LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN SEL BAKTERI

Oleh:

Nama : Anggy Anggraeni Wahyudhie

Nim : 0808505002

Kelompok : II

Tanggal Praktikum : 5 April 2010

Asisten : Ni Komang Sri Indrawati

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2010
 I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri dapat dilihat tanpa pewarnaan dengan menggunakan mikroskop. Namun karena
ukurannya kecil dan tidak berwarna, sulit mengamatinya dengan teliti. Maka, untuk dapat
mengamati bakteri secara jelas diperlukan pewarnaan terhadap bakteri tersebut (Entjang,
2003). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri,
memperjelas ukuran jazad, mengamati struktur luar dan dalam sel bakteri dan melihat reaksi
jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui.
Berhasil tidaknya pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan
yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam) (Ramona dkk., 2007).
Pada umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh
ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna
dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna bersifat asam dan basa. Jika ion yang
mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa dan bila
ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna asam
(Ramona dkk., 2007).
Cara pewarnaan dapat dibedakan menjadi tiga, yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan
diferensial dan pewarnaan khusus. Pewarnaan sederhana meliputi pewarnaan langsung dengan
pewarna asam dan basa (meteline blue, kristal violet atau karbol fuhsin) dan pewarnaan tidak
langsung menggunakan nigrosin/tinta cina. Pewarnaan diferensial salah satunya adalah
pewarnaan gram (Pratiwi, 2008). Prinsip dasar pewarnaan ini adalah pewarna dasar, fiksasi
warna, penghapusan warna dan pewarnaan kembali dengan pewarna pembanding. Pewarnaan
gram membagi bakteri menjadi bakteri gram positif dan negatif. Pewarnaan endospora dengan
pewarna utama malakit hijau termasuk pewarnaan khusus (Ramona dkk., 2007)

1.2 Tujuan
1. Untuk mengetahui tujuan pewarnaan sel bakteri.
2. Untuk mengetahui metode-metode yang digunakan dalam pewarnaan sel bakteri.
3. Untuk mengetahui pengaruh pewarnaan terhadap bakteri.
4. Untuk mengetahui bentuk sel bakteri hasil isolasi setelah dilakukan pewarnaan.
5. Untuk mengetahui perbedaan warna antara bakteri gram positif dan gram negatif.
 II. MATERI DAN METODE

Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri menggunakan metode pewarnaan
langsung, pewarnaan tidak langsung dan pewarnaan gram. Sampel bakteri yang digunakan
adalah bakteri hasil isolasi, yaitu bakteri Bacillus, Streptococcus pyogenes dan E. coli.
Langkah pewarnaan langsung diawali dengan meletakkan sebuah kaca objek yang bebas lemak
diatas meja kerja kemudian diteteskan setetes air di tengah-tengah kaca objek tersebut. Dengan
menggunakan jarum ose yang telah dipanaskan pada nyala api lampu bunsen, ambil sedikit
biakan bakteri hasil isolasi yang berada pada medium agar miring di dalam tabung reaksi.
Selanjutnya buat apusan bakteri pada air yang diletakkan pada kaca objek dengan cara
menggesek-gesekkan jarum ose yang berisi bakteri sehingga didapatkan suatu campuran yang
tipis dan merata. Kaca objek yang berisi apusan dari bakteri difiksasi di atas nyala api bunsen
dengan jarak sekitar 30 cm dari nyala api agar tidak merusak bentuk sel bakteri. Kemudian
teteskan dengan pewarna kristal violet yang akan mewarnai sel dalam 10 detik. Lalu cuci
dengan air mengalir dan dikeringkan dengan meletakkan kaca objek diantara kertas tisu. Amati
dengan mikroskop pada perbesaran bervariasi antara 10x10 hingga 100x10 dengan
menggunakan minyak emersi dan dicatat serta digambar bentuk dan warna sel yang diamati.
Pada pewarnaan tidak langsung, tinta cina diteteskan pada pinggir ujung kaca objek dan
dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan, ambil sedikit biakan bakteri hasil isolasi
di dalam tabung reaksi yang berisi medium agar miring. Kemudian suspensikan bakteri
tersebut pada tinta cina di atas permukaan kaca objek. Ratakan suspensi bakteri dalam tinta
cina pada permukaan kaca objek menggunakan kaca objek yang lain. Biarkan mengering pada
suhu kamar dan kemudian diamati dengan mikroskop pada perbesaran 10x10 hingga 100x10
menggunakan minyak emersi. Bentuk sel yang terlihat digambar pada lembar pengamatan.
Pada pewarnaan gram, tahap pertama adalah membuat apusan bakteri isolasi dalam 1
tetes air pada permukaan kaca objek yang kering dan bersih. Kaca objek kemudian difiksasi di
atas nyala api bunsen hingga air mengering, lalu diwarnai dengan larutan kristal violet selama
1-1,5 menit lalu dicuci dengan air suling. Selanjutnya tetesi dengan garam iodine dan dibiarkan
selama 1 menit. Dicuci dengan larutan alkohol 95% sampai warnanya terhapus (kira-kira 30
detik), lalu diwarnai dengan safranin selama 5-15 menit, dicuci kembali dengan air dan
keringkan di atas nyala api bunsen. Setelah kering, amati di bawah mikroskop dengan
perbesaran 10x10 hingga 100x10 menggunakan minyak emersi. Hasil pengamatan digambar.
 III. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil Pengamatan

Tabel Hasil Pengamatan Pewarnaan Bakteri
Pewarnaan
Kelompok Bakteri PTL PL PG Keterangan

I Bacillus Bakteri berbentuk

batang, gram (-)
Perbesaran: 10x10 10x10 10x10

II Streptococcus Bakteri berbentuk

pyogenes rantai, gram (+)
Perbesaran: 40x10 40x10 40x10

III Bacillus Bakteri berbentuk

batang, gram (+)
Perbesaran: 40x10 40x10 40x10

IV Streptococcus Bakteri berbentuk

pyogenes bulat berantai,
Perbesaran: 100x10 100x10 100x10 gram (+)

V E. coli Bakteri berbentuk

batang, gram (-)
Perbesaran: 40x10 40x10 40x10

VI E. coli Bakteri berbentuk

batang, gram (-)
Perbesaran: 40x10 40x10 100x10
Keterangan: PTL = Pewarnaan Tidak Langsung ; PL = Pewarnaan Langsung ; PG =
Pewarnaan Gram
3.2 Pembahasan
Pada praktikum pewarnaan bakteri digunakan 3 metode pewarnaan, yaitu pewarnaan
langsung, pewarnaan tidak langsung dan pewarnaan gram. Untuk setiap sampel bakteri hasil
isolasi yaitu bakteri Bacillus, Streptococcus pyogenes dan E.coli akan diwarnai dengan ketiga
cara pewarnaan tersebut dengan masing-masing pewarnaan dilakukan pengulangan sekali lagi
sebagai pembanding hasil dari pewarnaan sebelumnya dengan teknik yang sama.
Pewarnaan langsung dilakukan dengan menggunakan satu larutan warna yaitu kristal
violet. Setelah proses pewarnaan selesai dan ketiga bakteri diamati di bawah mikroskop dengan
perbesaran bervariasi yaitu 10x10 hingga 100x10 menggunakan minyak emersi untuk
memperjelas bentuk sel yang diamati, didapatkan data pengamatan untuk bakteri Bacillus
merupakan bakteri yang berbentuk basil (batang) dengan warna ungu. Hasil yang sama juga
diperoleh pada pengulangan pewarnaan Bacillus sebagai data pembanding. Bakteri
Streptococcus pyogenes di bawah mikroskop berbentuk coccus yang membentuk untaian
menyerupai rantai dengan warna ungu, namun pada pengulangan pewarnaan yang kedua selain
bakteri berbentuk coccus, ditemukan juga bakteri berbentuk batang. Hal ini menandakan
bahwa sampel bakteri Streptococcus pyogenes telah terkontaminasi dengan bakteri lain yang
berasal dari udara atau dari jarum ose yang kurang steril saat dipanaskan. Bakteri E.coli
menunjukkan bentuk basil (batang) seperti Bacillus dengan warna ungu. Pengulangan
pewarnaan sebagai pembanding pada bakteri E.coli menunjukkan hasil yang serupa seperti
pewarnaan pada pengulangan pertama. Bakteri dapat terwarnai oleh pewarna basa disebabkan
sitoplasma bakteri kaya akan asam amino dan mengandung muatan negatif seperti kelompok
fosfat, sifat ini yang bereaksi dengan zat warna bermuatan positif (Jawetz et al, 2005). Selain
sitoplasma, sel bakteri juga mempunyai komponen dinding sel yang relatif bermuatan negatif
sehingga mudah berikatan dengan ion bermuatan positif yang berasal dan zat warna dan
menyebabkan bakteri menjadi terwarnai (Kawuri dkk., 2007).
Pada pewarnaan tidak langsung digunakan tinta cina sebagai pewarna utama. Prinsip
dasar dari pewarnaan ini adalah pewarna asam sehingga daya pewarnaannya ada pada ion
negatif yang ditolak oleh sitoplasma sel yang bermuatan negatif, sehingga zat warna ini akan
berikatan dengan lingkungan yang mengelilingi sel dan bagian dalam sel akan tetap berwarna
bening (Ramona dkk., 2007). Selain itu, pada pustaka juga disebutkan bahwa bakteri
merupakan organisme mikroseluler yang pada dinding selnya mengandung ion negatif zat
warna (tinta cina), sehingga pewarna ini tidak akan mewarnai sel tetapi mewarnai lingkungan
luarnya saja (Entjang, 2003). Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran
10x10 hingga 100x10 menggunakan minyak emersi agar bentuk sel semakin jelas terlihat.
Hasil yang diperoleh telah sesuai dengan pustaka, sebab bakteri Bacillus menunjukkan bentuk
batang (basil) dengan warna bagian dalam sel bening, bakteri Streptococcus pyogenes
berbentuk coccus (bulat) dengan warna bening dan bakteri E. coli berbentuk basil (batang)
dengan warna bagian dalam sel juga bening. Lingkungan dari ketiga sel bakteri tersebut
berwarna hitam akibat pewarnaan dengan tinta cina.
Pewarnaan gram pada praktikum ini menggunakan pewarna dasar kristal violet dan
pewarna pembanding atau pewarna kontras adalah safranin. Pewarna kristal violet akan
menghasilkan warna ungu pada bakteri, sedangkan pewarna safranin akan menghasilkan warna
merah atau raddish pink (merah muda). Pada pewarnaan gram di pengulangan pertama untuk
bakteri Bacillus menunjukkan hasil bahwa bakteri Bacillus adalah bakteri gram negatif
berbentuk batang (basil) karena warna akhir yang ditunjukkan setelah proses pewarnaan selesai
adalah warna merah, sedangkan pada pengulangan pewarnaan yang kedua, bakteri Bacillus
menunjukkan bentuk batang berwarna ungu yang berarti Bacillus adalah golongan bakteri
gram positif. Menurut literatur Bacillus merupakan bakteri yang termasuk golongan bakteri
gram positif (Kawuri dkk., 2007). Jadi hasil yang benar ditunjukkan oleh pengulangan
pewarnaan yang kedua. Penyimpangan pada pewarnaan pertama dapat disebabkan karena pada
saat fiksasi terlalu sedikit garam iodine yang diberikan, sehingga perlekatan dari warna dasar
kristal violet tidak terlalu kuat dan banyak terhapus saat dicuci lama dengan alkohol berlebih.
Selain itu dapat disebabkan oleh akibat pemberian pewarna safranin yang berlebihan yang
membuat warna safranin banyak terserap dan sukar hilang saat pencucian karena pekatnya
warna safranin pada bakteri sehingga pada saat penafsiran warna yang dilakukan oleh
praktikan, warna yang lebih dominan terlihat adalah warna dari safranin bukan dari kristal
violet. Bakteri Streptococcus pyogenes menghasilkan bentuk coccus (bulat) berwarna ungu
pada dua kali pengulangan pewarnaan gram yang menunjukkan bahwa Streptococcus pyogenes
termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif. Hal ini karena bakteri menyerap warna dasar
yaitu kristal violet dan warnanya tidak terhapuskan oleh pencucian alkohol sehingga tidak
menyerap pewarna pembanding (Ramona dkk., 2007). Warna ungu (violet) ini timbul
disebabkan dinding bakteri gram positif banyak mengandung peptidoglikan sehingga kompleks
ion kristal violet-iodine yang masuk ke dalam sel akan tidak dapat tercuci oleh alkohol karena
adanya lapisan peptidoglikan yang kokoh pada dinding sel (Pratiwi, 2008). Pada pewarnaan
gram bakteri E.coli, kedua pengulangan pewarnaan menunjukkan hasil yang sama yaitu bakteri
E.coli di bawah mikroskop berbentuk batang (basil) seperti bakteri Bacillus, yang membedakan
adalah bakteri E.coli adalah bakteri gram negatif sebab warna yang ditunjukkan telah sesuai
dengan literatur yaitu warna raddish pink (merah muda) (Kawuri dkk., 2007). Bakteri E.coli
menunjukkan warna merah muda sebagai hasil akhir dari pewarnaan karena bakteri ini setelah
diwarnai oleh pewarna dasar yaitu kristal violet lalu setelah dicuci dengan alkohol maka warna
dasarnya akan terhapus dan menyerap pewarna safranin yang digunakan sebagai pewarna
pembanding. Warna merah muda ini timbul akibat rusaknya lapisan lipoposakarida oleh
alkohol dan tipisnya lapisan peptidoglikan pada bakteri gram negatif sehingga kompleks kristal
violet-iodine sedikit yang berikatan dengan peptidoglikan dan dapat tercuci dengan mudahnya
dari bakteri yang menyebabkan bakteri menjadi transparan, yang kemudian akan berwarna
merah karena menyerap safranin.
 IV. KESIMPULAN

1. Tujuan pewarnaan yaitu mempermudah pengamatan bentuk mikroba, memperjelas ukuran

jazad, dapat mengamati struktur luar dan dalam sel mikroba serta mengetahui rekasi jazad
terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia jazad dapat diketahui.
2. Metode-metode yang digunakan dalam pewarnaan sel bakteri adalah pewarnaan langsung,
pewarnaan tidak langsung, pewarnaan gram dan pewarnaan endospora. Dalam praktikum
kali ini tidak dilakukan pewarnaan endospora.
3. Pengaruh pewarnaan terhadap bakteri adalah pada pewarnaan langsung bagian yang
terwarnai adalah sel bakteri sehingga bagian dalam dari sel bakteri dapat teramati, pada
pewarnaan tidak langsung yang terwarnai adalah lingkungan sekitar sel sehingga hanya
dapat mengamati bentuk dan ukuran bakteri dan pada pewarnaan gram digunakan untuk
mengelompokkan bakteri menjadi bakteri gram positif dan gram negatif.
4. Pada pewarnaan langsung, bakteri Bacillus, Streptococcus pyogenes dan E.coli berwarna
ungu akibat pewarna kristal violet. Pada pewarnaan tidak langsung, ketiga bakteri tersebut
berwarna bening dan lingkungan disekitar bakteri berwarna hitam akibat pewarna tinta cina
sehingga terlihat bakteri Bacillus dan E.coli berbentuk batang sedangkan Streptococcus
pyogenes berbentuk bulat menyerupai rantai. Pada pewarnaan gram, bakteri Bacillus dan
Streptococcus pyogenes berwarna ungu akibat pewarna kristal violet sedangkan E.coli
berwarna raddish pink (merah muda) akibat pewarna safranin.
5. Bakteri gram positif memiliki ciri berwarna ungu karena mengikat warna dari pewarna dasar
dan tidak terhapus oleh pencucian alkohol serta tidak menyerap pewarna kontras.
Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai ciri berwarna merah karena tidak menyerap
pewarna dasar dan terhapus oleh pencucian dengan alkohol serta menyerap warna pewarna
kontras.
 DAFTAR PUSTAKA

Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan. Citra Aditya
Bakti. Bandung.

Jawetz, E., J. L. Melnick, dan E.A. Adelberg. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. Salemba
Medika. Jakarta.

Kawuri, R., I.B.G Darmayasa. 2007. Buku Ajar Mikrobiologi Farmasi. Jurusan Biologi
Fakultas MIPA Universitas Udayana. Bukit Jimbaran.

Pelczar, M.J., E.C.S. Chan. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta

Pratiwi, Silvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta.

Prescott, et al. 2003. Microbiology Fifth Edition. McGraw Hill Companies. Singapores.

Ramona, Y., R. Kawuri, I.B.G Darmayasa. 2007. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Umum
Program Studi Farmasi. Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi F. MIPA UNUD.
Bukit Jimbaran.