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série
Stéphane Goulaouic,
d’après Laurent Foucaud
Présentation des TP
Série de TP centrée sur les protéines
Caractérisation
Détermination de leur activité enzymatique
5 séances de TP
CCM
Couvercle
Front d’élution
A B C X (plaque de silice)
Phase mobile
(solvant de migration)
TP 1 : Les techniques de chromatographie
La phase mobile utilisée est la suivante :
Buthanol 16 mL
Acide acétique 8 mL
Eau 4 mL
Caractériser ce mélange
Le mélange est constitué de solvants organiques très
polaires (un alcool et un acide), ils vont donc facilement
entraîner les molécules hydrophiles notamment les
molécules polaires.
Structure générale des acides aminés
Composés à séparer
bleu Dextran (très grosse molécule 2000 kDa,
polysaccharide)
hémoglobine (PM 68 kDa)
catalase (PM 220 kDa)
En conséquence :
_
+ le % d'acrylamide est élevé, les molécules volumineuses peuvent migrer
moins
une protéine globulaire (assimilable à une sphère) migre d'autant que
sa masse molaire est élevée
TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse
mobilité relative =
= k [S]
TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase
Comment déterminer le temps de mesure d’une réaction enzymatique,
comment évolue la quantité de substrats au cours du temps ?
Le corollaire comment évolue la quantité de produit ?
1
TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline
1
TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline
TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline
Les facteurs influençant la réaction enzymatique
pH
Aux valeurs extrêmes, il dénature, donc désactive la protéine en modifiant l’état
d’ionisation des chaînes latérales des acides aminés
Aux valeurs intermédiaires, il influe sur l’activité en modifiant l’état d’ionisation des
acides aminés du site actif et celui du substrat
-> courbe en cloche, en général V i max pour des pH voisin de la neutralité
Température
Accélère les réactions en fournissant l’énergie nécessaire au franchissement de
la barrière due à l’énergie d’activation
Dénature progressivement (et désactive) les protéines (struct 2 aire et 3aire)
-> courbe dissymétrique, la vitesse est multipliée par deux tous les 10 °C jusqu’à
une température optimale, puis diminue rapidement
Les inhibiteurs
Ils ralentissent la vitesse de réaction jusqu’à la stopper
TP 5 : Activité spécifique de la -fructosidase
Mais aussi de tester l’effet d’un inhibiteur sur cette réaction enzymatique
Inhibiteurs mixtes
3. Inhibiteurs incompétitifs
Les facteurs influençant la réaction enzymatique
Les inhibiteurs : ils ralentissent la vitesse de réaction jusqu’à la
stopper.
Réversibles
Compétitifs = analogues structuraux du substrat
Inhibiteurs mixtes