Producción de pectinasas por Aspergillus niger a partir de cáscaras

de naranja y de toronja como fuente de carbono

Aline M. Beltrán V.*, Carmen Larrondo S.*, Mauricio S. Ramírez B.*,
Aseneth Ruiz C.*, Luis M. Salgado R.*

*Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco, Calz. Del Hueso 1100, Col. Villa Quietud,
Del. Coyoacán, México Distrito Federal.

Resumen: Se realizó un estudio comparativo de la producción de pectinasas por

Aspergillus niger a partir de pectina extraída de cáscaras de naranja y toronja utilizada
como fuente de carbono, debido a la importancia que tienen estas enzimas en diversos
campos de la industria. Se cuantificó la producción de proteínas por el método de
Lowry y se determinaron los azucares reductores por el método de Miller;
posteriormente se determinó la actividad enzimática para comparar la producción de
pectinasas en las diferentes fuentes de carbono. De acuerdo con los datos obtenidos
concluimos que la pectina extraída de la cáscara de naranja induce una mayor
producción de pectinasas por Aspergillus niger.

Abstract: We conducted a comparative study for the production of pectinases by

Aspergillus niger from pectin extracted from orange peel and grapefruit used as
carbon source, because of the importance of this enzymes for many industries. We
quantified the production of proteins by the Lowry method and reducing sugars were
determined by the method of Miller, later determined to compare the enzymatic
activity of pectinases production in different carbon sources. According to the data
obtained, we conclude that pectin extracted from orange peel induces higher
production of pectinases by Aspergillus niger.

1. Introducción sustancias pécticas de diferente

La palabra pectina viene del nombre
griego pectos que significa solidificado
o coagulado. En 1790 Vauquelin
descubrió la pectina como una
sustancia soluble presente en los
zumos de fruta, pero no fue hasta 1824
cuando Braconnot, quien continuó el
trabajo de Vauquelin, llamó a esta
sustancia ácido péctico, ya que tenía
propiedades gelificantes cuando se le
añadía ácido a la solución.1
Actualmente se sabe que la
pectina es una mezcla amplia de
composición que contiene como
componente principal ácido pectínico.
La pectina en forma natural se localiza
en la pared celular y puede estar
entrecruzada con otros polisacáridos
estructurales y proteínas para formar
protopectina insoluble.1
El componente más abundante
de las pectinas es el ácido
galacturónico, que forma el esqueleto
principal de la molécula consistente en
una cadena de residuos de ácido D-
galacturónico unidos mediante enlaces
α - (1 – 4). Estos residuos pueden estar
parcialmente metilados, esterificados
en el C-6 con alcohol metílico, siendo el
grado de metilación variable según el
origen de la pectina. La pectina
también contiene con frecuencia
residuos de ramnosa, arabinosa y
galactosa. Generalmente la ramnosa
forma parte de la cadena principal,
mientras que la arabinosa y la
galactosa se encuentran en las cadenas
laterales unidas a la cadena principal
formando ramificaciones.1
Estas pectinas son ingredientes
muy importantes en la industria de los
alimentos para hacer gelatinas,
helados, salsas, queso. También se
emplean en otras industrias, como la
farmacéutica, que requieren modificar
la viscosidad de sus productos, y en la
industria de los plásticos, así como en
la fabricación de productos es-
pumantes, como agente de clarificación
y aglutinante.2
La degradación de este polímero
requiere la intervención de un sistema
pectinolítico compuesto por varias
enzimas distribuidas en tres grupos
principalmente: pectinesterasas las
cuales catalizan la desesterificación de
los grupos metoxilo, pectina
despolimerasas que rompen los enlaces
α – (1 – 4) glucosídicos por hidrólisis
(polimetilgalacturonasas y poligalactu-
ronasas) o transeliminación (pectina y
pectato liasas), reacciones que
catalizan el rompimiento de la
molécula.3
Las pectinasas actúan de
manera sinérgica y secuencial, son
secretadas en grandes cantidades por
hongos filamentosos, de los que
destacan los del género Aspergillus.
Tanto la actividad como los
mecanismos que controlan su síntesis y
su secreción están bajo la influencia de
diversos factores ambientales, tales
como el pH del medio, la temperatura
de incubación y la naturaleza y
cantidad de la fuente de carbono.4
Las pectinasas figuran entre las
enzimas de aplicación industrial más
antiguas; pueden clasificarse en dos
grandes grupos: ácidas y alcalinas. Las
pectinasas ácidas son utilizadas en la
industria de zumos de fruta y en la
fabricación de vinos. Son
mayoritariamente poligalacturonasas
de origen fúngico, especialmente de A.
niger. Las pectinasas alcalinas se han
introducido en diversos procesos
industriales, como el textil,
principalmente en el enriado de lino y
en el procesado de fibras de plantas.
Las enzimas que se utilizan en estos
sectores proceden mayoritariamente
de bacterias, destacando entre ellas las
producidas por Bacillus.1
El objetivo de este trabajo es
producir pectinasas por Aspergillus
niger a partir de pectina extraída de
cáscaras de naranja y toronja utilizada
como fuente de carbono.
2. Material y métodos
2.1 Preparación de la muestra
Se pesaron 50 g de albedo de naranja y
50 g de albedo de toronja. Se realizó
una extracción ácida de pectina a cada
muestra agregando agua destilada en
ebullición hasta hidratarla, además de
HCl 6N hasta alcanzar un pH de 2 y se
hirvió durante 15 min. Se filtró y con el
residuo se repitió el proceso 2 veces
más y por último se lavó con agua a
ebullición. Finalmente se agregó un
volumen de etanol equivalente al
volumen total de los filtrados
anteriores, dejando reposar 2h para
precipitar la pectina. La pectina
resultante se filtró y se secó a 40°C.*5
2.2 Cuantificación de esporas en el
inóculo
2.2.1 Extracción de las esporas de un
medio sólido
Se agregó solución salina y perlas de
vidrio a la caja de Petri que contenía las
esporas y se agitó suavemente hasta
suspender las esporas. Se tomó 1 mL de
esta suspensión y se llevó a cuenta
directa.
2.2.2 Técnica de cuenta directa en
cámara de Neubauer
La muestra se homogenizó por medio
de agitación y se colocó con una jeringa
estéril entre la cámara y el
cubreobjetos por el borde de la cámara
y se observó al microscopio con el
objetivo de 10x localizando la zona
cuadriculada y se contaron las esporas
presentes en dicha cuadrícula con
ayuda de un cuentacolonias.6 Por
último, ya teniendo la concentración de
esporas en la solución, se realizó una
dilución 2:100 para que el tamaño del
inóculo fuera el conveniente (106
esporas/mL).
2.3 Fermentación
Se prepararon 100 mL de medio de
cultivo basal para cada muestra de
pectina (pectina comercial, extracto de
albedo de naranja y extracto de albedo
de toronja) cuya composición fue la
siguiente: 2 g/L de K2HPO4, 2 g/L de
KH2PO4, 5 g/L de (NH4)2SO4 y 10 g/L
de la fuente de carbono
correspondiente. Posteriormente se
inoculó con 1 mL de la suspensión de
esporas cada uno de los matraces y se
incubaron a 37°C con agitación de 250
rpm durante 72 h*7, tomando muestras
de 6 mL de cada cultivo cada 24 h, las
cuales se centrifugaron a 4500 rpm
durante 10 min y el sobrenadante se
guardó en refrigeración para realizar
pruebas posteriores.
2.4 Determinación de azúcares
reductores
Para determinar azúcares reductores
en las muestras del cultivo de
fermentación se realizó previamente
una curva estándar de azúcares la cual
contempló concentraciones de 0 µg
hasta 1000 µg de glucosa por mL y se le
determinaron azúcares reductores
utilizando el método de Miller8;
posteriormente se utilizó el mismo
método para determinar los azúcares
reductores presentes en el sobre-
nadante de las muestras problema.
2.5 Determinación de proteínas
La cuantificación de proteínas se tomó
en cuenta para evaluar la producción
de enzimas pectinolíticas. Esto se llevo
a cabo utilizando el método de Lowry9,
para lo cual fue necesario realizar una
curva estándar de albúmina cuyo rango
de concentración fue desde 0 µg hasta
100 µg por mL, después se aplicó el
método de Lowry para determinar
proteínas en el sobrenadante de las
muestras problema.
2.6 Determinación de la actividad 3.2 Curva estándar de proteínas
enzimática

Se prepararon dos muestras de: blanco

problema (0.5 ml de extracto
enzimático, 0.5 ml de buffer de acetatos
al 0.1M y 0.5 ml de solución al 0.9% de
pectina), blanco enzima (0.5 ml de
medio, 0.5 ml de buffer de acetatos al
0.1M y 0.5 ml de solución al 0.9% de
pectina), blanco sustrato (0.5 ml de
extracto enzimático, 0.5 ml de buffer de
acetatos al 0.1M y 0.5 ml de agua); La ecuación obtenida a partir de esta
Posteriormente uno de cada uno de los curva estándar se utilizó para calcular
blancos se incubó durante 30 minutos a la cantidad de proteínas presentes en
45°C y los otros se refrigeraron. las muestras problema.
Después se determinaron los azucares
reductores liberados por el método de 3.3 Pectina
DNS.

*La actividad exopectinasas se expresa

como mg de azúcares reductores
liberados/mL de extracto.

3. Resultados y discusión

3.1 Curva estándar de azúcares

reductores.

En las gráficas se observa que en las

primeras 24 horas el microorganismo
Con la curva estándar se obtuvo la produjo enzimas suficientes para
ecuación de la recta, con la cual se degradar el sustrato. Después de 48
determinó la concentración de horas se observa un consumo
azúcares reductores en cada muestra importante de azúcares reductores, por
problema. lo cual el microorganismo produjo
proteínas necesarias para seguir
degradando la pectina.
3.4 Toronja
Analizando las gráficas, en un principio
el microorganismo produjo las enzimas
necesarias para empezar a degradar el
sustrato, por lo que se observa un
aumento en la concentración de
azúcares reductores.
A las 48 horas consumió gran parte del
sustrato, por esto, produjo más
enzimas en busca de metabolizar otra
fuente de energía, sin embargo entre
las 24 y 48 horas es probable que el
sustrato se haya terminado, por lo que
la producción de proteínas bajó
drásticamente.
3.5 Naranja
Como se observa en las gráficas,
durante las primeras 24 horas el
microorganismo aparentemente utilizó
azúcares reductores presentes en el
extracto obtenido que fueron más
accesibles que la pectina; a partir de las
48 horas esta primera fuente de
carbono se agotó y empezó a consumir
la pectina extraída de la naranja, es por
esto que se observa un incremento en
la producción de proteínas y azúcares
reductores.
3.6 Actividad enzimática
Al tomar la pectina como nuestra
fuente de carbono de referencia, se
observa que el extracto de naranja
indujo una actividad enzimática
semejante a ésta; mientras que en el
extracto de toronja es menor.
4. Conclusiones
como fuente de carbono pectina
extraída de cáscaras de naranja y
toronja.
 La pectina extraída de la cáscara de
naranja induce una mayor actividad
enzimática que la extraída de la
cáscara de toronja.

 Es posible que Aspergillus niger

produzca pectinasas utilizando

Referencias

1. Soriano M. 2004. Análisis de sistemas pectinolíticos bacterianos. Aislamiento y

caracterización de las pectinasas. Pela de Paenibacillus sp. BP-23 e YvpA de
Bacillus subtillis. Facultad de Biología. Departamento de Microbiología.
Universidad de Barcelona. España. pp. 8-40.

2. Devia J. 2003. Proceso para producir pectinas cítricas. Universidad EAFIT.

Medellín, Colombia. pp. 22.

3. Trigui-Lahiani H., Gargouri A. 2006. Cloning, genomic organization and mRNA

expression of a pectin lyase gene from a mutant strain of Penicillium occitanis.
Gene Section Functional Genomics. pp.: 54.

4. Arreguín-Rangel L., García-Rivero M., Pérez-Vargas J., Martínez-Trujillo M. y

Aguilar-Osorio G. 2007. Aprovechamiento de residuos de frutas en la
producción de pectinasas y ramnogalacturonasas por dos cepas autóctonas de
Aspergillus. Laboratorio de Catálisis Enzimática. Postgrado de Ingeniería
Bioquímica. Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec. México. pp.: 1.

5. Devia J. 2003. Proceso para producir pectinas cítricas. Universidad EAFIT.

Medellín, Colombia. pp. 24.

6. Aquiahuatl-Ramos M., Pérez-Chabela M., 2004. Manual de prácticas de

laboratorio de microbiología general. Departamento de biotecnología.
Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa. México. pp.67

7. Arreguín-Rangel, L., García-Rivero, M., Pérez-Vargas, J., Martínez-Trujillo, M.A. y

Aguilar-Osorio, G. 2007. Aprovechamiento de residuos de frutas en la producción
de pectinasas y ramnoglacturonasas por 2 cepas autóctonas de Aspergillus.
Laboratorio de catálisis enzimática. Tecnológico de Estudios Superiores de
Ecatepec. México.
8. Miller, G.L. (1959). Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of
reducing sugar. Analytical Chemistry 31: 426-428.

9. Lowry OH, Rosebrough NL, Farr AL y Randall RJ (1951). Protein measurement

with the folin phenol reagent. Journal Biological Chemistry 193: 265-273