Bienvenidos.

MÉTODOS DE ANÁLISIS
INMUNOLÓGICOS.
 Generalidades

 Los antígenos (Ag) reaccionan tanto in vivo como in vitro con los anticuerpos (Ac)

específicos

 El sitio activo para el antígeno denominado epítrope reacciona con el sitio activo del

anticuerpo llamado paratopos (Ag-Ac).

 El número de epitópos presentes en los antígenos determina la valencia del ag.

en el caso de los anticuerpos, los de clase IgG, IgA, IgD e IgE tiene sólo dos paratopos
(bivalentes) y la IgM e IgAs tienen 10 y 4 paratópos respectivamente, debido a la multivalencia
del Ag con las respectivas valencias del Ac, cuando se da la reacción Ag – Ac se forman
agregados moleculares.
 Clasificación de interacciones Ag-Ac.

El tipo de enlaces o fuerzas que participan en la unión de los epítopos y paratopos son débiles, no covalentes y

entre ellas están: puentes de hidrógeno, electrostáticas débiles, de Van der Waals e hidrofobicas, por lo tanto son

reversibles y fácilmente se disocian el complejo ya formado y de acuerdo a la naturaleza de los diferentes

fenómenos que se pueden presentar como consecuencia de la reacción permite clasificar a las interacciones Ag-Ac

en :

 REACCIONES DE PRECIPITACIÓN.

 REACCIONES DE AGLUTINACIÓN.

 REACCIONES DE FLOCULACIÓN.

 REACCIONES DE NEUTRALIZACIÓN.

 REACCIONES DE OPSONIZACIÓN.

REACCIONES DE CITÓLIISIS.

 REACCIONES DE FIJACION DE COMPLEMENTO.

REACCIONES CON REACTIVOS MARCADOS.

 HISTORIA SOBRE LOS MÉTODOS DE ANALISIS
INMUNOLOGICOS.

Creite (1869) y Landois (1875), Krauss

en 1887
estableciendo el fenómeno de Stillmark experimenta
Precipitación aglutinaciones entre eritrocitos
(anticuerpos y antígenos solubles y extractos de Ricinos communis

Dos años después Charrin y Roger al mezclar bacterias

con suero previamente sensibilizados observa
grumos o aglutinados (anticuerpo soluble y antigenicidad de los
antígeno fijo en membrana), eritrocitos
por Bordet (1898)
el de aglutinación
de eritrocitos con anticuerpos por
Ehrlich y Morgenroth (1900), 1930`s Marrack propone
una explicación de la reacción
antígeno-anticuerpos,
Landstainer descubre el sistema ABO considerando que
empleando técnicas de hemaglutinación el anticuerpo se une en forma
de unión bivalente
y el antígeno en multivalente
la formación de un retículo
1908 Ottenberg realiza al primer prueba
o enrejado
Transfusional
 REACCION DE PRECIPITACIÓN

Se utiliza un antígeno en solución, como lisados bacterianos, toxinas, etc.., al estar en presencia de
sus Ac específicos forman complejos Ag-Ac posteriormente se insolubilizan , dando como resultado
una reacción de PRECIPITACIÓN.

MECANISMO:

 Primera fase o de sensibilización: identificación y fijación del anticuerpo , esta primera etapa casi

no se ve influenciada por factores tales como, temperatura, pH, fuerza iónica y la concentración de
los reactantes.

 Segunda fase o de estabilización de la reacción: formación de una estructura molecular en forma

progresiva da un enrejado. Esta 2ª etapa es mas tardada y es dependiente de lo siguientes factores.

 FACTORES QUE INFLUYEN

 Temperatura

 Relación Ag / Ac

 Exposición del antígeno

 pH (6.5 – 7.5)

 Tiempo

 Fuerza iónica del medio

Puede ocurrir solo la fase 1ª y no la 2ª, debido a variaciones cuantitativas, la fase 2ª solo
se presenta cuando la concentración de Ag y Ac son equivalentes.

 TEMPERATURA: Acelera la reacción debido aun incremento de la difusión y el

movimiento de las moléculas. Esto es válido hasta los 56 °C, la mayoría de las reacciones
Ag-Ac se trabajan a temperatura ambiente, algunas técnicas se usan a 37 °C , otras a 45 °C
y otras a temperaturas frías (4-6 °C).
COMO AFECTAN ESTOS FACTORES LA REACCIÓN

 pH: de este factor depende el estado iónico de grupos importantes que participan en la

interacción, como son los radicales amino (-NH₃) y carboxilo (-COO), aun así el pH
óptimo esta entre 6.8 a 8.6.
 FUERZA IÓNICA (μ): Corresponde a la concentración de iones presentes en el medio de

reacción (electrolitos) los cuales son necesarios para disminuir las cargas de repulsión que
impiden que se formen los agregados, el intervalo óptimo es 0.01- 0.1 para el enlace del
Ag y Ac, a altas μ los grupos iónicos son neutralizados y por tanto se reduce la afinidad.
 CONCENGTRACIÓN DE Ag Y Ac. La concentración de Ag y Ac deben ser equivalentes

para que la precipitación pueda llevarse a cabo. Si hay exceso de uno de ellos se presenta
el EFECTO O FENÓMENO DE ZONA, si hay exceso de Ag o de Ac solo se forman
complejos primarios, no hay precipitación.
 CURVA DE PRECIPITACIÓN CUANTITATIVA.

 Ag

PREZONA POSTZONA

Ac
 TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN.

Las reacciones de precipitación pueden ser cualitativas, semicuantitativas y cuantitativas y se

pueden realizar en medio liquido y semisólido.

Hay varias técnicas para realizar este tipo de reacciones:

 La simple mezcla del Ag y del Ac en tubo de ensayo o capilar.

 La formación de capas estratificadas (técnica del anillo de interface o Ascoli)
 La difusión simple unidimensional en gel de agar (técnica de Oudin)
 La doble difusión unidimensional en agar
 La difusión radial simple de agar (RID)
 La doble difusión radial en gel de agar (DDR)
Las técnicas de difusión se combinan con procedimientos electroforéticos como:
 La inmunoelectroforesis (IEF)

 La electroinmunodifusión

 La electroforesis bidimensional
 AGLUTINACIÓN.

Técnicas como la aglutinación y la hemólisis son los métodos cualitativos más empleados en el

Laboratorio del Banco de Sangre:

Para determinar:

 Grupo sanguíneo ABO y Rh,

 Rastreo de anticuerpos

 Coombs directo

 Pruebas cruzadas

Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con su antígeno específico y este se encuentra en

estado particulado o forme (p.ej. Bacterias, eritrocitos, levaduras, células) reaccionan formando

grumos o aglutinados y los principios que regulan esta reacción son los mismos de la reacción de

Precipitación.
 REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN.

 La primera fase es conocida como sensibilización: proceso mediante el cual el anticuerpo se une al
antígeno de la superficie de la partícula. En esta fase puede haber activación del complemento, donde
se observa lisis.

 La segunda fase es el resultado de la unión de las partículas mediante puentes de anticuerpo,

formando grumos o aglutinados que puedes ser vistos a simple vista o en microscopio.
Factores que afectan la reacción de aglutinación:

 Temperatura
Relación Ag / Ac
Exposición del antígeno
pH (6.5 – 7.5)
Tiempo
Fuerza iónica del medio
Reacciones de aglutinación factores que influyen:
Tipo de inmunoglobulina
Reacciones de Aglutinación Factores que
influyen:
Integridad de la membrana de eritrocito
Reacciones de Aglutinación Factores que influyen:
Densidad del antígeno
Potencial zeta
 Las reacciones de aglutinación pueden ser:

La IgM es superior a la IgG como aglutinante, debido a su enlace multivalente, superando la distancia entre partículas, en un

medio salino.

Mientras que la IgG requiere de medios proteicos como albúmina o la utilización de enzimas proteolíticas como la bromelina

para disminuir el potencial zeta y llegar a la segunda fase de reacción.

Otro medio para que la IgG pueda aglutinar es la utilización de una antigamaglobulina humana denominada suero de

coombs, este se une a la IgG unida al Ag formando puentes y formar aglutinados.

Estas reacciones se llevan a cabo con gran facilidad y su alta sensibilidad, pero no puede cuantificarse y solo pueden darse

resultados en función de realizar diluciones.

AGLUTINACIÓN DIRECTA O ACTIVA, donde los antígenos que intervienen son componentes naturales de la partícula.

AGLUTINACIÓN INDIRECTA O PASIVA, en donde los antígenos solubles se absorben en forma artificial a partículas que

funcionan como soporte ( de tipo natural o artificial ).

las reacciones de aglutinación se pueden realizar en, placa, tubo y placa de microtitulación.
 REACCIONES DE CITÓLISIS.

 Los anticuerpos producidos en la respuesta humoral, activan el sistema complemento.

 El complemento es un conjunto de glicoproteínas que inactivas se conocen como (zimógenos) y

requieren de ser activados.

 La activación del complemento se lleva a cabo en forma de cascada y derivado de su activación

se generan actividades como: quimiotaxis, opsonización, degranulación de basófilos y células

cebadas y la lisis celular.
 La activación del complemento se lleva a cabo por dos vías (la clásica y la alterna), y la vía de la

lectina
 Cuando se activa el complemento por cualquier vía se lleva a cabo sobre una superficie celular y

en la última etapa forma el complejo de ataque a la membrana (MAC), que causa la lisis de la
célula.
 Para que este sistema no cause daño a las propias células, existen otros factores de regulación.
 Reacción de citólisis.

En las reacciones de citólisis , en donde se emplea el complemento como reactivo

(titulación de hemolisinas, y reacción de fijación de complemento) se utiliza el suero

de algún animal como fuente de complemento (cobayo), o cuando se cuantifica el

complemento en el suero de un paciente, debe tomarse en cuenta que alguno de los

componentes son termolábiles, y pierden rápidamente su actividad, por lo que se

debe utilizar el suero recientemente obtenido y conservado en refrigeración o en su

caso de usar productos comerciales liofilizados.

 Hemólisis.

 Las hemolisinas (amboceptores hemolíticos)son anticuerpos producidos frente a los

antígenos que se encuentran en la superficie de los eritrocitos.

 los amboceptores en presencia del antígeno que estimuló su formación y del

complemento, desencadenan una reacción que causa la lisis de eritrocitos.

 Para medir la actividad del amboceptor se realizan diluciones y a veces se mide sólo el

50% de la hemólisis.
 Técnicas con Anticuerpos o Antígenos marcados

 Las reacciones Ag-Ac, pueden ser utilizadas para revelar la presencia de uno u otro de
estos reactantes. La especificidad de esta reacción le da a estas reacciones in vitro una
elevada confiabilidad.
 Aumenta la sensibilidad de estas pruebas al utilizar marcas en cualquiera de los dos (Ag o
en el Ac), permitiendo demostrar la presencia de cantidades sumamente pequeñas de los
reactantes.
 Las principales sustancias utilizadas como marcas son: isótopos, enzimas y fluorocromos.

Los isótopos se empazarón a usar en 1966 por la Dr. Yallow, cuando realizó su primer
radioinmunoanálisis (RIA), que se trataba de unensayo competitivo en donde se permitía
la competencia entre moléculas de Ag no marcadas y marcadas con radiosótopos por los
sitios de unión con anticuerpos específicos. La marca en este caso se denomina trazador y
tiene el objeto de permitir la identificación y la cuantificación del analito en la fracción
libre y unida a la reacción.
 ANTIGENOS ERITROCITARIOS

 La cantidad de sitios antigénicos, muestran diferencias

substanciales para cada sistema eritrocitario así como
su expresión en función de la edad

SABO/ ANTIGENOS SITIOS ANTIGENICOS x 103

A1 ADULTO 800 – 1170
A1 NEONATO 250 – 370
A2 ADULTO 240
A2 NEONATO 140
A1B ADULTO 460 – 850
A2B ADULTO 140
B ADULTO 750
B NEONATO 200 – 320