UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA

DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

ZARAGOZA

MICROBIOLOGIA GENERAL II

METODOS DEESTUDIO Y
DIAGNOSTICO VIRAL

ALUMNOS:ALDANA PEREZ LUCÍA

HERNANDEZ BARRIENTOS FERNANDO
MARTÍNEZ DÍAZ JOSÉ MANUEL
GRUPO: 2752
SEMESTRE 2010-2
 INTRODUCCIÓN
Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus
humanos pueden clasificarse en:

DIRECTOS
INDIRECTOS

Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnostico clínico se

basan en pruebas serológicas que identifican anticuerpos específicos
frente a diversas proteínas antigénicas. Sin embargo, existen
circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten
precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas
profilácticas, etc.).
 RECOLECCIÓN, TRANSPORTE Y PROCESAMIENTO DE
LAS MUESTRAS
Un elemento crucial para el diagnostico de un virus,
cualquiera que sea el método empleado, es la toma y
procesamiento de una muestra.
Las mejores muestras por lo general son las que se obtienen en
un estudio temprano de la enfermedad (dentro de las primeras
72hrs.), cuando el virus se excreta en concentraciones
relativamente elevadas.

Las muestras pueden obtenerse a partir de:

Conjuntivales
Hisopados Genitales
Réctales
Mucosa oral
Lesiones cutáneas
Sangre
Aspirado nasofaríngeo
Lavado bronquioalveolar
Expectoración
Orina
Liquido cefalorraquídeo
Materia fecal
Biopsias
Los virus deben ser transportados en un medio de transporte
que les provea estabilidad. Esto se obtiene agregando
proteínas como puede ser la albúmina de bovino o gelatina.

Con el agregado de antibióticos y antifúngicos para prevenir el

desarrollo de la flora bacteriana o fúngica. Además deben
transportarse a 4°C , en recipientes estériles con tapa
hermética.

Para virus de alta transmisibilidad como el de la Hepatitis B o

el VIH , deberá colocarse el recipiente que contiene la muestra
dentro de un contenedor metálico con tapa de rosca y
rotularse como peligro biológico.
 PRINCIPALES TÉCNICAS.
METODOS DIRECTOS

Son aquellos que detectan:

1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral).

2. La presencia de antígenos virales (técnicas inmunológicas):
inmunofluorescencia (IF), enzimoinmunoanálisis (EIA), test
de aglutinación.
3. La presencia de ácidos nucleicos virales (PCR, etc.).
4. El virus como partícula viral (microscopia electrónica).
 Aislamiento viral-cultivos celulares
Desventajas
oProceso lento, ya que demanda de días a semanas para la
identificación.
oProceso laborioso y caro.
oRequiere el uso de sistemas de cultivo adecuados; ya que se
necesitan varias líneas celulares para la detección optima del
virus.

Los cultivos celulares son, pues, los biosustratos más

corrientemente empleados para la propagación de los virus.
Son obtenidos de órganos o de embriones de animales.
Estas células obtenidas asépticamente se disocian tratándolas
con una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular.
La suspensión de células libres se colocan en la superficie plana
de un recipiente de vidrio o plástico en donde las células se
adhieren y multiplican formando una fina capa de células
llamada monocapa celular.

Estas crecen en un medio de cultivo complejo que contiene

albúmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer.
Adicionándole también antibióticos adecuados para prevenir
contaminación bacteriana.
Los cultivos celulares se dividen en:

 Cultivos primarios
 Líneas celulares diploides
 Líneas celulares continuas
 Hemadsorción
 Hemaglutinación
 DETECCION DE ANTÍGENOS

 Son técnicas inmunológicas

 Se utilizan anticuerpos específicos antivirales (IgG)
 Se marca la fracción Fc con una molécula de
isocianato de fluosceína, un isotopo radiactivo 1251
o una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina)
 Inmunofluorescencia Directa

 Muestras clínicas apropiadas son

recolectadas y colocadas sobre
portaobjetos donde se dejan secar y fijar.
 Luego se agregan anticuerpos específicos
marcados con isotiocianato de fluoresceína
que difunden a través de la membrana
celular y se combinan con los antígenos
víricos en el interior de las células.
 La reacción antígeno anticuerpo se
visualiza con el microscopio de
fluorescencia, por la aparición de
fluorescencia de color verde manzana.
 Inmunofluorescencia Directa

 Se utilizar para una identificación rápida del virus

directamente sobre la muestra
 células eluidas de un lavado nasal, o de un
hisopado nasofaríngeo
 Los anticuerpos monoclonales conjugados con
isotiocianato de fluoresceína pueden utilizarse para
identificar el virus Respiratorio Sinciciai (VRS),
Influenza A y B. Parainfluenza 1,2 y 3 y Adenovirus
entre otros.
 Test de aglutinación

 Es un método simple, de un solo

paso
 Primero se fijan los anticuerpos
antivirales específicos sobre
eritrocitos o partículas de látex
 Luego este reactivo se incuba con la
muestra clínica en la cual se
investiga el antígeno y las partículas
se aglutinan si el antígeno adecuado
se encuentra presente.
 Test de aglutinación

 Usado para detectar antígeno de Rotavirus en

heces y antígenos de Adenovirus.
 Es una técnica rápida y barata.
 Radioimnunoesayo (RIA)

 Fue originalmente aplicado para identificar el

antígeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg)
y el anticuerpo anti-HBsAg
 Ha sido reemplazado por el ensayo
inmunoenzimatico por que tiene mayor tiempo
de conservación de los reactivos, su costo
relativamente más bajo y la ausencia de residuos
radioactivos
 Enzimoinmunoanalisis (EIA)

 Se basan habitualmente en la captura del

antígeno por anticuerpos específicos unidos a
una fase sólida.
 El antigeno viral se detecta mediante la
adición de otro anticuerpo especifico
conjugado con una enzima (peroxidasa o
fosfatasa)
 TÉCNICAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR
 Sondas de ácidos nucleicos:
 Se extraer secuencias específicas de un
fragmento de ADN por medio de las
endonucleasas de restricción, se desnaturalizar y
marcar, ya sea con una enzima o con un isótopo
radioactivo.
 Citomegalovirus, Papilomavirus y Epstein-Barr
virus han sido identificados usando sondas de
ácidos nucleicos.
Determinación de ácidos nucleicos virales
por sonda sintética

 Es un ensayo de hibridación molecular con sonda

marcada, las hibridaciones pueden ser DNA-
DNA, RNA-RNA y RNA-DNA
 Primero se trata a muestras con reactivos que
solubilizan y desnaturalizan los ácidos nucleicos.
 Posteriormente se añade un DNA marcado,
complementario del DNA del virus y se incuba en
condiciones para que se produzca la hibridación.
Determinación de ácidos nucleicos virales
por sonda sintética

 La muestra se pasa entonces por una columna

que contiene un gel que separa la sonda ligada al
DNA viral hibridado de la no hibridada.
 Dependiendo de como este marcada la sonda, se
detecta la hibridación:
 Si está marcada con un isótopo radiactivo se
puede hacer una lectura en un contador gamma.
 Si esta marcada con una enzima se detecta por
una simple evaluación colorimétrica.
 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

 Nos permite obtener resultados positivos

rápidos de muestras de materias fecales de
pacientes con diarrea (Rotavirus, Adenovirus,
Coronavirus y Calcivirus)
 También en otras muestras, como líquido
vesicular, biopsia de tejidos, verrugas, orina o
suero es posible obtener resultados positivos,
mediante coloración negativa.
 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

 Es posible observar la morfología

de los viriones presentes en
muestras clínicas
 La limitación del método además
del costo del microscopio, es que
necesita de una alta
concentración de viriones
METODOS INDIRECTOS
ENZIMOINMUNOANALISIS
INDIRECTO (EIA)
 Versátil
 Relativamente económico
 Sencible
 Lectura objetiva (con instrumentos)
 Enzimoinmunoanálisis
Indirecto (EIA)
1) Los antígenos virales se inmovilizan sobre una
fase sólida (policubetas),
2) Se agregan los sueros en estudio,
3) Se incuban, se lavan y
4) Se revela la reacción Ag-Ac por el agregado de
una Ig antiespecie conjugada con una enzima
seguida de un sustrato apropiado para esta.
5) Se lee con un espectrofotometro
 ELISA
 Permite identificar inmunocomplejos por medio de
enzimas unidas al antígeno o anticuerpo, estando
uno de ellos adsorbido a un soporte sólido (placa de
poliestireno). La reacción antígeno-anticuerpo se
detecta mediante la utilización de un marcador que
es una enzima conjugada químicamente al antígeno
o anticuerpo (peroxidasa, fosfatasa), se añade un
sustrato al cuál la enzima convierte de incoloro a un
producto coloreado.
 Inmunofluorescencia

 Es una técnica histoquímica o citoquímica, útil

para detectar y localizar antígenos en células o
tejidos. Se utiliza un anticuerpo específico
conjugado con un compuesto fluorescente
dando como resultado un marcador sensible
contra el antígeno.
 Virus de la influenza

La presencia de anticuerpos en el
citoplasma y superficie de las células
infectadas
 Inmunofluorescencia
Indirecta
 Se basa en la unión de anticuerpos a los
antígenos virales expresados en la superficie y el
citoplasma de células infectadas (fijadas en un
portaobjetos). Útil para la determinación de
anticuerpos antivirales en el suero del paciente.
Se incuba el suero del paciente con las células
infectadas y se agrega un anticuerpo anti-IgG
humana conjugada con isotiocianato de
fluoresceína.
INMUNOFLUORESCENCIA
INDIRECTA
INMUNOFLORESCENCIA INDIRECTA
IFI: FLAVIVIRUS

IFI POSITIVA IFI NEGATIVA

 Aglutinación en látex

 La aglutinación de las partículas de látex

recubiertas por un Ag específico permite la
detección de Anticuerpos libres específicos para
el Ag
 Se basa en las interacciones Ag-Ac, donde la
cantidad y especificidad de la reacción se evalúa
por los cambios físicos inducidos tras la unión del
anticuerpo específico con su antígeno
correspondiente para formar inmunocomplejos.
TEST DE AGLUTINACIÓN
 Western Blot (WB)

 Con el uso combinado de electroforésis y ELISA

puede determinarse la respuesta a una
diversidad de proteínas específicas a patógenos.
 Este procedimiento proporciona un medio
específico para identificar reactividad de
anticuerpos.
 Western Blot (WB)

 Se basa en la separación de los antígenos virales

mediante una electroforesis en gel de SDS-PAGE
(lo cual proporciona una carga negativa a la
proteínas).
 Las proteínas virales son sometidas a una
electroforesis en geles de poliacrilamida. Como las
proteínas están cargadas negativamente se separan
con base a su peso molecular (las más grandes
permanecen en la parte superior del gel y las
menores migran hacia la base).
 Western Blot (WB)
 Las proteínas se transfieren a un soporte sólido
(papel de nitrocelulosa, nylon), lo cual da una copia
exacta del patrón del gel en la matriz.
 La identificación de las proteínas a estudiar se
realiza usando un ELISA indirecto. Las reacciones se
leen como positivas cuando una línea de
precipitación o color se forma en el peso molecular
correcto para una proteína particular.
PRODUCCION DE ANTICUERPOS IN
VITRO
 Revela la presencia de anticuerpos antivirales
producidos in vitro a partir de los linfocitos B
extraídos de sangre total, lo que indicaria que el
sistema inmune del paciente ha sido estimulado
por el virus.
ELECCIÓN DE UNA PRUEBA
DIAGNOSTICA
 1) SENSIBILIDAD proporción de personas con la
infección que reaccionaron positivamente en la
prueba diagnostica realizada.
 2) VALOR PREDICTIVO Es la probabilidad de
tener la enfermedad dado el resultado del test
 3) ESPECIFICIDAD Es la proporcion de personas
sin la infección o enfermedad que reaccionan
como negativos
REFERENCIAS
 1. Brock, D. Clínica y Diagnóstico
Microbiológico. Biología de
Microorganismos. Prentice Hall, 1988. New
Jersey. 13: 488-489.
 2. Carballal, G.; Oubiña, J. Diagnóstico
Virológico. Virología Médica. El Ateneo, 1994.
Bs As, Argentina. 6: 73-100.
 3. Chans, G. Aplicaciones de las Nuevas
Técnicas de Biología Molecular al estudio de
Bacterias y Virus. Etiopatogenia
Microbiológica. Vol. 2. Librería Medica
Editorial. 19:289-301.