Tehnica PCR

•Reactia de polimerizare in lant PCR (polimerase

chain reaction) are la baza o tehnologie in vitro care
imita capacitatea naturala de replicare a ADN.

•Tehnica consta  in generarea rapida a unor copii

multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau
ARN) dintr-o gena de interes sau un patogen specific.
 •Amplificarea se realizeaza intr-un analizor special, iar
amestecul de reactie trebuie sa contina urmatoarele
elemente:

- ADN sau ARN tinta: extras din proba in cursul etapei

de prelucrare
- O enzima care faciliteaza sinteza lantului complementar
de acid nucleic (ADN polimeraza Taq pentru o tinta ADN
sau RTth ADN polimeraza pentru o tinta ARN)
 - Cofactori enzimatici: Mg2+ si/sau Mn2+

- Primeri (P1 si P2): sunt secvente scurte de20-30

nucleotide; ei servesc ca punct de plecare pentru sinteza
lantului complementar cu ajutorul ADN polimerazei,
marcand inceputul si sfarsitul regiunii care trebuie sa fie
amplificata;
 - Deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP si dUTP):
folosite pentru sinteza noii catene ADN prin atasarea lor
la capatul primerilor;

- Amperaza: enzima care promoveaza amplificarea

selectiva a tintei si distrugerea produsilor de contaminare
din cursul reactiilor de amplificare anterioare
 Reactia PCR se desfasoara in 3 etape:

1.Denaturarea

2. Hibridizarea primerilor

3. Elongatia
 DENATURAREA ADN-ULUI

• 94-98 ºC, timp de 20-30 de secunde

• ADN-ul dublu catenar este desfasurat in doua

lanturi complementare, de care se vor lega apoi
primerii
• La sfarsitul acestei etape in mediul de reactie
vor fi prezente doua lanturi ADN mono-catenare
 HIBRIDIZAREA PRIMERILOR

• Se scade temperatura la 50-65 ºC, timp de 20-

40 de secunde
• Primerii sunt in exces in mediul de reactie
• Se vor atasa complementar la capetele 3’ ale
celor 2 catene
 ELONGATIA
• Temperatura depinde de ADN-polimeraza (de
obicei 72ºC)
• ADN-polimeraza:
– Se leaga de lantul hibrid
– „Citeste” secvenţa lantului ADN-tinta
– Alungeste primerii prin adaugarea de dNTP, pe
baza regulii complementaritatii
Procesul global de amplificare este divizat in 3 faze:
- Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de
amplicon ADN;
- Lineara: pe masura ce componentele reactiei sunt
consumate, se produce o incetinire a reactiei iar produsii PCR
incep sa se degradeze;
- Platou (end-point): reactia este stopata, nu se mai formeaza
alti produsi de amplificare, iar daca faza se prelungeste mult
produsii PCR vor suferi o degradare importanta.