LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

STERILISASI ALAT DAN BAHAN PADA PENGUJIAN

MIKROBIOLOGI

KELOMPOK 1 SHIFT 1

1. Asep Irfan Trispandi

(10060308078)

2. Muhamad faisal Rizal

(10060308079)

3. Devianti

(10060308082)

HARI/TANGGAL PRAKTIKUM : KAMIS/8 OKTOBER 2009

HARI/TANGGAL LAPORAN : KAMIS/15 OKTOBER 2009

ASISTEN : NONGKI, S. Si., Apt.

 LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG
2009
1. Tujuan Percobaan

Praktikan dapat memahami dan melaksanakan proses sterilisasi yang tepat dan
sesuai untuk alat dan bahan yang digunakan pada pengujian mikrobiologi serta
mampu menyiapkan dan membuat media steril untuk pengujian mikrobiologi.

2. Teori dasar

Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba

hidup dan spora-sporanya serta mencegah mikroorganisme tersebut agar tidak
kembali hidup. 5 metode umum sterilisasi yaitu:

 Sterilisasi uap (panas lembab)

 Sterilisasi panas kering

 Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi)

 Sterilisasi gas

 Sterilisasi dengan radiasi

Metode yang paling umum digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan pengujian
mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembab) dan metode sterilisasi
panas kering.
a) Sterilisasi Uap (Panas Lembap)
Sterilisasi uap dilakukan dengan autoklaf menggunakan uap air dalam
tekanan sebagai pensterilnya. Bila ada kelembaban (uap air) bakteri akan
terkoagulasi dan dirusak pada temperatur yang lebih rendah dibandingkan
bila tidak ada kelembaban. Mekanisme penghancuran bakteri oleh uap air
panas adalah karena tejadinya denaturasi dan koagulasi (penggumpalan)
beberapa protein esensial dari organism tersebut.
Kondisi – kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi uap dengan
menggunakan autoklaf adalah sebagai berikut:
o Suhu 115,50C, waktu 30 menit.
o Suhu 121,50C, waktu 20 menit.
o Suhu 126,50C, waktu 15 menit
Sebagian besar autoklaf dioperasikan pada suhu 1210C. Metode sterilisasi
uap ini pada umumnya digunakan untuk sterilisasi sediaan farmasi dan
bahan-bahan lain yang tahan terhadap penembusan uap air. Metode ini
digunakan untuk :
o Larutan dengan pembawa air
o Alat-alat gelas
o Pembalut untuk bedah
o Penutup karet dan plastik
o Media untuk pekerjaan mikrobiologi
b) Sterilisasi Panas Kering
Sterilisasi panas kering biasanya dilakukan dengan menggunakan oven
pensteril. Karena panas kering kurang efektif untuk membunuh mikroba
dibandingkan dengan uap air panas maka metode ini memerlukan temperatur
yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang. Sterilisasi panas kering
biasanya ditetapkan pada temperatur 160-1700C dengan waktu 1-2 jam.
Sterilisasi panas kering umumnya digunakan untuk senyawa-senyawa
yang tidak efektif untuk disterilkan dengan uap air panas, karena sifatnya
yang tidak dapat ditembus atau tidak tahan dengan uap air. Senyawa-
senyawa tersebut meliputi minyak lemak, gliserin (berbagai jenis minyak),
dan serbuk yang tidak stabil dengan uap air. Metode ini juga efektif untuk
mensterilkan alat-alat gelas dan bedah.
Karena suhunya sterilisasi yang tinggi, sterilisasi panas kering tidak
dapat digunakan untuk alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan
(contoh: alat ukur), dan penutup karet atau plastik.
 c) Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi)
Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk
mensterilisasi cairan yang mudah rusak jika terkena panas
atau mudah menguap (bahan yang peka panas, misalnya
larutan enzim dan antibiotic). Cairan yang disterilisasi
dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya
sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan
diameter sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron)
sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut.

d) Sterilisasi dengan radiasi

Sterilisasi dengan radiasi dapat dilakukan dengan penyinaran UV. Sinar

Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk
membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet
dengan disinari lampu UV.
e) Sterilisasi kimia
Digunakan apabila dengan sterilisasi panas kering atau sterilisasi tekanan
tinggi akan merusak objek tersebut atau peralatan tidak tersedia.
contoh: Etilen oksida, Gas formaldehid, Glutaraldehid.
o kelebihan : larutan glutyaraldehid dan formaldehid tidak begitu mudah
dinonaktifkan oleh materi organik, kedua larutan ini digunakan untuk
instrumen yang tidak tahan sterilisasi panas ,seperti leparoskop
kekurangan : glutaraldehid mahal harganya. Formaldehid tidak dapat
dicampur dengan clorin karena memproduksi gas berbahaya.

Media adalah suatu substrat dimana mikroorganisme dapat tumbuh yang

disesuaikan dengan lingkungan hidupnya.
Pembuatan media Nutrien Agar (NA) menggunakan bahan utama ekstrak daging
sapi 5 g, pepton 3 g dan agar 3 g. Pada awal pengamatan media Nutrien Agar,
sebelum proses sterilisasi berwarna kuning, setelah sterilisasi warna media menjadi
agak coklat. Pada pembuatan media NA ini ditambahkan pepton agar mikroba cepat
tumbuh, karena mengandung banyak N2 (Dwidjoseputro, 1994). Agar-agar yang
digunakan dalam proses ini untuk mengentalkan media, juga berperan sebagai
media tumbuh yang ideal bagi mikroba (Schlegel, 1993).
Nutrient broth adalah media dasar yang terdiri dari pepton sederhana dan
ekstrak daging sapi. Kontribusi pepton nitrogen organik dalam bentuk asam amino
dan dirantai panjang asam lemak. Ekstrak daging sapi memberikan tambahan
vitamin, karbohidrat, garam dan senyawa nitrogen organik lainnya yang dibutuhkan
untuk kelangsungan hidup dan pertumbuhan mikroorganisme.

3. Alat dan Bahan

Alat Bahan
• Autoklaf • Cawan petri
• Aluminium foil. • Erlenmeyer
• Benang kasur • Gelas ukur (100ml,10ml)
• Gunting • Labu ukur (100ml, 25ml, 10ml)
• Kain kasa • Media ( Nutrient agar, Nutrient
• Kapas Broth)

• Kertas HVS A4 putih • Pipet volume

• Magnetik stirrer Tabung reaksi

• Neraca analitik

4. Prosedur Percobaan
 Persiapan dan sterilisasi alat
1) Alat -alat yang akan disterilisasi dicuci dan dikeringkan.
2) Alat-alat yang mempunyai mulut seperti : Tabung reaksi, Erlenmeyer, gelas
ukur, labu ukur, pipet ditutup dengan kapas berlemak.
Cara :
• Ambil sepotong kapas, lipat kedua ujungnya sehingga berbentuk segi
empat (besarnya bergantung besar mulut). Gulung kapas hingga
berbentuk silinder yang cukup padat, bungkus dengan kain kasa,
kemudian dimasukkan ke dalam mulut alat (2/3 masuk di bagian
mulut alat) serta dibungkus dengan kertas aluminium foil dan diikat
 dengan benang kasur.
• Khusus untuk pipet, pada bagian tutup pipet ditutup dengan kapas,
kemudian seluruh bagian pipet dibungkus dengan kertas HVS.
3) Alat yang permukaannya harus steril ditutup dengan aluminium foil satu per
satu. Cawan petri dibungkus seluruhnya dengan kertas HVS.
4) Alat-alat yang presisi disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210C selama
15-20 menit.
5) Setelah disterilisasi dengan autoklaf, dinginkan alat-alat pada suhu kamar.
Kemudian dimasukkan dalam lemari untuk disimpan.
 Pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer.
1) Nutrient agar ditimbang sebanyak 5,6 gram dan Nutrient broth ditimbang
sebanyak 0,8 gram.
2) Masing-masing media yang telah ditimbang, dimasukkan ke dalam
Erlenmeyer yang sudah diberi tanda (sesuai nama media).
3) Aquades ditambahkan pada media Nutrient agar sebanyak 200 ml dan pada
media Nutrient broth sebanyak 100 ml, lalu panaskan di atas pemanas serta
diaduk dengan magnetik stirrer sampai larutan tidak keruh lagi/jernih.
4) Dinginkan larutan pada suhu kamar, lalu ditutup dengan kapas yang dibalut
dengan kain kasa serta aluminium foil dan diikat dengan benang kasur dan
diberi etiket (tuliskan tanggal pembuatan, nama media, dan nama pembuat).
5) Sterilisasi dengan autoklaf.
6) Setelah steril dinginkan di suhu kamar, kemudian dimasukkan dalam lemari
untuk disimpan.
7) Langkah 1 sampai 4 diulangi sebagai pembuatan media control, dengan NA
sebanyak 2,8 gram ditambah aquades 100 ml. NB sebanyak 0,8 gram
ditambah aquades??
8) Kondisi media diamati dan dicatat (dengan melihat kejernihan). Pengamatan
dilakukan 24 jam.

5. Data Pengamatan
 Pengamatan pada alat-alat yang disterilisasi
Nama Bahan Keterangan
 • Tabung reaksi 10 buah Setelah disterilisasi dengan
• Labu ukur (100ml, 10ml) autoklaf, keadaan alat-alat

• Gelas ukur (100ml, 25ml, 10ml) terlihat tetap bersih.

• Pipet ukur
• Cawan petri

 Pengamatan pada sterilisasi media serta larutan pengencer

Tabel 1. Pengamatan media yang telah disterilisasi
Nama Media Larutan Kondisi
Pengencer
T0 = 12.15 wib (8/10/09) Ta =12.00 wib (9/10/09)
Nutrient Agar • warna : kuning • warna : coklat

• kejernihan : jernih muda

• wujud : cair • kejernihan : keruh

Nutrient Broth • warna : kuning
putih
bening
• kejernihan : jernih
• wujud : cair
• wujud : padat,
pada bagian
lapisan atas tidak
putih (nonkoloni)
• warna : kuning
putih
bening
• kejernihan : jernih
wujud : cair.

Ket : pengamatan dilakukan < 24 jam setelah media disterilisasi.

Tabel 2. Pengamatan media kontrol

Nama Media Larutan Kondisi
Pengencer
T0 = 12.15 wib (8/10/09) Ta =12.00 wib (9/10/09)
Nutrient Agar • warna : kuning • warna putih, keruh,
 • kejernihan : jernih padat, berkoloni
• wujud: cair.
Nutrient Broth • warna : kuning • warna putih
putih • kejernihan : keruh
bening wujud : cair, ada
• kejernihan : jernih gumpalan putih
(berkoloni)
• wujud: cair

Ket: pengamatan dilakukan < 24 jam.

6. Pembahasan
Mikrobiologi merupakan suatu cabang ilmu yang mempelajari, dan
mengamati organisme yang berukuran sangat kecil/ mikroskopis. Organisme
tersebut misalnya bakteri, khamir, dan kapang. Pengenalan dan pemahaman
dikhususkan pada ketiga mikroorganisme ini karena paling banyak dimanfaatkan
pada pengujian mikrobiologi.
Oleh karena itu laboratorium mikrobiologi pastinya dilengkapi dengan alat
yang dapat membantu mengidentifikasi mikroorganisme tersebut. Selain itu,
laboratorium juga dilengkapi dengan peralatan lain yang dapat digunakan sebagai
alat bantu untuk penelitian dan percobaan/ praktikum yang jenisnya tak jauh
berbeda dengan peralatan laboratorium (kimia) pada umumnya, seperti : tabung
reaksi, erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, pipet volume, serta cawan petri yang
berfungsi sebagai tempat pertumbuhan mikroba secara kuantitatif dan sebagai
tempat pengujian sampel.
Alat-alat yang digunakan dalam pengujian mikrobiologi tersebut harus
disterilisasikan terlebih dahulu. Hal tersebut dimaksudkan untuk membebaskan
semua bahan dan peralatan tersebut dari semua bentuk kehidupan (kontaminasi oleh
mikroba) serta mencegah terjadinya kontaminasi terhadap bahan-bahan yang akan
dipakai dalam pengujian mikrobiologi. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3
macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan;
penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan
 glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo, 1993).
Pada praktikum kali ini sterilisasi yang digunakan untuk alat dan bahan
pengujian mikrobiologi adalah sterilisasi uap (panas lembab). Sterilisasi uap
dilakukan dengan autoklaf menggunakan uap air dalam tekanan sebagai
pensterilnya. Uap air panas akan merusak protein esensial mikroba hingga
mengalami koagulasi (penggumpalan), pada saat itu protein akan mengendap
(denaturasi / penghancuran struktur protein) dan menyebabkan kematian pada
mikroba.
Prinsip cara kerja autoklaf yaitu pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam
autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara
yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air,
katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai
tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai
menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan
dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi (tekanannya sama dengan
tekanan atmosfer). Autoklaf
tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Ketika akan membuka, posisikan
tubuh praktikan jauh dari autoklaf. Jangan membuka pintu autoklaf terlalu cepat
(tergesa-gesa) karena uap panasnya yang berbahaya dan dapat menyebabkan
keretakan alat gelas karena perubahan suhu yang
terlalu cepat.

Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan

sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang
bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu
Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini
tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip.
Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses
sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka menunjukkan
autoklaf telah bekerja dengan baik.

Sterilisasi dengan uap (panas lembab) merupakan sterilan yang efektif karena 2
alasan yaitu pertama, uap pekat adalah sebuah kendaraan energi termal yang sangat
efektif. Kedua, uap adalah sterilan yang efektif karena lapisan luar mikroorganisme
yang bersifat protektif dan resistan dapat dilemahkan oleh uap, sehingga terjadi
koagulasi pada bagian mikroorganisme yang sensitif. Selain itu kelebihan sterilisasi
uap (panas lembab) adalah suhu yang digunakan lebih rendah serta waktu yang
dibutuhkan dalam proses sterilisasi lebih cepat daripada metode panas kering (oven
pensteril) atau siklus kimia. Sedangkan kekurangan dari sterilisasi uap (panas
lembab) adalah membutuhkan sumber panas yang terus-menerus dan membutuhkan
peralatan yang perawatannya serius. Untuk itu hal-hal yang harus diperhatikan bila
melakukan sterilisasi uap (panas lembab):

1) Sterilisasi bergantung pada uap, karena itu udara harus

dikosongkan betul-betul dari ruang sterilisator.

2) Semua bagian bahan yang disterilkan harus terkena uap, karena

itu tabung dan labu kosong harus diletakkan dalam posisi tidur
agar udara tidak terperangkap di dasarnya.

3) Bahan-bahan yang berpori atau berbentuk cair harus permeabel

terhadap uap.

4) Suhu sebagaimana yang terukur oleh thermometer harus

mencapai 121 oC dan dipertahankan setinggi itu selama 15
menit.

Pada praktikum kali ini, praktikan juga melakukan pembuatan dan sterilisasi
media serta larutan pengencer. Hal tersebut bertujuan karena pada praktikum
mikrobiologi kelangsungan hidup dan pertumbuhan mikroorganisme dipengaruhi
oleh adanya nutrisi dan faktor lingkungan. Bahan nutrisi yang tersedia dapat berupa
bahan alami dapat pula berupa bahan sintetis. Bahan nutrisi yang digunakan
mikroorganisme biasanya berupa senyawa sederhana yang tersedia secara langsung
atau berasal dari senyawa yang kompleks yang kemudian dipecah oleh
mikroorganisme menjadi senyawa yang sederhana melalui proses enzimatik. Bahan
nutrisi ini dapat berupa cairan atau padatan setengah padat (semi solid), yang
kemudian disebut Media.
Media yang digunakan adalah Nutrient agar dan Nutrient broth. Nutrient agar
adalah nutrisi yang mengandung ekstrak daging sapi, pepton, dan agar-agar dimana
terdapat kandungan karbohidrat dengan berat molekul tinggi yang mengisi dinding
sel rumput laut. Agar-agar tergolong kelompok pektin dan merupakan suatu polimer
yang tersusun dari monomer galaktosa. Gel terbentuk karena pada saat dipanaskan
di air, molekul agar-agar dan air bergerak bebas. Ketika didinginkan, molekul-
molekul agar-agar mulai saling merapat, memadat dan membentuk kisi-kisi yang
mengurung molekul-molekul air, sehingga terbentuk sistem koloid padat-cair. Kisi-
kisi ini dimanfaatkan dalam elektroforesis gel agar-agar untuk menghambat
pergerakan molekul obyek akibat perbedaan tegangan antara dua kutub. Kepadatan
gel agar-agar juga cukup kuat untuk menyangga tumbuhan kecil sehingga sangat
sering dipakai sebagai media dalam kultur jaringan. Agar-agar mulai mencair pada
suhu 85°C dan mulai memadat pada suhu 32-40°C. Jadi tidak seperti air yang
memadat dan mencair pada titik suhu yang sama.
Nutrient broth adalah media dasar yang terdiri dari pepton sederhana dan ekstrak
daging sapi. Kontribusi pepton nitrogen organik dalam bentuk asam amino dan
dirantai panjang asam lemak. Ekstrak daging sapi memberikan tambahan vitamin,
karbohidrat, garam dan senyawa nitrogen organik lainnya untuk kelangsungan hidup
dan pertumbuhan mikroorganisme.
Berdasarkan hasil pengamatan, media Nutrient Agar (NA) sebelum proses
sterilisasi berwarna kuning, setelah sterilisasi warna media menjadi agak coklat
karena pada umumnya pembuatan media NA menggunakan bahan utama ekstrak
daging sapi 5 g, pepton 3 g, dan agar 3 g. Sedangkan adanya lapisan lemak di atas
permukaan NA kontrol (tidak disterilisasi) dan gumpalan putih pada NB kontrol
(tidak disterilisasi) yang merupakan koloni disebabkan bahan pepton yang dapat
mempercepat pertumbuhan mikroba, karena mengandung banyak N2.

7. Kesimpulan
1. Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba
hidup dan spora-sporanya serta mencegah mikroorganisme tersebut agar
tidak kembali hidup Sterilisasi uap mengunakan uap air dalam tekanan
sebagai pensterilnya.
2. Autoklaf merupakan alat pensteril yang paling efektif karena memiliki
kelebihan yaitu, suhu yang digunakan lebih rendah serta waktu yang
dibutuhkan lebih cepat dibandingkan alat pensteril lainnya yang digunakan
dalam pengujian mikrobiologi. Sedangkan kekurangan dari sterilisasi uap
 (panas lembab) adalah membutuhkan sumber panas yang terus-menerus dan
membutuhkan peralatan yang perawatannya serius.
3. 121,5 0C merupakan suhu yang paling efektif untuk menghancurkan
mikroorganisme.
4. Udara, Alat, dan Media praktikum merupakan sumber kontaminasi yang
menghalangi proses pensterilan suatu mikroorganisme.
5. Media merupakan substrat atau nutrisi dimana mikroorganisme dapat
tumbuh yang disesuaikan dengan lingkungan hidupnya.
6. Dari hasil pengamatan, NA dan NB yang telah disterilisasi tetap steril
daripada NA dan NB kontrol yang menghasilkan mikroorganisme yang
berkoloni dan terlihat bergrombol (gumpalan putih).

8. Daftar Pustaka

• Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

• Hadioetomo, Ratna Siri, 1993, Mikrobiologi Dasar dalam Praktek, Gramedia.

• Schlegel, G.H. 1993. General Microbiologi seventh edition. Cambrige

University Press, USA.
• http://farmasiq.blogspot.com
diakses tanggal 11 oktober 2009
• http://makul-rizki.blogspot.com
diakses tanggal 11 oktober 2009
• http://dedistikes.blogspot.com/2009/02/sterilisasi-dan-disinfeksi.html
diakses tanggal 11 oktober 2009
• http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-3-sterilisasi.html.
diakses tanggal 9 oktober 2009