Sobre a transformación bacteriana de E.

coli
HB101 co plásmido pGLO
Enfocando o tema

1. Para transformar xenéticamente un individuo completo, temos que

introducir o novo xen en cada célula do organismos ou, cando menos, en
cada unha das células encargadas de expresar ese xen. Segundo isto, que
tipo de organismo é optimo para unha trnasformación total?

Un organismos unicelular é o mellor receptor posible para unha

transformación xenética, porque a transferencia só ten que se producir
nunha célula.

2. Unha cuestión importante é poder saber se un organismo transformado

pode trasmitir as súas novas características xenéticas á súa descendencia
e ás xeracións futuras. Para conseguir esta información, que característica
ha de ter un bo candidato a investigar?

Ten que ser un organismo que se reproduza rápidamente. Unha rápida

producción de descendencia e, mellor aínda, con unha proxenie numerosa,
permite observar axiña se o carácter é transmitido ou non.

3. A seguridade é outro factor importante a considerar na elección dun

organismo experimental. Que características ha de ter (ou non ter) un
organismo para asegurarmos que non mancará ás persoas ou ó medio
ambiente?

O organismo non debe producir toxinas ou compostos que poidan mancar

ós seres humanos. Tería que medrar de xeito vigoroso nas condición do
laboratorio, pero non ser quen de sobrevivir fora do mesmo. Tampouco ten
que infectar plantas ou animais (non pode chegar á cadea alimenticia).

4. Sobre a base destas consideracións, cal é a mellor elección para unha

transformación xenética: unha bacteria, un verme (anélido, platelminto,
nematodo, ...), un peixe ou un rato?

A bacteria é sen dúbida o mellor hóspede. A bacteria é pequena, unicelular

e a súa reproducción é rápida e doada.

NOTA: A bacteria Escherichia coli en xeral, e a cepa HB101 en particular,

cumpre tódolos requisitos anteriores; é unicelular como calquera bacteria, o
seu tempo de duplicación é de 20 minutos, non produce danos en humanos
sans e non medra de xeito doado fora do ambiente do laboratorio cando se
adoptan as precaucións básicas.

Outras consideracións

1. Lembremos que o obxectivo da transformación é un cambio nas

características do organismo (fenotipo). Antes da observación dos cambios
fenotípicos, evidentemente, temos que observar o fenotipo salvaxe, punto
imprescindible de comparación. Na nosa práctica, ese punto ven dado polo
aspecto colonial nas placas de partida.

As características nas que temos que poñer atención son o color das
colonias, o número das mesmas e a súa distribución sobre o agar.

2. Cómo se pode facer para saber como afecta a ampicilina á bacteria E.

coli?

Podemos inocular cantidades iguais de células de E.coli en dúas placas de

agar nutritivo LB, una delas só con Agar LB e outra con Agar LB
suplementado con ampicilina. O crecemento de E.coli sobre as dúas placas
pode ser comparado. Se a ampicilina afecta negativamente ó crecemento
das bacterias, na placa correspondente haberá menos colonias. Se a
ampicilina non afecta ó crecemento, o número de colonias (ou a supercicie
na que se observa crecemento) serán semellantes en ámbalas dúas placas.

Os antibióticos adoitan matar bacterias (axentes bactericidas) ou inhibir o

seu crecemento (axentes bacteriostáticos). Así, atoparanse poucas, ou
nengunha, colonias na placa que contén agar LB + ampicilina. A presenza
de crecemento nesa placa pódese explicar pola presenza de bacterias
resistentes á ampicilina.

Cuestións de revisión

1. En cal das placas agardamos atopar bacterias máis semellantes ás E.coli

non transformadas inicialmente observadas?

As bacterias semellantes ás E.coli non transformadas atoparanse na placa

-pGLO, LB. Estas bacterias foron transferidas desde a placa de inicio, sen
que se lles engadira plásmido e foron inoculadas sobre a placa co medio LB
(sen ampicilina e sen arabinosa). Deste xeito, son virtualmente idénticas as
bacterias non transformadas do cultivo de partida.

2. Se ten lugar o proceso de transformación xenética, en que placas é máis

doado atopalas?

Nas placas LB/amp e LB/amp/ara. As células xenéticamente

transformadas tomaron ó plásmido pGLO que expresa o xen da resistencia
á ampicilina o que permite que esas bacterias sexan quen de medrar en
placas nas que está presente ese antibiótico.

3. Que placas se teñen que comparar para determinar se efectivamente tivo

lugar a transformación xenética?

A placa -pGLO, LB/amp e a placa +pGLO, LB/amp poden ser comparadas

de xeito directo. As células que non foron tratadas con ADN (-pGLO) non
expresan o xen da resitencia á ampicilina e non medran nas placas
LB/amp. As células tratadas con ADN (+pGLO) conteñen o plásmido e
expresan ese xen polo que, nesa placa, aparecen colonias das bacterias
transformadas.
4. Que podemos saber coa placa de control?

Unha placa de control é unha axuda na interpretación dos resultados

experimentais. Nesta práctica, as placas -pGLO son placas de control. A
placa -pGLO, LB/amp compárase coa placa +pGLO, LB/amp. Esta
comparación permite demostrar que as bacterias froito do proceso de
transformación poden medrar nun medio con ampicilina, debido á
incorporación no seu xenoma do plásmido pGLO e á expresión do xen da
resistencia á ampicilina. A placa de control -pGLO, LB pode ser comparada
con calquera das placas LB/amp para amosar que o plásmido incorporado
é preciso para o crecemento en presencia de ampicilina. A placa -pGLO,
LB/amp amosa que o cultivo de inicio non medra sobre medio con
ampicilina. Sin este control non seríamos quen de saber se as colonias que
medran sobre o medio +pGLO, LB/amp son transformadas ou non.

Expresión de resultados
A tabla de resultados debería asemellarse á seguinte:

Placa Observacións
+pGLO, LB/amp [~#] Múltiples colonias de
bacterias transformadas de
coloración blanquecina.
+pGLO, LB/amp/ara [~#] Múltiples colonias de
bacterias transformadas.
Coloración blanquecina
baixo luz de día e verdes
brilante baixo luz UV.
-pGLO, LB/amp Non debería apreciarse
crecemento bacteriano.
-pGLO, LB Crecemento abundante
bacteriano, incontable
número de colonias.
Coloración blanquecina.
Probablemente as colonias
teñen un diámetro moito
menor que nas placas
+pGLO pola limitación de
recursos que supón o maior
crecemento.

Interpretación dos resultados

1. ¿Que caracteres dos orixinalmente observados na morfoloxía colonial da

placa de inicio semellan no ter cambiado?

As colonias do cultivo inicial eran tamén blanquecinas observadas baixo luz

de día.

2. ¿Que caracteres dos orixinalmente observados é agora, despois do

proceso de transformación, significativamente diferente?

• As colonias aparecidas sobre o medio LB/amp/ara son de cor verde

brilante cando son observadas baixo luz UV.
• As colonias tranformadas (+pGLO) son quen de medrar sobre medio
con ampicilina (son resistentes).

3. Se as células xenéticamente transformadas adquiriron a habilidade de

medrar en presenza de ampicilina, que podemos inferir dos outros xenes
presentes no plásmido relacionados co proceso de transformación?
 O plásmido pode
expresar o xen para a
resistencia á
ampicilina (a proteína
producto do xen 'bla'
que codifica a ß-
lactamasa, a proteína
que cataliza a ruptura
da molécula
ampicilina). Mapa xenómico do plásmido pGLO
usado na práctica.
Atopado na procura de imaxes de Google usando a
cadea alfanumérica "pglo" como motivo de procura

Os plásmidos son pequenas moléculas de ADN circular que se atopan

dentro das células bacterianas. Replican o seu propio ADN usando as
polimerasas celulares. Deste xeito poden permanecer indefinidamente
dentro das células facendo pouco más que o traballo de seu.

Debido ó seu pequeno tamaño poden ser extraídos de forma doada e

purificadas a partires das células bacterianas. E cando se rompen usando
enzimas de restricción, poden xuntarse con outro ADN de distintas fontes
que foron fragmentados coas mesmas enzimas.

O resultado son moléculas híbridas de ADN que se poden reintroducir en

células bacterianas para procesos de transformación. Así, eses plásmidos
híbridos pódense manter en cultivos bacterianos puros. Decimos que o ADN
orixinal das células hóspede foi clonado e ó plásmido portador do ADN
estraño, chamámolo vehículo clónico ou, máis normalmente, vector.

Ademáis da súa utilidade para clonar xenes, ás veces os plásmidos portan

xenes de seu. As bacterias son susceptibles ós antibióticos. Con todo, os
xenes que codifican resistencia antibiótica permiten ás bacterias medrar en
medios nos que están presentes antibióticos coma a ampicilina. Este tipo de
xen adoita estar presente nos plásmidos. Cando un ADN insértase nun
plásmido, e estos híbridos se introducen nas células bacterianas para
inducir a tranformación xénica desas células, é doado seleccionar as
bacterias que recibiron os plásmidos (porque esas células adquiriron a
habilidade de medrar en presenza de antibiótico, mentres que as que non o
recibiron non se desenvolven no mesmo medio de cultivo).

Librerías de ADN

Cando o ADN extráese dunha célula dada, pode ser cortada en pequenos
anacos que se poden clonar en masa en poboacións de plásmidos. Este
proceso produce poboacións de ADNs híbridos (recombinantes). Despois
de introducir estes híbridos en células, cada célula tranformada recibe, e é
quen de propagar, un único tipo híbrido. Cada un dos tipos de híbrido
contén o mesmo vector ADN pero un diferente ADN insertado.
Se por exemplo temos 1.000 fragmentos diferentes de ADN nunha mestura,
formaranse 1.000 tipos de híbridos distintos e 1.000 tipos diferentes de
células transformadas, cada una delas transportando un dos 1.000
fragmentos distintos de información xenética (ADN) orixinal. Unha colección
deste tipo chámase librería de ADN. Se o ADN orixinal é de orixen humano,
a librería sería tamén humana.

Podemos extraer un fragmento determinado da información contida nunha

librería mediante rastreo da mesma usando técnicas das chamadas "de
screening" (de cribado).

4. Como podemos probar que os cambios observados foron causados polo

procedemento de transformacion?

A mellor forma é comparar as placas de control. As células non tratadas co

plásmido (-pGLO) non poden medrar en presenza de ampicilina, mentres
que as que foron tratadas (+pGLO) si poden facelo. Esto implica que a
resistencia á ampicilina foi proporcionada polo tratamento, noutras
palabras, o plásmido proporciona a resistencia.

5. Tendo en conta que a solución acuosa que contiña o plásmido,

introducida no tubo +pGLO nun dos primeiros pasos do procedemento, non
emite fluorescencia, que dous posibles orixes da fluorescencia poden ser
descartados?

O plásmido pGLO (o ADN que o conforma) e a bacteria orixinal non son as

causas directas da fluorescencia. Nin a solución de plásmido emite
fluorescencia nin se observa esta característica nas colonias que medran
nas placas -pGLO e +pGLO, LB/amp.
A fonte da florescencia probablemente sexa algunha proteína codificada no
ADN do plásmido. Para entender a causa da aparición de fluorescencia na
placa +pGLO, LB/amp/ara, temos que ter en conta a estructura do xenoma
do plásmido pGLO (imaxe anterior) e o funcionamento do operón arabinosa
(imaxe seguinte):
Atopado na procura de imaxes de Google usando a cadea alfanumérica "operon arabinosa" como motivo de procura
A regulación da expresión de proteínas adoita ocorrer a nivel de
transcripción do ADN en ARN (aínda que non é a única alternativa). Esta
regulación ten lugar nun lugar específico do ADN chamado promotor, lugar
onde a ARN-polimerasa se xunta ó ADN e comeza a transcripción do xen.
Nas bacterias, algúns xens relacionados, se sitúan xuntos e son transcritos
a partires dun único promotor. Estos grupos, controlados por un único
promotor, que pode á súa vez regulado, chámanse operóns.

Os tres xenes (araB, araA e araD) que codifican tres enzimas dixestivas
relacionadas coa catálise da arabinosa están xuntos no chamado operón
arabinosa. Estos xene que expresan as proteínas funcionais reciben o
nome de "estructurais". A súa transcripción ten lugar a partires dun único
promotor (PBAD). A transcripción destes tres xenes precisa a presenza,
simultaneamente, do ADN molde (promotor e xenes estructurais), ARN
polimerasa, unha proteína que se xunta ó ADN (chamada araC) e
arabinosa. A proteína araC xúntase co ADN no sitio de unión da ARN-
polimerasa, chamado promotor, situado xusto antes da posición dos xenes
estructurais. Se no medio está presente a arabinosa, a bacteria a incorpora.
Unha vez no interior celular, a arabinosa interactúa coa proteína araC unida
ó ADN. A interacción provoca un cambio conformacional que promove a
unión da ARN-polimerasa de xeito que os xenes estructurais transcríbense.
Como consecuencia, prodúcense as tres enzimas que rompen a arabinosa
para que se incorpore ó catabolismo. En ausencia de arabinosa, a proteína
araC regresa á súa conformación espacial orixinal e a transcripción cesa.

O ADN do plásmido pGLO foi alterado mediante enxeñería xenética para

incorporar o sistema de regulamento do sistema operón araninosa. O
promotor (PBAD) e o xen da proteína araC foron incorporados, mentres que
os xens araB, araA e araD foron reemplazados polo xen único que codifica
a proteína fluorescente verde (GFP). Deste xeito, en presenza de
arabinosa, a proteína araC promove a unión do ARN-pol e prodúcese GFP.
En ausenza de arabinosa, a proteína C non facilita máis a xuntanza da AN-
pol e a proteína GFT non se produce. Se non se produce GFP as colonias
resultantes teñen o fenotipo salvaxe (cor blanquecino sen fluorescencia
baixo UV).

6. Cómo se pode saber si o experimento de tranformación foi satisfactorio

ou non?

O éxito experimental ven representado pola presenza de colonias nas dúas

placas +pGLO (LB/amp e LB/amp/ara) e pola ausenza de colonias na
placa -pGLO, LB/amp. Tamén, pola presenza de fluorescencia verde
brilante nas colonias da placa +pGLO, LB/amp/ara.

Un experimento non exitoso pode ser un no que non medran colonias nas
placas +pGLO. ISto pode ocurrir se non inoculamos o plásmido e/ou a
bacteria no tubo +pGLO nos primeiro pasos do protocolo.