in analiza (mg)
v = volumul de lichid de fermentatie luat in analiza (ml).
9
LP 6. PRELUCRAREA POST-BIOSINTEZĂ A MEDIILOR DE FERMENTAŢE
Reactivi:
- lichid de fermentatie continand lipaza, obtinut prin filtrarea mediului integral de
fermentatie cu Yarrowia lipolytica
- sulfat de amoniu cristalizat
Mod de lucru:
Din 100 ml lichid de fermentatie filtrat, se preleveaza 2 ml pentru dozarea proteinelor.
Restul de 98 ml se raceste la +5...+100C si sub agitare continua si racire se incepe adaugarea
trepta a 17,15 g sulfat de amoniu (1 g/min). Dupa dizolvarea completa a sarii, precipitarea se
perfecteaza prin stationare la +40C, timp de 30 minute.
10
Suspensia rezultata se centrifugheaza la 4.000 rpm, 15 minute, iar sedimentul obtinut
(fractia P1) se reia in 25 ml apa pentru determinarea continutului in proteina si a activitatii
enzimatice. In supernatant (volum 100 ml) se adauga 19 g sulfat de amoniu, care se dizolva prin
agitare, in conditiile sus mentionate. Dupa 30 minute, fractia P2 a proteinelor precipitate in
domeniul de saturatie 30-60% se separa prin centrifugare. Precipitatul este reluat in 25 ml, iar in
solutie este determinata concentratia proteica si activitatea enzimatica. La un volum de 100 ml
supernatant se adauga 21,5 g sulfat de amoniu, iar dupa dizolvarea sarii si perfectarea
precipitarii se procedeaza la centrifugarea suspensiei timp de 15 minute la 10.000 rpm.
Supernatantul (care reprezinta o solutie salina saturata 90% in sulfat de amoniu) se arunca, iar
precipitatul, care reprezinta fractia P3 (a proteinelor precipitate in domeniul de saturatie 60%-
90%) este reluat in aproximativ 25 ml apa distilata. De asemenea, in fractia P 3 este determinata
concentratia proteica si activitatea enzimatica.
11
LP 7. Purificarea lipazelor prin fractionare cu solventi organici
Reactivi:
- lichid de fermentatie continand lipaza, obtinut prin filtrarea mediului integral de
fermentatie cu Yarrowia lipolytica
- acetona p.a / alcool etilic
Mod de lucru:
100 ml lichid de fermentatie se introduc intr-un pahar Erlenmeyer de 250 ml si se racesc
la +40C. Cand se atinge temperatura data, se incepe adaugarea a 300 ml acetona sau alcool
etilic, prin picurare, sub agitare. Dupa adaugarea intregii cantitati de solvent, suspensia se
mentine static, timp de 2 ore, la rece, pentru perfectarea precipitarii. Suspensiile cu enzima
precipitata sunt separate prin centrifugare la 4.000 rpm, 15 minute. Sedimentul se spala cu
solvent si se recentrifugheaza la 4.000 rpm, 15 minute, dupa care se reia intr-un volum minim de
solutie de CaCl2 0,6% si se analizeaza din punctul de vedere al concentratiei proteice si al
activitatii enzimatice.
12