Kolegij: Biološka kemija Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju

• studij Farmacije
– 2 sata predavanja + 1 sat vježbi
• studij Medicinske biokemije dr.sc. Sandra Šupraha Goreta
dr. sc. Olga Gornik
– 2 sata predavanja + 1 sat seminara + 1 sat vježbi prof. dr. sc. Jerka Dumić Sonja Čubrilo, dipl. ing.

– voditeljica kolegija: prof. dr. sc. Jerka Dumić Belamarić

– suradnici: doc. dr. sc. Julija Matijević-Sosa
Marija Šanjug, tehničarka
doc. dr. sc. Sanja Dabelić doc.dr.sc. Gordana Maravić
predstojnica Zavoda
doc. dr. sc. Sanja Dabelić
dr. sc. Sandra Šupraha Goreta
Sonja Čubrilo, dipl. inž.
Ruđer Novak, dipl. inž.
Ruđer Novak, dipl. ing.
doc.dr.sc. Julija Matijević-Sosa
prof. dr. sc. Gordan Lauc

Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju Na vježbe je potrebno ponijeti...

• sebe (dolazak na vježbe je obavezan!)

• Farmaceutsko-biokemijski fakultet, A. Kovačića 1, tavan (drugi
• skripta
kat, desno, stepenicama lijevo do tavana)
• bilježnicu (ili papire) i olovku
• praktikum – FBF, A. Kovačića 1, 2. kat lijevo (pored Zavoda za • radne listove (ispunjene za napravljenu prethodnu vježbu,
fiziku) neispunjene za sljedeću vježbu)
• kutu
• studenti se primaju od 11-12 sati, osim ako drukčije nije • krpu
navedeno na oglasnoj ploči
• oglasna ploča Zavoda – na drugom katu, odmah nasuprot Skripta i radni listovi mogu se kupiti u skriptarnici,
stepenicama (ispitni rokovi, rasporedi studenata po FBF, A. Kovačića 1
dvoranama za održavanje kolokvija i ispita, rezultati kolokvija i
ispita...)
Vježbe za pojedine grupe počinju u puni sat (bez
akademske četvrti)!!!
• www.pharma.hr (Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju...)

1
 Grupa V9 Pon¨20.10.; 8-10 Grupa V5 Pon 20.10. 10-12
Biološka kemija – 3. zimski semestar ak. god. 2008/2009. Morena Tošić 1 Ines Malenica 1
Nikolina Tropšek 1 Maja Maljković 1
Od – do Ponedjeljak Utorak Srijeda Četvrtak Petak Subota Sara Tršinar 1 Matea Mandić 1
Lucija Ujdur 2,3 Marija Maras 2,3
7–8
Irena Vidović 2,3 Maša Martinović 2,3
8–9 VJEŽBE PREDAVANJE
V9/V10* L Adela Vidra 2,3 Anita Matić 2,3
SEMINARI V10* 13, 20 i 27.
9 – 10 11.2008 Lana Vinčić 5 Ivana Matić 5
8.15-9.45 h

10 – 11 VJEŽBE VJEŽBE
Petra Visković 5 Ines Meštrić 5
V5/V6* V1/V2*
VJEŽBE Matej Vuk 5 Mirta Meštrović 5
11– 12 V3/V4*
Petra Janeš 6 Mia Metličić 6
12 – 13 VJEŽBE Martina Vukelić 6 Vladimir Mihalic 6
V7/V8*

13 – 14 Sanja Vukoja 6 Iva Mihaljević 6

Sofia Zastavnik 6 Željka Mihlin 7,8
14 – 15 PREDAVANJE
L Anamarija Zdrilić 7,8 Mirta Mikulecky 7,8
14.15-16.30 h
15 – 16 17, 24. 10.2008 Andrea Zlopaša 7,8 Matea Milanović 7,8
7. 11. 2008
5, 12 i
16 – 17 19.12.2008 Iva Zonjić 7,8 Ana Sokolić 7,8
9, 16, 23.1.2009.
Jelena Žanetić 7,8

17 – 18
1. Potenciometrijska titracija aminokiselina 5. Katekolaza (enzimska kinetika)
2. Gel-filtracija hemoglobina 6. Ugljikohidrati
18 – 19 3. Pročišćavanje imunoglobulina G iz humanog seruma 7. Lipidi
4. SDS-poliakrilamidna elektroforeza i Western blot 8. Termička denaturacija DNA
19 - 20

Kolegij: Biološka kemija

• biološke molekule (proteini, NK) zbog svojih funkcionalnih
skupina podliježu

KISELO-BAZNIM REAKCIJAMA
Uvodni seminar za vježbu 1:
Kiselo-bazna svojstva bioloških molekula
HA – kiselina

HA + H2O ⇔
H2O – baza
doc. dr. sc. Sanja Dabelić
A- + H3 O+ A- - konjugirana baza
Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju
H3O+ - konjugirana kiselina

• ponašanje molekula ovisi o kiselosti medija

• nužnost kontrole kiselosti medija (in vivo i in vitro)
• 1923. godine Brönsted i Lowry:
Farmaceutsko-biokemijski fakultet
Sveučilišta u Zagrebu “Kiseline su proton donori, a baze proton akceptori.”
17. listopada 2008.

2
• jakost kiseline opisana je
DISOCIJACIJSKOM KONSTANTOM KONSTANTA DISOCIJACIJE = MJERA JAKOSTI KISELINE
• veća vrijednost konstante ⇒ veći stupanj disocijacije
• reakcija disocijacije kiseline opisana je konstantom ravnoteže kiseline ⇒ kiselina je jača
koja za kiselo-bazne reakcije odgovara disocijacijskoj
konstanti
Ka jakost kiseline
[H O+][A-] 10-14 – 100 slabe kiseline
K= 3 100 – 103 jake kiseline
[HA][H2O] >103 vrlo jake kiseline
• mjera je relativnog protonskog afiniteta konjugiranih
kiselo-baznih parova HA/A- i H3O+/H2O
• jake kiseline u potpunosti otpuštaju protone (H+)
• u razrijeđenim je vodenim otopinama stalna (55.5M)
(nestabilne su u vodi) kojeg prima molekula vode (H20 ⇒ H3O+)
[H3O+][A-] • H3O+ je najstabilnija kiselina u vodenim otopinama
Ka = K[H2O] = • OH- je najstabilnija baza u vodenim otopinama
[HA]

Ka x Kb = [H+] [OH-] = Kw = 10-14 pH = - log [H+] PUFERI

pKa = - log Ka pH = - logaH+
pKb = - log Kb a=fxc • smjese slabih kiselina (baza) i pripadajućih soli
pKa + pKb = 14 • svrha – održavanje stalnog pH

[HA] 1 M CH3COOH 1 M CH3COOH + 1 M CH3COONa

[H+] = Ka x
[A-] Ka = 1,8 x 10-5 M NaAc u potpunosti disocira
[H+][Ac-] [CH3COO-] = 1 M
HENDERSON- HASSELBALCHOVA JEDNADŽBA Ka =
[HAc] [HAc]
[H+] = Ka x
pH = pKa + log
[A-] [H+] = [Ac-] [Ac-]
[HA] [H+] = √Ka x [HAc] [H+] = 1,8 x 10-5 M x
1M
1M
[H+] = √ 1,8 x 10-5 pH = 4,7
pri pH = pKa : [A-] = [HA]
pri pH < pKa : više [HA] [H+] = 4,2 x 10-3 M
pri pH > pKa : više [A-] pH = 2,4

3
 100 ml H2O, pH = 7, n(H+) = 10-8
+ 1 ml, 1 M NaOH, dodali smo 10-3 mol OH- ⇒ [OH-] = 10-4 M Krivulje titracije monoprotonskih kiselina
pH = 10 prikazuju ovisnost promjene pH otopine o količini dodane jake kiseline ili lužine

100 ml pufera 1 M CH3COOH + 1 M CH3COONa, pH = 4.7

+ 1 ml, 1 M NaOH, dodali smo 10-3 mol OH-
10-3 mol OH- neutralizira 10-3 mol CH3COOH pri čemu nastaje 10-3 mol CH3COO- Kiseline Baze
n(CH3COO-) = 0,1 mol + 0,001 mol = 0,101 mol
[CH3COO-] = 1,01 M
n(CH3COOH) = 0,1 mol – 0,001 mol = 0,099 mol CH3COOH CH3COO- + H+ pKa = 4.76
[CH3COOH] = 0,99 M
[HAc]
[H+] = Ka x NH4+ NH3 + H+ pKa = 9.25
[Ac-]
0,99 M
[H+] = 1,8 x 10-5 M x = 1,76 x 10-5 M
1,01 M
pH = 4,75

PUFERSKI KAPACITET
• količina (molovi) kiseline (baze) koju možemo dodati u
pufersku otopinu, a da se pH otopine promijeni za jednu pH
jedinicu od pKa
• MAKSIMALNI PUFERSKI KAPACITET - kad je
[HA] = [A-]

• promjena pH nastala dodatkom kiseline ili baze bit će to

manja što su [HA] i [A-] veći, odnosno što je puferska
otopina koncentriranija
• za pufere u kiselom pH uzimamo suspstance čija je pKa<7, a
za pufere u lužnatom pH području supstance čija je pKa>7
• najčešće upotrbljavani puferi - fosfatni, citratni, glicinski,
karbonatni i tris pufer

4
 Izračunajte maksimalan puferski kapacitet 2M CH3COOH Izračunajte puferski kapacitet pH ≠ pKa
2M CH3COOH pri pH 6,3 pKa = 5,0; c = 2M
pH = pKa pH = 6,3
[A[A]-]+= [HA
−
] = [ukup.
[HA]= cpuferapufera ] [A ] = 6,3 − 5,0 = 1,3
−
log
pKa = 5,0; c = 2M [HA]
pH = pKa + log
[A ]
−
[A ] = 20
−

[HA] [HA ]
log
[A ] = pH − pKa
−
[A ] = 20
−
× 2 = 1,90
[HA] 21
pH = 4,0 pH = 6,0 1
pH = 7,3 [HA ] = × 2 = 0,10 pH = 5,3
log
[A ] = 4,0 − 5,0 = −1
−

log
[A ] = 6,0 − 5,0 = 1
−
[A ] = 7,3 − 5,0 = 2,3
−
21
[A ] = 5,3 − 5,0 = 0,3
−
[HA] [HA] log log
[HA ] [HA ]
[A ] = 0,1
−
[A ] = 10
−
[A ] = 200
−
[A ] = 2
−

[HA] [HA] [HA ] [HA ]

[A ] = 1,1
− 0,1
× 2 = 0,18 [A ] = 10
−
× 2 = 1,82 [A ] = 200
−
× 2 = 1,99 [A ] = 23 × 2 = 1,33
−
11 201
[HA] = 1,0 × 2 = 1,82 [HA] = 1 × 2 = 0,18 1
[HA ] = × 2 = 0,01 [HA ] = 1 × 2 = 0,67
1,1 11 201 3
[H ] = 1,82 − 1,00 = 0,82
+ [OH −] = 1,82 − 1,00 = 0,82 [ −
]
OH = 1,99 − 1,90 = 0,09 [H ] = 0,67 − 0,10 = 0,57
+

Nepolarne
aminokiseline
AMINOKISELINE

• gradivne jedinice proteina

H H H
H+ OH-
+H +H C α COO- C α COO-
3N C α COOH 3N H2N

R R R

5
 Polarne neutralne aminokiseline
R
Polarne nabijene aminokiseline
R

Krivulje titracije aminokiselina

prikazuju ovisnost promjene pH otopine aminokiseline
Titracija 1 dm3 otopine glicil-hidroklorida
o količini dodane jake kiseline ili lužine koncentracije 1 mol dm-3 jakom lužinom
Primjer:
Primjer: glicin
Ionska vrsta Ukupni Ime ionske
naboj vrste
+
H3N CH2COOH +1 glicil-kation
Pri pH=2.3
+
pKa1=2.3 [ H3N-CH2-COOH]=
+H+ -H+ + -
=[ H3N-CH2-COO]
+ -
H3N CH2COO 0 izoelektrični
glicin Pri pH=9.6
+ -
pKa2=9.6 [ H3N-CH2-COO]=
+H+ -H+ -
=[H2N-CH2-COO]
-
H 2N CH 2COO -1 glicinat
n(OH-)/mol

6
 Titracija aminokiselina
Izoelektrič
Izoelektrična toč
točka (pI)
pI) - pH pri kojem je netto-
naboj aminokiseline, peptida ili proteina jednak nuli.

pKa1+pKa2
Računanje pI: pI =
• aminokiseline s nenabijenim bočnim ogrankom: 2
pKa1 + pKa2
pI =
2 Aritmetička sredina pKa
vrijednosti reakcija koje
• općeniti slučaj: uključuju zwitterion
pKa(+1/0) + pKa(0/-1)
pI =
2

• pKa (+1/0) je pKa za ravnotežu između aminokiseline (peptida) s netto-nabojima +1 i 0

• pKa (0/-1) je pKa za ravnotežu između aminokiseline (peptida) s netto-nabojima 0 i -1

VAŽNE NAPOMENE
Vježba 1. • vrijednost pK neke ionizacijske skupine govori o jakosti dotične kiseline
Potenciometrijaka titracija aminokiselina • niža vrijednost pK odgovara jačoj kiselini (pKa = -logKa)
• vrijednost pK ne ovisi samo o kemijskom karakteru dotične skupine, već
i o okolini
O
• Na osnovi krivulje dobivene potenciometrijskom octena
pK = 4.8
H3C O H kiselina
titracijom uzorka odredite o kojoj se aminokiselini
radi.
+
O
• Iz grafa očitajte pKa vrijednosti, pI vrijednost te H3N
O H glicin pK = 2.5
ekvivalente dodane kiseline, odnosno lužine na
osnovi kojih ćete izračunati Mr nepoznate
• u biokemiji se sastav otopina najčešće izražava koncentracijom
aminokiseline iz uzorka. pojedinih tvari, premda bi pravilnije bilo koristiti aktivitete
• aktivitet pojedine tvari ovisi o sastavu otopine
a=fc
za idealne otopine vrijedi:
a = c to jest f = 1

7
 Koliki je pH 10-8 M otopine HCl?
HOH ⇔ H + + OH − [H ] = x
+
[ OH ] = x
−

HCl → H + + Cl − [H ] = 10
+ −8

• jake kiseline u malim koncentracijama potpuno disociraju u vodi

• tom disocijacijom uvijek nastaje ekvivalentna količina H+ iona (H3O+) [H ]+
ukupno
= x + 10 −8 [OH ] = x
−
[H ] × [OH ] = 10
+ − −14

• u 0,1 M HCl nastat će 10-1 M H+ iona i odgovarajući pH bit će 1 (x + 10 )(x ) = 10

−8 −14

• student obično analogijom kaže da će pH otopine 10-8 M HCl biti 8 − 10 ± (10 )

−8 −8 2
− 4 − 10 −14( )
x=
• to dakako nije točno; ma kako jaka kiselina bila razrijeđena njezin pH 2
nikada neće biti alkalan − 10 −8 + 2,0025 ×10 −7
x=
• u rješenju ovog zadatka moramo biti svjesni da će udio H+ iona iz vode 2
biti veći od onog iz HCl x = 9,5125 × 10−8

• iako je koncentracija H+ iona iz HCl mala potiskuje disocijaciju vode pa

[H ] = 10
+ −8
+ 9,1512 ×10 −8 = 10,5125 × 10−8
je ravnoteža pH = −log1,05125 ×10 −7
1
H2O ↔ H+ + OH- pH = + log = log9,512 × 106
1,05125 × 10− 7
pomaknuta u lijevo pH = 0,976 + 6
• rješenje zadatka je sljedeće:
pH = 6,976

Zadatak 1.1 Izračunajte pH otopine glicil-hidroklorida ako je zadano: Zadatak 1.2 Koliko grama NaOH treba dodati u 1 dm3 otopine glicil-hidroklorida c = 0,1 mol dm-3
c (Gly+Cl-) = 0,1 mol dm-3 da se dobije
pKa1(Gly) = 2,3 a) potpuno deprotonirani oblik glicina,
pKa2(Gly) = 9,6
b) pufer s pH = 9,0 ?
Otapanjem glicil-hidroklorida u vodi dolazi do disocijacije H+ prema reakciji: U zadacima ovakvog tipa prije bilo kakvog računanja korisno je skicirati krivulju titracije. Krivulja
+H N-CH -COOH
3 2
+H N-CH -COO-
3 2 + H+ titracije glicina od potpuno deprotoniranog do potpuno protoniranog oblika izgleda otprilike ovako:
sve dok se ne uspostavi ravnoteža:
K a1 =
[H ][ H N − CH − COO ]
+ +
3 2
−

[ H N − CH − COOH ]eq
+
3 2

Znamo izračunati Ka1: Ka1 = 10-pKa1 = 5,01.10-3 mol dm-3

Ostale nepoznanice u izrazu za konstantu ravnoteže trebamo izraziti pomoću tražene nepoznanice [H+]. Počinjemo s
[H+] = [+H3N-CH2-COO-] + 10-7 mol dm-3
U otopinama u kojima koncentracija proteina nije jako niska vrijedi
[+H3N-CH2-COO-] >> 10-7 mol dm-3, te je
[H+] ≈ [+H3N-CH2-COO-]
Posljednju nepoznanicu izražavamo kao
[+H3N-CH2-COOH] = c (Gly+Cl-) - [+H3N-CH2-COO-] = c (Gly+Cl-) - [H+]
Sada sve ovo uvrštamo u izraz za konstantu ravnoteže, te dobivamo:
[H+ ]2 Nakon toga valja obratiti na pozornost na:
K a1 = • početno stanje, tj. odgovoriti na pitanje gdje se na krivulji nalazi glicin u onom obliku u kojem
[ ]
c(Gly + Cl − ) − H+
prevladava prije dodavanja lužine: budući da ovdje imamo glicil hidroklorid - maksimalno protonirani
Ovaj izraz transformiramo u standardni oblik kvadratne jednadžbe s [H+]
kao nepoznanicom:
[H+]2 + Ka1 [H+] - Ka1 x c (Gly+Cl-) = 0 oblik glicina - na krivulji titracija počinje od krajnje lijeve točke na krivulji;
Računamo: • konačno stanje, tj. odrediti položaj zadanog konačnog stanja aminokiseline na krivulji titracije.
[H+]2 + 5,01 x 10-3 mol dm-3 [H+] – 5,01 x 10-3 . 0,1 mol2 dm-6 = 0 Kada smo odredili ove dvije točke, iz krivulje vidimo koliko ekvivalenata NaOH (tj. mola NaOH po
[H+] = 2 x 10-2 mol dm-3 pH = - log [H+] = 1,7 molu aminokiseline) treba dodati u otopinu aminokiseline za prijelaz iz početnog u konačno stanje.

8
a) Za potpuno deprotoniranje glicina koji je u početku potpuno protoniran treba 2 ekv(OH-) (vidi strelicu Zadatak 1.3 Napišite moguća ionizacijska stanja i skicirajte titracijsku krivulju histidina.
na slici označenu s -a-). Ekvivalent NaOH u zadanom slučaju iznosi Na apscisi označite ekvivalente OH-.
ekv(OH-) = n(Gly+Cl-) = c(Gly+Cl-) x V= 0,1mol Zadano je: pKa1 (His) = 1,8 pKa2 (His) = 9,2 pKaR (His) = 6,0
Masu NaOH računamo kao
m(NaOH) = n(NaOH) x M(NaOH) = 0,2 mol x 40 g mol-1 = 8 g
b) Za titriranje zadane otopine do pufera s pH 9.0 treba nam jedan cijeli ekvivalent (od glicil-kationa do
izoelektričnog glicina), te ostatak potreban za podizanje pH na 9,0. Ovaj ostatak računamo pomoću
Henderson-Hasselbalchove jednadžbe:

pH = pKa2 + log
[Gly− ]
[Gly0 ]
[Gly ] =10
−
pH−pKa 2
= 10−0.6 = 0,25
[Gly ]
0

Ovo znači da pri pH=9,0 ima četiri puta više Gly0 no Gly-, odnosno
20 % Gly-
80 % Gly0
Stoga je za titraciju od potpuno protoniranog oblika do pH 9,0 treba
(1 + 0,2) ekv(OH-) = 0,12 mol (NaOH) Histidin ima tri ionizacijske skupine, što znači da će za njegovu titraciju od potpuno protoniranog do
Iz ovog podatka izračuna se potpuno deprotoniranog oblika biti potrebno 3 ekv (OH-). Tri puferska platoa imaju središte na
polovicama ekvivalenata, kada je pH jednak pKa pripadne ionizabilne skupine.
m (NaOH) = 4,8 g

Zadatak 1.4 Napišite moguća ionizacijska stanja i skicirajte titracijsku krivulju dipeptida Arg-His. Zadatak 1.5
Na apscisi označite ekvivalente OH-. pH 0.1M otopine slabe kiseline HA je 3,0.
+
O a) Koliki je stupanj disocijacije ove kiseline?
Prvo nacrtamo dipeptid: p K a (α-
(a-N H 3 + ) H 3 N CH C N CH COOH b) Koliki je Ka?
H pK a (α-
(a-C O O H )
(p rip ada arg inin u)
( CH 2 ) 3
C H2 (pripad a his tid inu ) c) Koliko OH- iona ima u 500 ml 0,1 M otopine?
d) Koliko molekula nedisocirane HA ima u 250 ml 0,1M otopine?
NH +
HN NH Zadatak 1.6
C +
H2N NH 2 pK aR (H is ) pKb metilamina je 3,4 pri 25° C.
pK aR (A rg) Koliki je pH 0,01M otopine?

Zadatak 1.7
Tris-(hidroksimetil)-aminometan je slaba baza. Koliki je omjer koncentracije trisa (Tris) i njegove
konjugirane kiseline (TrisH+) pri pH = 8,0? (pKa = 8,08)

Zadatak 1.8
Koliki je puferski kapacitet 0.1 M citratnog pufera pri pH 3.1? pKa vrijednosti citratnog pufera su
pKa1 = 3,1, pKa2 = 4,75, pKa3 = 5,4.

Zadatak 1.9
Usporedi puferski kapacitet 0.1M i 0.2M TrisHCl pufera pri pH = pKa = 8,08.

Zadatak 1.10
Ako je ukupna koncetracija Trisa iz zadatka 1.7 100 mM, kolika će biti promjena pH nakon dodatka 5
mM H3O+? Ako smanjimo koncentraciju trisa na 2 x 10-2 M, kolika će tada nastati promjena pH?