REVISTA COMPUTADORIZADA DE PRODUCCION PORCINA VOLUMEN 11 Nurnero 2 (2004); 223-232.

usa DEL BIORREACTOR TUBULAR CON TIEMPO DE RETENCION CORTO PARA ELI MINAR COLIFORMES PATOGENOS DE RESIDUALES PORCINOS.

Oliva lIaven MA " Velasco Ruiz D 2, Ventura Canseco LMC 2, Ballinas Diaz EJ, Salvador Figueroa M, L '. Dendooven 3 and Gutierrez Miceli FA '.

1 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autonorna de Chiapas, Mexico. Carretera Ejido Emiliano Zapata Km 8 Tuxtla Gutierrez Chiapas. 01-961-6716075.

2 Departamento de lnvestiqacion y posgrado, Instituto Tecnoloqico de Tuxtla Gutierrez. 3 Centro de lnvestiqacion y de Estudios Avanzados del IPN.

RESUMEN

Los residuales porcinos poseen nutrientes que pueden ser usados por plantas y animales, pero tam bien existe un peligro inherente al sistema de reciclaje de los mismos que es la posibilidad de trasrnision de patoqenos. EI proceso de ensilaje aplicado a las raciones conteniendo excreta ha demostrado ser un metodo efectivo de elirninacion de diferentes organismos patoqenos. La produccion de acido disminuye el pH por debajo de 4.5 y es el principal responsable de la antibiosis que ocurre en las raciones ensiladas. EI tiempo para que las raciones ensiladas alcancen un pH por debajo de 4.5 depende del residual porcino y de las condiciones del proceso de ensilaje. Estos periodos son siempre mas largos en la practica en las granjas porcicolas. EI objetivo del presente trabajo fue caracterizar las condiciones de operacion de un bioreactor tubular para la elirninacion de coliformes totales en corto tiempo Los facto res estudiados fueron rpm, temperatura y condiciones herrneticas del bioreactor sobre la cinetica del pH en el proceso de ferrnentacion de residuales porcinos con rastrojo de sorgo, miel y suero de leche. La mezda alcanzo un pH de 4.0 en 16 horas y no se detectaron coliformes totales, Salmonella spp, Shigella spp y Escherichia coli. La calidad nutricional de la mezcla con residuales porcinos tarnbien influenciaron las condiciones del proceso. EI contenido proteico de la racion fue un 10% mas que el valor inicial,

Palabras ciaves: residuales porcinos, elirninaclon de pat6genos, bioreactor tubular.

Titulo corto: elirninacion de coliformes patoqenos de excretas porcinas en un biorreactor tubular con corto tiempo de retenci6n

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TUBULAR BIORREACTOR WITH SHORT TIME RETENTION FOR PATHOGENIC COLI FORMS ELIMINATION FROM SWINE WASTES.

SUMMARY

Swine waste contains nutrients for plant and animal use, but an Inherent danger In recycling systems is the possibility of transmission of pathogens. The ensiling process as applied to rations containing manure has been demonstrated to be an effective method of eliminating different pathogens organism. Acid production decreases the pH to a low of 4.5 and is principally responsible for the antibiosis that occurs In ensilinq rations. The times for the ensiling rations reached pH lower 4.5 depend of swine waste and the conditions for ensiling process. These times are even largest for practical use in the piggeries. The aim of the present work was charactenzed the operation conditions for a tubular bioreactor for the total coliforrns elimination in short time. The factors studied were rpm, temperature and hermetical conditions of bioreactor on the pH kinetic in the fermentation process of swine waste with stubble sorghum. molasses and whey milk. Mixture reached pH 4.0 in 16 hours and not detected totals coliforms, Salmonella, Shigella and E coli. Process conditions also were Influenced on the nutritional quality of the mixture with swine waste Raw protein content was 10 % more that initial value.

Key words: Swine waste, pathogen elimination, tubular bioreactor

Short Title: Elimination of pathogenic coliforms from swme waste In short time uSing tubular bioreactor

INTRODUCCION

Los desechos de las qranjas porcicolas contienen nutrientes que se pueden usar para alimentar vegetales 0 ani males, sin embargo, un riesgo inherente en los sistemas de reciclaje es la posibilidad de transrnision de microorganismos patoqenos Se ha demostrado que el ensilaje de las excretas es un rnetodo efectivo para eliminar bactenas coliformes fecales (Knight et a11977; McCaskey y Anthony 1975) as; como para disrninuir la sobrevivencia de coccidios provenientes de los bovines y tarnbien reduce los nesgos de transmiston de micobacterias en las raciones formuladas con estiercol de bovinos (McCaskey y Schehane 1980) En el proceso del ensilaje, las bacterias lacticas utilizan los nutrientes que se encuentran en las excretas para crecer y para producir acido tactico y pequerias cantidades de acido propionico y acido butirico (Knight et al 1977) A medida que se producen los acidos el pH disminuye a valores menores que 4.5 y esta disrninucion en el pH es el factor principal de la antibiosis que ocurre en el proceso del ensilado (McCaskey y Anthony 1979). Se ha reportado que el tiempo al cual las mezclas ensiladas alcanzan valores de pH menores que 4.5 es variable y que depende del porcentaje de humedad de las excretas, de los ingredientes que se Ie adicionen para fermentar las excretas y de factores operativos del proceso del ensilado. Sona et al (2001) reportaron tiempos de 50 dias para la eliminacion de coliformes fecales en las excretas de cerdo con alto contenido de agua y en un proceso tipo lagunas de oxidacion. Iniguez et al (1989) encontro un tiempo de 4.5 dias para la eliminacton de los coniformes en las excretas con bajo contenido de agua y tratadas en un biorreactor tubular. Para propositos practices. estos tiempos son muy largos para implementarse en las granjas porcicolas. EI objetivo del presente trabajo fue caracterizar las condiciones de operacion de un biorreactor tubular para la elirmnacion de las bacterias coliformes totales presentes en las excretas de cerdo en tiempos mas cortos que los reportados

MATERIALES Y METODOS:

Los solidos de excretas de cerdo se obtuvieron en la granja "MUNDET" ubicada en el municipio de Suchiapa, Chiapas. Este municipio est a situado en la region central del Estado de Chiapas. La granja tiene 300 cerdos en promedio. Los cerdos tienen entre 25 y 105 Kg de peso y se mantienen con dietas basad as en sorgo y complemento vitaminico. Se eliqio esta granja debido a que las instalaciones, la prevencion de enfermedades y la alimentacion tienen un grado de tecnificacion por encima del promedio de las granjas que se encuentran en Chiapas.

La recoleccion de las excretas se hizo directamente de los encierros, antes de aplicar agua con la finalidad de no incrementar la humedad. Las excretas se mezclaron con rastrojo de sorgo para obtener el contenido de humedad deseado.

La melaza como fuente principal del carbono, con una densidad de 1.4 g/mL, se obtuvo de la Union Ganadera Local (Suchiapa) y proviene del Ingenio Azucarero "La Fe", ubicado en el municipio de Venustiano Carranza, Chiapas.

En base a investigaciones realizadas por Hrubant et al (1978), y Sutton et al (1987) se eligio rastrojo de sorgo(y/o rastrojo de malz) como sustrato solido para facilitar la ferrnentacion y fue proporcionado por el mismo propietario de la granja "Mundet". Este rastrojo fue molido usando un molino de martillos y se hidrato con agua (1.4 I de agua por 1 Kg de rastrojo molido). EI suero de leche fue adquirido de la misma granja cuidando que fuera obtenido el mismo dla.

EI medio de cultivo se prepare en base al medio no selectivo para el cultivo de bacterias del rumen (Church 1974) adicionando 5.00 9 de azucar: 0.50 9 de almidon de yuca; 7.00 9 de sal mineral; 200.00 ml de suero de leche; y agua destilada para ajustar a un volumen total de 1 litro. La mezcla a fermentar se prepare con melaza, cerdasa y rastrojo de sorgo (15: 59: 26.

La preparacion del inoculo se realize en tres eta pas:

Etapa 1: Se pesaron 10 9 de cerdasa. A esta cerdasa se Ie adiciono 90 ml del medio de cultivo descrito con anterioridad y se deja incubando a temperatura ambiente durante 27 horas. Etapa 2: se utilizaron 80 ml del inoculo obtenido en la etapa 1, adlcionandole 504 ml del medio de cultivo mas 216 9 de la mezcla a fermentar y se deja incubando a temperatura ambiente durante 27 horas. Etapa 3: se usaron 2160 ml del medio de cultivo, 5040 9 de la mezcla a fermentar y se Ie adiciono 800 ml del inoculo obtenido en la segunda etapa.

Analisis fisicoquimicos

Las pruebas que se efectuaron a las materias primas y al producto de la ferrnentacion fueron: humedad, proteina cruda, extracto etereo, fibra cruda, cenizas y extracto libre de nitroqeno (AOAC 1981).

Analisis microbioloqico

A 20 gramos del producto fermentado se Ie adiciono 180 ml de agua (1: 1 0), rnezclandola en un agitador Waring por 5 min. EI filtrado se usa para los anal isis microbioloqicos. EI conteo en placa de las bacterias totales, conteo de los hongos y el con teo de los coliformes totales se estimaron en el filtrado obtenido en las determinaciones anteriores usando los siguientes medios de cultivo: agarazul de metileno-eosina, agar-Shigella y Salmonela y agar-McConkey.

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Construccion y opera cion del fermentador

EI fermentador piloto se construyo de PVC de 68.58 cm de largo y 15.24 cm de diametro, tiene dos puertas localizadas en los extremos que permiten el paso de la mezcla excretas-rastrojo a traves del fermentador. La mezcla a fermentar, ocupo 2/3 del volumen del fermentador. EI fermentador funciono sobre ruedas ancladas a flechas impulsoras en paralelo (se emplearon 3 juegos de poleas con su respectiva banda para ajustar a la velocidad deseada). La potencia de la flecha la proporciono un motor de velocidad variable 1/8 hp.

Para analizar el efecto de las variables de operacion del biorreactor, se utilize un diserio experimental completamente aleatorio, con un arreglo factorial completo en donde los facto res a evaluar fueron aislamiento termico del reactor, velocidad de aqitacion y hermeticidad. Cada factor se evaluo con dos niveles, el reactor se trabajo aislado y no aislado, la velocidad de aqitacion fue a 0 y 0.6 rpm y las condiciones de hermeticidad fueron reactor abierto y cerrado. Se implementaron 8 tratamientos con 3 observaciones por 10 que se generaron 24 unidades experimentales. Para la cinetica, se realizaron mediciones de pH y temperatura a los siguientes tiempos: 0, 10, 12, 14, 16, 18, 20 Y 23 horas. Se realize el analisis quimico proximal y analisis microbioloqico (cualitativo) a la mezcla inicial y al producto final.

EI analisis estadistico conslstio en un ANAVA utilizando el rnetodo de Yates (Box et al 1979) y se realize la cornparacion de medias entre los tratamientos por el metodo de Tukey al 0.05% de probabilidad utilizando el paquete estadistico de SAS (SAS Institute, Inc 1985). La comparacion de los resultados del anal isis quimico proximal antes y despues de la ferrnentacion, se etectuo por medio de pruebas de hipotesis de comparaciones apareadas utilizando la t de student con n-1 gl y p<0.05. (Wayne 1992).

RESULTADOS Y DISCUSION

En la Tabla 1 se observa que los tratamientos 2 y 6 fueron los que promovieron la elirninacion de los microorganismos patoqenos en un menor tiempo (16 horas). EI analisis de varianza de los resultados dernostro que ni la aqitacion ni la interaccion aqitacion-herrnetlcidad fueron significativas (f tablas = 7.71, P = 0.05), mientras que la hermeticidad fue altamente significativa (f tablas = 15.42; P = 0.01). Estadisticamente, los tratamientos 2 y 6 fueron los mejores porque promovieron un menor valor de pH en un tiempo mas corto que los demas tratamientos. La hermeticidad del biorreactor tuvo un efecto significativo (p <.05) adem as de que se observe una interaccion posit iva entre la hermeticidad y la aqitacion, mientras que de acuerdo a la prueba de efectos fijos, el factor aislamiento no evidencio efecto en el comportamiento de los tratamientos.

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Tabla 1. Tiempo al cual no se detectaron microorganismos patoqenos en las excretas porcinas en el biorreactor tubular

Tratamiento Aqitacion Condiciones de hermeticidad Aislamiento tiempo (horas)
terrnico
1 No agitado Abierto No aislado 20
2 Agitado Abierto No aislado 16
3 No agitado Cerrado No aislado 23
4 Agitado Cerrado No aislado 23
5 No agitado Abierto Aislado 20
6 Agitado Abierto Aislado 16
7 No agitado Cerrado Aislado 23
8 Agitado Cerrado Aislado 23 Los resultados obtenidos son logicos si se considera que estos factores influyen en la concentracion de oxigeno disuelto disponible para los microorganismos y que las bacterias lacticas producen acido lactico preferentemente en condiciones microaerofilicas. La caracteristica mas importante utilizada para evaluar el exito de un proceso de tratamiento de excretas es el pH (Naugle et al 1980). Si comparamos con los resultados obtenidos en otros estudios, el tiempo de 16 horas es el menor tiempo reportado hasta el momento. Por ejemplo, McCaskey y Shehane (1980) reportan que el pH disminuyo debajo de 4.5 despues de 3 dias de ensilaje a 25° C. Se describe que el pH fue el factor que influyo para lograr la antibiosis contra las micobacterias las cuales representan un rete ya que estos organismos toleran un gran rango de valores de pH. Weiner reporto el logro de valores de pH de 5.01,4.59 Y 4.38 a las 48. 72 Y 96 horas, respectivamente. Cabe mencionar que a las 72 horas ya no se encontraron coliformes totales en la mezcla de cerdaza y maiz (Weiner 1980). Berger et al (1980) usando harina de soya y de rnaiz, encontraron que a medida que se aumento la proporcion de harina de maiz, disminuyo la concentracion de carbohidratos solubles, incremento la concentracion de acido lactico y disminuyo el pH en un tiempo de ensilaje de 40 dias.

Con respecto a la influencia de la hermeticidad del biorreactor, se observe que la terrnentacion lIevada a cabo en el biorreactor con operacion a tanque abierto fue la que prornovio menores valores de pH que la ferrnentacion lIevada a cabo con el biorreactor cerrado. La diferencia se observe desde las 10 horas del proceso ferrnentativo. Estos resultados indican que la ferrnentacion requiere condiciones microaerofilicas mas que condiciones anaerobicas. Este resultado es interesante debido a que la mayor parte de los estudios relativos al diseiio de reactores para el tratamiento de la cerdaza se han enfocado a las condiciones anaerobicas (Sweeten 1980). Por razones econornicas el nivel de oxigeno disuelto en el reactor debe ser el minima necesario de tal manera que satisfaga los requerimientos para que se genere suficiente actividad microbiana que permita lograr los objetivos del tratamiento. La operacion del reactor de forma abierta perrnitio que se lograran condiciones micro-aerofilicas. Estas condiciones permitieron que se produjera mayor concentracion de acidos orqanicos los cuales a su vez provocaron la disminucion del pH con mayor rapidez que con las condiciones anaerobicas (con el reactor cerrado).

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En relacion con la influencia de la aqitacion, se observe que la aqitacion no tuvo una influencia significativa en el comportamiento del pH en la ferrnentacion, sin embargo, la interaccion con la hermeticidad si presento diferencias estadisticamente significativas. EI efecto de la interaccion de estos dos factores se puede analizar con respecto a las condiciones que provocan dentro del biorreactor en relacion con el intercambio gaseoso dentro de la mezcla. Las condiciones de operacion a tanque abierto permiten que exista una aireacion superficial a traves de la superficie libre. Se ha estudiado con detalle la transferencia de masa hacia adentro y hacia fuera de la pelicula de liquido (Bailey y Ollis 1997) sin embargo, hace falta todavia mas informacion cuando se trata de explicar 10 que sucede cuando participan las celulas y es que se deben de incluir los aspectos bioquimicos en el analisis, Evidentemente, los factores que hacen la diferencia entre una actividad aerobica y una anaerobica dependen de la concentracion de oxigeno dentro de la rnezcla a fermentar, del coeficiente de difusion de oxigeno (que depende en gran parte de la viscosidad y densidad de la mezcla) y de la velocidad de respiracion 0 de consumo del oxigeno por los microorganismos.

De acuerdo a las condiciones experimentales que se probaron en el presente trabajo, es el primer factor que fue diferente al variar las condiciones de hermeticidad y de aqitacion del biorreactor 10 que perrnitio que hubieran diferencias en la concentracion de oxigeno disuelto ella mezcla a fermentar. La ferrnentacion fue mas adecuada cuando los microorganismos tuvieron disponible oxigeno, aunque en cantidades limitadas, debido a que la transferencia gaseosa solo se realize a traves de la superficie de la mezcla a fermentar. Refuerza aun mas el hecho de que se encontro que la interaccion tanque no-herrnetico y aqitacion a 0.6 rpm fue significativa al favorecer la disminucion del pH, debido a que la aqitacion permite que el coeficiente de dlfusion de oxigeno sea mayor con 10 que los microorganismos tuvieron disponible mas oxigeno disuelto, para que su metabolismo no 10 realizaran bajo condiciones de anaerobiosis.

En las condiciones en que se opere el biorreactor y las caracteristicas de viscosidad y contenido de solidos de la mezcla a fermentar, 10 mas probable es que se hayan genera do condiciones microaerofilicas (Bailey y Ollis 1997). La disrninucion del pH se debe a la produccion de acid os orqanicos, sin embargo, en trabajos previos se ha reportado que es el acido lactico el que se produce en mayor proporcion. En los microorganismos el lactato se forma normal mente a partir del piruvato, la reaccion tam bien se produce en las celulas de los organismos superiores cuando la cantidad de oxigeno disponible es limitada, como ocurre en el rnusculo durante la actividad intensa (Stryer 1995). Este conocimiento se aprovecha a nivel industrial para maximizar la produccion de acido lactico manipulando la concentracion de oxigeno disuelto el medio de termentacion, Por ejemplo, en el estudio cinetico para evaluar la conversion de diferentes substratos a acido lactico usando Lactobacillus bulgaricus, que es una bacteria anaerobica facultativa, se determine el efecto de la presencia del oxigeno sobre el crecimiento microbiano y la torrnacion de acido lactico. Se encontro que el microorganismo no crecio bajo condiciones aerobicas, sin embargo bajo condiciones microaerofilicas, se encontro la mayor velocidad especifica de crecimiento (Burgos-Rubio 2000).

Analisis rnicrobioloqico de las excretas de cerdo.

Antes de la ferrnentacion, la rnezcla contenia Escherichia coli (105 X 106 UFC/ ml. Shigella y Salmonella (2.5 X 106 UFC/ ml y de Enterobacterias (8.4 X 106 UFC/ ml). Despues de la terrnentacion no se encontro ninguna UFC de los tres tipos de microorganismos (Tabla 2). Estos resultados son importantes porque demuestran que se puede obtener cerdasa libre de microorganismos patoqenos en un tiempo corto de fermentacion. EI contenido microbiano de la cerdasa permite obtener productos con mejor calidad, por ejemplo si el uso es para fertilizar plantas 5e ha demostrado que la calidad del biofertilizante es baja cuando la cerdasa composteada contiene mayor carga microbiana. Esto se debe a que los microorganismos inmovilizan y ayudan a retener el nitroqeno en el suelo y como consecuencia disminuye la eficiencia de asimilacion del nitroqeno por las plantas. Particularmente en

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maiz, Choi et al (2001) encontraron que la aplicacion de cerdasa composteada aumenta al doble la inrnovilizacion del nitroqeno,

Tabla 2.- Analisis microbiol6gico antes y despues de la fermentaci6n

Microorganismos Antes de la fermentaci6n Despues de la fermentaci6n
Enterobacterias 84 x 10" UFCI ml. 0 UFC/ml.
Escherichia coli 10.5x106 UFC/ml. o UFCI ml.
Shigella y Salmonella 2.5 x 10" UFCI ml. o UFCI ml. Analisis quimico proximal de las excretas de cerdo.

En la Tabla 3 se muestran los resultados del analisis quimico proximal efectuado a la mezcla antes de la ferrnentacion y despues de la fermentacion. Los parametres que fueron diferentes significativamente fueron fibra cruda, extracto etereo y proteina cruda. Si comparamos los resultados con los reportados por Iniguez (1990), encontramos que existe coincidencia en el contenido de proteina cruda, (11.7%) al inicio de la ferrnentacion, es decir en la mezcla no fermentada. Sin embargo, el contenido de la proteina crud a en la mezcla fermentada si fue diferente. Iniguez (1990) obtuvo 12.1 % mientras que en el presente trabajo se obtuvo un valor superior (15.0 %). Desde este punto de vista el proceso fermentativo reportado aqui es mas eficiente porque promueve la obtencion de un producto con mayor contenido de proteina. Con respecto a el extracto stereo, los valores reportados por Iniguez (1990) son mas bajos (3.13 %) que los obtenidos en este trabajo (13.91 %). Un factor que posiblemente influyo para esta diferencia fue que usamos suero de leche e Iniguez no. Con respecto al contenido de fibra cruda no se observaron diferencias significativas (7.3 % versus 7.06 %) (Iniguez 1989).

EI analisis quimico proximal es importante porque es un factor que debe considerarse para el uso del producto obtenido, ya sea para alirnentacion de rumiantes 0 para elaborar fertilizantes para diversas plantas. Choi et al (2002) experimentaron diversas proporciones de urea mezclada con cerdasa composteada y probaron las mezclas en plantas de maiz cultivadas en invernadero. Encontraron que las diferencias en los diferentes tratamientos no fueron consistentes, perc variaron con el tiempo de muestreo. Generalmente el mayor contenido de nitroqeno en las plantas de maiz y el mayor rendimiento de las plantas fueron logrados con el tratamiento con 150 kg de N por hectarea, aplicada con la cerdasa composteada y 0 de nitrcqeno aplicado con urea. No solamente el nitroqeno es afectado, sino tarnoien se ha descrito que la produccion de maiz fue mayor por la mayor disponibilidad de tostoro en las excretas de polio (Cooperband et al. 2002).

Tabla 3.- Analisis quimico proximal de la cerdasa mezclada con melaza, suero de leche,
rastrojo antes y despues de la ferrnentacion.
Antes de la Despues de la Siqnificacion
termentaclon termentaclon p< 0.05
PARAMETRO
% base seca
% base seca 0 0
Humedad 78.79 ± 1.450 78.27 ± 2.085 NS
Cenizas 16.56 ± 0.048 15.32 ± 0.720 NS
Extracto etEneo 1205 ± 0.060 13.91 ± 0.030
Fibra cruda 8.32 ± 0.570 7.06 ± 0.040
Proteina crud a 11.70 ± 0.220 15.00 ± 0.530
Extracto libre de NS
51.37 ± 1.400 48.71 ± 1.400
nitroqeno
Materia seca 21.21 ± 0.650 21.73 ± 0.590 NS EI contenido de N que se encontro para la cerdasa fermentada con el proceso descrito en el presente trabajo permite suponer el uso potencial del producto obtenido para elaborar bio-fertilizantes especificos para diversas plantas, sin embargo habra que evaluar a nivel invernadero cuales son las respuestas de las plantas a diferentes niveles de aplicacion del producto. Tarnbien es importante evaluar como son afectados los procesos quimicos del suelo, especificamente la dinarnica de carbono y nitroqeno, f6sforo, potasio, el pH, la temperatura, microorganismos benefices del suelo, etc. para determinar los posibles efectos adversos que pudiera tener la aplicacion de la cerdasa fermentada en el cual se loqro disminuir el pH y el contenido microbiano en un periodo de tiempo corte.

AGRADECIMIENTOS

Esta investiqacion fue financiada por el Sistema de lnvestiqacion Benito Juarez del Consejo nacional de Ciencia y Tecnologia (SIBEJ-CONACYT).proyecto Produccion de cerdasa para alirnentacion de rumiantes. 19990505006.

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