Kuliah ke tujuh :

BIOKIMIA
FAKULTAS
KESEHATAN MASYARAKAT
1
 ~

Spesifisitas Substrat Katalisator anorganik/organik

(sangat tinggi) ( lebih sederhana )

Efisiensi Katalitik
(luar biasa)

Katalitis Reaksi Individual

(cepat dan selektif)
2
 Enzim

Melibatkan serangkaian Intermediate yang terikat

Enzim

(bukan satu intermediet substrat – enzim tunggal)

3
Tujuan mekanisme ini untuk memahami
pada tingkat molekuler

Enzim merupakan katalisator yang

Efisien dan Spesifik

4
• Identifikasi langkah dalam menentukan
kecepatan reaksi,
• Karakterisasi intermediet yang terikat
enzim,
• Identifikasi ion logam (gugus fungsional
residu asam amino),
• Koenzim,
• Gugus prostetik yang terikat dalam
pengikatan substrat,
• Produk
• Intermediet pada tapak aktif.
5
6
 Pemeriksaan Kristalografi sinar x
+
Informasi Mekanistik

Memudahkan Rancangan Obat

Contoh: inhibisi enzim HMG-KoA-reduktase

Enzim pemicu Biosintesis Kolesterol 7

Memanfaatkan teknologi
Mutagenesis
DNA rekombinan

Diarahkan pada tapak aktif enzim

Untuk memodifikasi spesifisitas enzim dan

efisiensi katalisnya.
8
Kimotripsin sifat umum katalis enzim
(enzim kimotripsin kerjanya mengkatalisis hidrolisis
ikatan peptida)

• Gugus karbolik diberikan oleh asam amino aromatik,

(Phe, Tyr, atau Trp), atau oleh asam amino dengan
gugus R non polar yang besar (Met).

• Seperti enzim protease yang lain, kimotripsin juga

mengkatalisis senyawa ester tertentu.

9
Substrat sintetik p-nitrofenil asetat (PNPA)
untuk analisis kolorimetrik terhadap aktivitas
Enzim Kimotripsin, karena pada hidrolisis PNPA
p-nitrofenol.
O

N
O
O

p- nitrofenil asetat (PNPA)

alkalis
p-nitrofenol Anion p-nitrofenilat
(Berwarna kuning) 10
 Kinetika laju hidrolisis kimotripsin terhadap PNPA
Dapat diteliti dengan alat STOP – FLOW.

Alat STOP – FLOW

Terdiri dari dua lubang

Lubang pertama Lubang kedua

(Kimotripsin) (PNPA)

Kedua lubang secara serentak mengeluarkan isinya

masuk ke tabung yang sempit melewati alat
Spektrofotometer yang dihubungkan dengan komputer
11
Pelepasan anion p-nitrofenilat berlangsung dalam
2 fase (bifasik)
Fenol yang dibebaskan
Fase keadaan mantap
(steady state phase)

Fase ledakan (burst phase)

Waktu (mili detik)

1. Fase ledakan, ditandai dengan pembebasan cepat PNP
2. Pelepasan PNP tambahan lebih lambat
H2O Ac-
fenol

CT + PNPA CT-PNPA CT-Ac CT

Cepat Cepat Lambat 12
 Mutagenesis Tapak aktif enzim
(wawasan mekanistik)

Teknik Biologi Molekuler Penyelidikan

Mekanisme Kerja Enzim

Rangkaian basa
nukleotida pada gen

Mengekspresikan protein dalam hospes

Atau bakteri Escherichia coli.
13
 Kombinasi Larutan Kristalografi sinar x

Struktur Kinetik Teknik

3 dimensi Klasik Molekuler

Wawasan Baru dalam mekanisme kerja enzim

14
 Data Fisik dan Kinetik

Asam amino turut berperan dalam

Katalisis yang spesifik (sebagai basa
umum atau sebagai pemindah gugus)

Pendekatan yang lebih umum adalah

“MUTAGENESIS BERORIENTASI TAPAK”
( dengan mengubah rangkaian basa sebuah
kodon spesifik, dapat mengganti
asam amino tertentu dengan asam amino
protein lain ). 15
 “ METALOENZIM “

Mengandung ion logam fungsionil dalam jumlah yang pasti

(ion logam dapat menfasilitasi ikatan substrat dengan katalis)

Ion logam diteliti dengan :

1. Kristalografi sinar x
2. MRI (Magnetic Resonance Imaging)
3. ESR (Electron Spin Resonance)

16
 Enzim yang diaktifkan oleh logam

Ikatan yang lemah dengan logam

(sehingga memerlukan logam tambahan)

Perbedaan metaloenzim dengan enzim yang

diaktifkan oleh logam terletak pada Afinitas
Enzim terhadap ion logamnya.

17
Kompleks terner (kompleks dengan 3 komponen),
yaitu : tapak katalitik enzim (Enz), sebuah
ion logam (M), dan substrat (S)

Yang memperlihatkan susunan

Stokiometri 1 : 1 : 1, dalam 4 skema
Enz - S - M M - Enz - S
kompleks jembatan substrat kompleks jembatan enzim
M
Ens - M - S Ens
kompleks jembatan logam
sederhana S
kompleks jembatan logam
siklik 18
 Metaloenzim tidak dapat membentuk kompleks
terner karena metaloenzim mempertahankan
Logam selama proses pemurnian, yaitu Enz-M
Tiga aturan umum :
1. Sebagian besar, tetapi tidak semua enzim kinase (ATP:
fosfotransferase) membentuk kompleks jembatan
substrat: Enz–nukleotida–M
2. Enzim fosfotransferase yang menggunakan piruvat atau
fosfoenolpiruvat sebagai substrat, enzim yang
mengkatalisis reaksi fosfoenolpiruvat lain, dan enzim
karboksilase, membentuk kompleks jembatan logam
3. Suatu enzim tertentu dapat membentuk satu tipe
kompleks jembatan dengan satu substrat, membentuk
tipe kompleks yang berbeda dengan substrat lyang lain.
19
A. Kompleks Jembatan Enzim ( M-Ens-S)
Logam dalam kompleks jembatan enzim

Peranan Struktural
(mempertahankan konformasi aktif
misal, glutamin sintase).
Atau membentuk jembatan logam dengan
sebuah substrat (misal, piruvat kinase)

Disampaing peran strutural, ion logam dalam

Piruvat kinase mengikat satu substrat (ATP).
M

Piruvat kinase ATP

Kreatinin 20
B. Kompleks Jembatan Substrat (Enz-S-M)
Contoh jembatan substrat terner pada
Nukleotida trifosfat.

ATP4 - + M(H2O)62+ ATP M(H2O)32 - + 3 H2O

ATP M(H2O)32 - + Enz Enz ATP M(H2O)32 -

Dalam reaksi fosfotransferase, ion logam diduga

mengaktifkan ion fosfor, dan membentuk kompleks
Polifosfat adenin (kompleks kuartener yang aktif)

21
C. Kompleks Jembatan Logam M
Ens - M - S Ens
kompleks jembatan logam
sederhana S
kompleks jembatan logam
siklik

Kristalografi dan penentuan rangkaian

His turut terlibat dalam pengikatan

logam pada tapak aktif protein
(karboksi peptidase A, alkalifosfatase,
fosfolipase c, subredoksi, protein yang
mengandung heme seperti mioglobin dan
hemoglobin). 22
 Pelepasan molekul H2O
Enz – M (kompleks biner) Dari lingkup koordinasi
Ion logam.

Contoh : Enzim peptidase

Pengaktifan oleh ion logam merupakan

proses yang lambat (reaksi lambat ini merupakan
penyususnan konformasi kompleks Enz-M biner
menjadi konformasi yang aktif).
Pengikatan logam
cepat
Enz + M(H2O)6 Enz M(H2O)6.n + n H2O
Penyusunan kembali konformasi aktif (Enz*)
lambat
Enz M(H2O)6.n Enz* M(H2O)6.n 23
 Kompleks jembatan logam terner
dapat dibuat dari METALOENZIM
(Enz – M) melalui penggabungan
dengan substrat (S)
M
Enz M + S Enz M S atau Ens
S

siapa tepat

dapat
24