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biologia molecular

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UNIVERDIDADE DE SAO PAULOFACULDADE DE CIENCIAS FARMACEUTICASDEPARTAMENTO DE ANALISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICASLABORATORIO DE BIOLOGAI MOLECULAR ALPLICADA AO DIAGNÓSTICOApostila de noções de Biologia molecular Prof. Dr. Mario H. HirataProfa. Dra Rosário D. C., Hirata1999
 
ÍNDICE
Tópico Página
Aula número 1:
Introdução........................................................................................................................................ 2Estrutura do DNA e RNA...................................................................................................................... 2Replicação, transcrição e tradução...................................................................................................... 4Organização do genoma de eucariotos, procariotos e viral.................................................................. 7Enzimas de restrição e suas aplicações.............................................................................................. 10
Aula número 2:
Extração do DNA genômico .......................................................................................................... 13
Aula número 3:
Princípios de eletroforese.............................................................................................................. 19Fatores que influenciam na eletroforese....................................................................................... 20Tipos de suporte........................................................................................................................... 22Tipos de eletroforese..................................................................................................................... 22Aplicações da eletroforese nas técnicas moleculares................................................................... 23
Aula número 4:
Reação de polimerização em cadeia (PCR)................................................................................... 28Princípios da reação de PCR.............................................................................................................. 28Protocolo geral para PCR.................................................................................................................... 31Fatores que influenciam na PCR......................................................................................................... 31Escolha de iniciadores para PCR........................................................................................................ 35
Aula número 5:
PCR no Diagnóstico das Doenças genéticas................................................................................. 39Polimorfismo e mutações.................................................................................................................... 39Diagnóstico de alguns polimorfismos por PCR.................................................................................... 41Polimorfismo de apolipoproteína......................................................................................................... 42Polimorfismo de receptores da LDL.................................................................................................... 44
Aula número 6:
•−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
PCR no diagnóstico de Doenças infecto-contagiosas------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 46Meningites bacterianas---------------------------------------------------------------------------------------------------- 47Tuberculose-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 50Infecção pelo virus da Hepatite C---------------------------------------------------------------------------------------- 59Infecção pelo virus HIV----------------------------------------------------------------------------------------------------- 64
Aula número 7:
PCR e RFLP na identificação de indivíduos................................................................................... 68
2
 
APLICAÇÃO DA PCR EM LABORATÓRIO CLÍNICO E MEDICINA FORENSE
Aula número 1Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo HirataProf. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata
INTRODUÇÃO
Os avanços nos estudos da biologia molecular em eucariotos tem contribuido significantemente parao entendimento da etiologia das doenças humanas. As técnicas de recombinação dos ácidos nucleicos têmpermitido aos pesquisadores identificar os vários genes responsáveis por doenças hereditárias, avaliar osmecanismos de infecção dos microrganismos, conhecer os processos que regulam a diferenciação eproliferação celular (principalmente nos processos neoplásicos), entre outros. A biologia molecular vemtambém apresentando aplicação bastante expressiva na pesquisa de marcadores genéticos úteis nodiagnóstico laboratorial. Por outro lado, as diferenças nas sequências do DNA, observadas entre asespécies ou entre os indivíduos, são extremamente úteis para as análises forenses, os testes depaternidade, a identificação de antígenos de histo-compatibilidade, a identificação de allelos mutantes, aidentificação de gêneros e espécies de bactérias, fungos, leveduras, vírus e outros.Nesta apostila serão abordados os princípios básicos de biologia molecular, bem como serãodescritas as aplicações da técnica de PCR no diagnóstico clínico e nos testes de identificação.
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA E RNA)
As informações genéticas são armazenadas nos ácidos nucleicos. Há dois tipos de ácidosnucleicos: ácido desoxiribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). O
DNA
é encontrado principalmentenos cromossomos no núcleo das células, enquanto
RNA
está presente no citoplasma, havendo muito pouconos cromossomos.Os ácidos nucleicos consistem de cadeias de
nucleotídeos
. Cada nucleotídeo é constituido por uma base nitrogenada, uma molécula de açúcar e um grupamento de fosfato (PO4
=
). dois tipos deaçúcar nos ácidos nucleicos:
2-deoxiribose
no
 
DNA
 
e
ribose
no RNA (Figura 1A). As bases nitrogenadassão as pirimidinas:
citosina
(
C
),
timina
(
T
) e
uracila
(U) e as purinas:
adenina
(
A
) e
guanina
(
G
). O DNAcontém A, C, G e T, enquanto que o RNA contém U em vez de T. Em ambos DNA e RNA, os nucleotídeosestão ligados formando uma longa cadeia cadeia polinucleotídica. Essa cadeia é formada por ligações entreo grupo fosfato do carbono 5 de um nucleotídeo e o carbono 3 do açúcar do nucleotídeo adjacente (Figura1B).Em geral, o RNA consiste de uma cadeia polinucleotídica simples, enquanto que o DNA é compostode duas cadeias polinucleotídicas pareadas, dispostas em direção contraria, sendo denominadas
antiparalelas
(Figura 1B). As ligações covalentes do esqueleto de açúcar-fosfato localizam-se na parte
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