c

BAB I
PENDAHULUAN

A.c Latar Belakang

Mikroorganisme dapat berkembang biak dengan alami atau dengan

bantuan manusia. Mikroorganisme yang dikembangkan oleh manusia
diantaranya melalui substrat yang disebut media. Media adalah suatu
substrat dimana mikroorganisme dapat tumbuh yang disesuaikan dengan
lingkungan hidupnya.c
Mikroorganisme yang kita isolasi harus kita ketahui jenis media
yang disukai sehingga dapat tumbuh dengan baik pada media. Medium ini
akan digunakan oleh mikroorganisme sebagai sumber energi untuk
melakukan pertumbuhan dan perkembangbiakan maka hendaknya harus
sesuai dengan komposisi bahan media.
Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau
memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan sehingga diperoleh kultur
murni atau biakan murni. Beberapa cara yang dapat dilakukan yaitu
dengan cara goresan (M
  a cara tuang (
  a cara sebar
(M

 a dan mikromanipulator ( Buckle 1998a.

B.c Tujuan

Ôujuan dari praktikum setilisasi alat ini adalah untuk mempelajari

prosedur umum serta memahami pembuatan media dan mempelajari cara-
cara mengisolasi bakteri kapang khamir dan yeast.
 c
c

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A.c Pembuatan Media

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu

substrat yang disebut media. Media yang digunakan untuk menumbuhkan
dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya
dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan.
Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada media yang sangat
sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber
karbon organik seperti gula. Mikroorganime lainnya memerlukan suatu
media yang sangat kompleks yaitu berupa media ditambahkan darah atau
bahan-bahan kompleks lainnya. (Volk 1993a.
Hal pertama yang harus dilakukan untuk menelaah bakteri di dalam
laboratorium adalah kita harus dapat menumbuhkan bakteri tersebut di
dalam suatu biakan murni. Melakukannya haruslah dimengerti jenis- jenis
nutrient yang disyaratkan oleh bakteri dan juga macam lingkungan fisik
yang mana dapat menyebabkan kondisi yang optimum bagi
pertumbuhannya tersebut (Pelczar 1986a.
Biakan murni bakteri adalah biakan yang terdiri atas satu spesies
bakteri yang ditumbuhkan dalam media buatan. Media buatan tersebut
berfungsi sebagai media pertumbuhan dan pada media ini bakteri dapat
tumbuh dan berkembang biak. Bahan dasar yang digunakan untuk media
pertumbuhan ini adalah agar-agar. (Syamsir 2008a.

B.c Isolasi Mikroorganisme

Mikroorganisme merupakan kelompok makhluk hidup yang sangat

beragam dan dapat ditemukan di berbagai tempat secara mudah. Kita tidak
dapat secara langsung melihat keberadaan mereka yang sebenarnya sangat
banyak. Hal itulah yang menyebabkan isolasi mikroorganisme perlu
 ^c
c

dilakukan karena diperkirakan hampir 99% dari mikroorganisme di

sekitar kita tidak berbahaya dan cenderung menguntungkan.
Isolasi mikroorganisme merupakan tahapan dasar untuk
mempelajari mikroorganisme. Sampel dapat diambil dari mana saja bisa
dari udara tanah pohon bagian makhluk hidup perairan dan juga
habitat-habitat ekstrem seperti kolam air panas.
Beberapa hal yang penting untuk diperhatikan dalam isolasi
mikroorganisme.
1ac Spesies Mikroorganisme
Spesies mikroorganisme sangat menentukan bagaimana kita akan
melakukan isolasi. Setiap mikroorganisme memiliki sifat-sifat yang sangat
spesifik. Salah satu faktor yang sangat penting untuk diperhatikan adalah
nutrien. Nutrien tiap mikroorganisme tidaklah sama.
2ac Habitat (lingkungana
Lingkungan harus dipertimbangkan dalam isolasi karena setiap
kehidupan mikroorganisme sangat dipengaruhi faktor lingkungan.
Beberapa faktor lingkungan yang penting bagi pertumbuhan
mikroorganisme yaitu.
aac Suhu
Suhu merupakan faktor penting karena mikroorganisme memiliki
toleransi terhadap suhu pada tingkat berbeda. Suhu mikroorganisme
dibedakan menjadi mikroorganisme psikrofilik mesofilik dan thermofilik
serta mikroorganisme ekstrem (suhu sangat tinggi > 850Celciusa. Suhu
berpengaruh pada kerja dan konformasi enzim.
bac Ketersediaan air
Air merupakan pelarut biologis sekaligus medium untuk reaksi
biokimiawi dalam tubuh. Air mutlak diperlukan sehingga medium harus
mengandung air yang cukup. Ketersediaan air disebut juga dengan Aw
(   
a yang kisarannya antara 0-1.
cac pH
 ‰c
c

Kadar keasaman sangat penting ada mikroorganisme berhabitat pH

rendah (asama atau asidofilik netral atau netrofilik dan basa atau
alkalofilik. Kemampuan tersebut juga terkait dengan kerja enzim.
dac Ôipe medium
Habitat mikroorganisme sangat menentukan kondisi yang akan
disesuaikan dalam laboratorium. Mikroorganisme dengan substrat asli
padatan juga diisolasikan dalam medium padat begitu juga dengan
mikroorganisme dengan substrat cair diisolasikan dengan medium cair.
Ôata cara pelaksanaan dalam proses isolasi sangat sederhana. Pada
intinya tahapan yang harus dilakukan adalah pembuatan medium
inokulasi secara aseptis dan identifikasi hasil mikroorganisme yang
tumbuh. Perlu diperhatikan bahwa substrat dan medium memiliki
perbedaan. Substrat merupakan habitat atau medium yang tidak diketahui
komponen penyusunnya secara pasti. Contoh substrat adalah kedelai pada
proses pembuatan tempe. Medium merupakan bahan isolasi yang
komposisinya diketahui secara jelas. Salah satu contoh medium adalah
nutrient agar.
 c
c

BAB III
METODE PRAKTIKUM

A. Alat dan Bahan

1.c Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah :
a.c Gelas Ukur 2 buah
b.c Gelas Piala 2 buah
c.c Neraca Analitik 1 buah
d.c Hot Plate 1 buah
e.c Spatula 1 buah
f.c Batang pengaduk dari kaca 1 buah
g.c Bunsen 3 buah
h.c Pipet 3 buah
i.c Ôabung Reaksi 5 buah
j.c Cawan Petri 6 buah
k.c Rak tabung reaksi 1 buah
l.c Ose 1 buah
m.c Korek api 1 buah
n.c Kertas label secukupnya
o.c Botol kaca secukupnya
p.c Sumbu secukupnya
2.c Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah :
a.c Nutrient Agar secukupnya
b.c Kapas secukupnya
c.c Alumunium foil secukupnya
d.c Ôanah secukupnya
e.c Ôempe 1 buah
f.c Kue basi secukupnya
g.c Ragi secukupnya
 £c
c

h.c Media Nutrient Agar (NAa secukupnya

i.c Spiritus 2 botol
j.c Fermipan 1 bungkus
k.c Es 4 buah

B. Tempat dan Waktu

Praktikum ini dilaksanakan di laboratorium Mikrobiologi Fakultas

Pertanian Universitas Lambung Mangkurat pada hari Kamis pukul 16.00-
18.00 WIÔA.

C. Cara Kerja

a. c Pembuatan Media

Ditimbang media nutrient agar sesuai untuk volume yang dibutuhkan

yaitu 125 ml media.

Diukur aquadest sebanyak 125 ml menggunakan gelas

ukur.

Dituangkan aquadest ke dalam gelas

piala.

Ditambahkan media yang sudah

ditimbang tadi.

Dipanaskan diatas hot plate

hingga homogen dan mendidih.

Dituang ke dalam tabung reaksi

dan cawan petri
 ´c
c

b.c Isolasi mikroorganisme (bakteri, kapang, khamir dan yeast)

Ditulis kelompok dan tanggal pada kertas label

kemudian ditempelkan pada tutup cawan petri.

Di kocok tabung berisi biakan dengan gerakan ke samping sehingga

suspense tampak rata dan menjaga agar sumbatnya tidak terbasahi.

Dipindahkan secara aspetic satu ose penuh sampel dan goreskanlah

jarum bolak balik beberapa kali di satu permukaan agar.

Di lingkaran pada ujung ose harus terletak datar dan sehorisontal mungkin
terhadap permukaan agar. Kemudian ose dipijarkan dan dibiarkan

Digoreskan dengan ose sejajar pada salah satu tepi media dengan salah
satu sisinya.

Diletakkan cawan petri dalam posisi terbalik untuk diinkubasikan pada

suhu 370C selama 24 jam.

Dilakukan pengamatan dan melingkari koloi-koloni yang terpisah

dan berlainan warna pada permukaan luar cawan petri.

Digambarkan penyebaran koloni yang diamati dan

menggunakan warna yang brbeda sesuai dengan koloni yang
tampak.
 c
c

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

A.c Hasil

Hasil yang dapat diperoleh dari praktikum kali ini adalah sebagai
berikut.
Ôabel 1. Hasil Praktikum

Ôeknik Menggores
No Mikroorganisme
Kuadran Sebar
1. Bakteri Ôanah Ôumbuh sedikit Ôumbuh sedikit
dan tidak menyebar dan tidak
menyebar
2. Bakteri Kapang (Ôempea Ôidak tumbuh Ôumbuh sedikit
dan tidak
menyebar
3. Bakteri Khamir (Kue basia Ôumbuh menyebar Ôumbuh
menyebar
4. Bakteri Ragi (Ôempe busuka Ôumbuh menyebar

5. Fermipan Ôumbuh sedikit Ôumbuh sedikit

dan tidak menyebar dan tidak
menyebar

B.c Pembahasan

Medium pertumbuhan mikrobia adalah suatu bahan yang terdiri dari

campuran nutrien yang diperlukan mikrobia untuk pertumbuhannya.
Aktivitas mikrobia dapat dipelajari dengan menggunakan bahan media
pertumbuhan dan dengan menggunakan media tumbuh dapat dilakukan
isolasi mikrobia menjadi biakan murni.
Praktikum kali ini dilakukan percobaan dalam pembuatan media
Nutrient Agar (NAa yang berfungsi sebagai pertumbuhan bakteri.c Syarat-
syarat membuat media yang perlu diperhatikan dalam membuat media
ialah.
 ¦c
c

-c Media harus mengandung semua unsur makanan yang diperlukan

untuk pertumbuhan dan perkembangbiakkan mikroorganisme.
-c Media harus mempunyai tekanan osmosa tegangan permukaan dan
pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme.
-c Media harus dalam keadaan steril sebelum ditanami mikroorganisme
yang dimaksud jadi tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme lain yang
tidak diharapkan.

Macam-Macam Media Pertumbuhan

1. Medium berdasarkan sifat fisik (bentuka

âc Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah
dingin media menjadi padat. Umumnya dipergunakan untuk bakteri ragi
jamur dan kadang mikroalge.
âc Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0 3-0 4%
sehingga menjadi sedikit kenyal tidak padat tidak begitu cair. Media
semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat
menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran
sempurna jika tergoyang. Biasanya untuk mikroba yang banyak
memerlukan kandungan air dan hidup anaerobik.
âc Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar/tidak ditambah
zat pemadat contohnya adalah NB (p
 
 a LB ( M
 a.
Biasa dipergunakan untuk kiroglae dan bakteri seperti bakteri dan ragi.

2. Medium berdasarkan komposisi (susunana

âc Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui

jenis dan takarannya secara pasti misalnya å M 
  


âc Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui
secara pasti misanya PDA (|   
M 
a yang mengandung
agar dekstrosa dan ekstrak kentang. 
âc Medium non sintesis/alami yaitu media yang dibuat dengan komposisi
yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak
  c
c

dari bahan dasarnya misalnya Ô  

 
! M

|
 "
 

3. Medium berdasarkan tujuan penggunaan

âc Media untuk isolasi

Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan
mikroba misalnya p
 
 


âc Media selektif/penghambat
Media selektif yaitu media yang dibuat untuk menekan pertumbuhan
bakteri yang tidak diinginkan dan meningkatkan pertumbuhan bakteri
yang diinginkan. Media yang hanya cocok untuk species-species
tertentu dan tidak cocok untuk species yang lain. Contohnya adalah
Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang
E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka
 # 
  yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh
#
  M  yang toleran terhadap garam.
âc Media diperkaya (
 a
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar
untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti
darah serum kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk
mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak
hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak tetapi
membutuhkan komponen kompleks misalnya 
 Ô
  


#

dll.
âc Media untuk peremajaan kultur
Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur.
âc Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis
metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah 0M
$M 
 
medium yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan
asam sitrat sebagai sumber karbon.
âc Media untuk karakterisasi bakteri
 c
c

Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu

mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan
adanya perubahan kimia. Contohnya adalah p
  
   M

 


âc Media diferensial
Media diferensial yaitu media yang dibuat untuk memudahkan
mengenali koloni organisme yang diinginkan. Media ini bertujuan
untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter
spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial misalnya ÔSIA
(Ô
 # 
 !
 
a yang mampu memilih Enterobacteria
berdasarkan bentuk warna ukuran koloni dan perubahan warna media
di sekeliling koloni.
Komponen anorganik maupun organic merupakan substrat ataupun
medium yang baik bagi kehidupan mikroorganisme. Mikroorganisme
penghuni tanah merupakan campuran populasi dari protozoa (amoeba
flagllata cilliataa bakteri (clostridium rhizobiuma alga (gangganga
seperti alga biru hijau dan jamur terutama jamur bertingkat rendah
seperti jamur lender berbagai ragi dan berbagai phyromycetes dan
ascomycetes (Suriawiria 1986a.
Ôeknik isolasi dilakukan dengan kondisi alat ± alat yang digunakan
sudah dalam keadaan steril dan di setiap perlakuan harus dilakukan
secara aseptic.
Pengambilan bakteri oleh jarum ose pada tabung reaksi dengan agar
sebagai medianya harus dilakukan dengan menggores bakteri secara
perlahan ± lahan sehingga media agar tidak rusak.
Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk
ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum biasanya terbuat
dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena
panas. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran (a dan
disebut ose atau    %
M
  dan yang berbentuk
lurus disebut    
%Ô
M
 
 !   
cocok untuk melakukan M
 di permukaan agar sedangkan
 
c
c

   

 cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan
pada agar tegak (M    a.
Ôeknik Penanaman
aac Ôeknik Penanaman dengan Goresan (#
a
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau
meremajakan kultur ke dalam media baru.
1.c Goresan Sinambung
Cara kerja.
Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara
kontinyu sampai setengah permukaan agar. Jangan pijarkan loop
lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis. Goresan
sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan
koloni tunggal melainkan untuk peremajaan ke cawan atau
medium baru.

2.c Goresan Ô
Cara kerja.
Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker.
Inokulasi daerah 1 dengan M
 zig-zag. Panaskan jarum
inokulan dan tunggu dingin kemudian lanjutkan M
 zig-zag
pada daerah 2 (M
 pada gambara. Cawan diputar untuk
memperoleh goresan yang sempurna. Lakukan hal yang sama
pada daerah 3.

3.c Goresan Kuadran (#
& 

 a
 ^c
c

Cara kerja.
Hampir sama dengan goresan Ô namun berpola goresan yang
berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal
sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.
Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan
pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-
pisah menjadi koloni tunggal.

bac Ôeknik penanaman dari suspense

Ôeknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat.
Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi
biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggala diambil
beberapa tabung pengenceran terakhir.
1.c #

|  (agar tabur ulasa
#

   adalah teknik menanam dengan menyebarkan
suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni.
Prosedur kerja dapat dilakukan adalah sebagai berikut.
-c Ambil suspensi cairan sebanyak 0 1 ml dengan pipet ukur
kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat.
-c Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot
alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat kemudian
didinginkan dan ditunggu beberapa detik.
-c Disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar
supaya tetesan suspensi merata penyebaran akan lebih efektif
bila cawan ikut diputar.
-c Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas
dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena
panas.
 ‰c
c

2.c |
|  (agar tuanga

Ôeknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oCa untuk
dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu
kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan
menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja
melainkan sel terendam agar (di dalam agara sehingga terdapat sel
yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh
di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung
oksigen. Prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut.
-c Siapkan cawan steril tabung pengenceran yang akan ditanam
dan media padat yang masih cair (>45oCa
-c Ôeteskan 1 ml secara aseptis suspensi sel kedalam cawan
kosong
-c Ôuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar
cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media
kemudian diinkubasi.

Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0 1 ml untuk M



  dan 1 ml untuk 
   karena M

   ditujukan
untuk menumbuhkan dipermukaanya saja sedangkan 
  
membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya
 c
c

sehingga diberikan lebih banyak dari pada M


  (Pradhika
2011a.
 c
c

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

A.c Kesimpulan

Berdasarkan uraian di atas kita dapat mengambil beberapa kesimpulan

antara lain.
1.c Dalam suatu substrat atau media dapat tumbuh dari satu jenis
mikroorganisme dengan demikian lalu dikembangkan suatu teknik
pemisahan yang disebut teknik isolasi sehingga diperoleh atau biakan
yang hanya terdiri dari satu jenis mikroorganisme saja yang disebut
biakan murni.
2.c Ada dua macam teknik isolasi yaitu. Ôeknik Penanaman dengan
Goresan (#
a dan Ôeknik penanaman dari suspense.
3.c Ôeknik isolasi dibutuhkan keterampilan terutama saat menggoreskan
bakteri dengan menggunakan jarum ose di dalam tabung reaksi dengan
Nutient Agar sebagai medianya.
4.c Mikroorganisme terdapat dimana-mana harus sangat berhati-hati
untuk mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak dikehendaki
kedalam biakan murni. Mikroorganisme luar yang tidak dikehendaki
itu dapat masuk melalui kontak langsung dengan permukaan atau
tangan yang tercemar tersentuhnya media atau permukaan tabung
bagian dalam yang belum tersterilkan ataupun melalui aliran udara.

B.c Saran

Saran dari praktikum kali ini adalah :

1. Diharapkan pada praktikan agar tidak memakai kaos kaki yang
berbau tidak sedap demi kenyamanan bersama.
2. Diharapkan kepada semua praktikan agar tidak tidak pulang lebih
dahulu sebelum praktikum selesai dilaksanakan.