BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Semua bakteri bersel tunggal, walaupun dalam beberapa keadaan dapat

dijumpai gumpalan yang kelihatannya bersel banyak. Bakteri lebih kecil ukurannya
daripada protozoa atau fungi sejati mungkin hal ini merupakan kesempatan yang
baik untuk sedikit menyimpang mengenai ukuran relatif mikroorganisme. Sesuatu
yang begitu kecil hingga tak dapat dilihat dengan mata telanjang disebut
mikroskopik.
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)
Kegunaan pengecatan terhadap bakteri adalah memperjelas bentuk dan jenis
bakteri yang diamati serta memperjelas bagian dalam dari suatu bakteri. Mekanisme
pengecatan bakteri ada 3 macam yaitu :
1. Secara Kimia
Reaksi antara zat warna dengan bagian-bagian mikroba sehingga terbentuk
senyawa baru yang bisa berbeda sifat dengan zat mula-mula. Misalnya
bagian asam dari m.o. (nukleus, chloromatin) dengan bagian basa dari cat
atau sebaliknya.
2. Proses Fisika
Terjadinya proses kapiler dan proses adsorbsi maupun absorbsi.
3. Campuran
Zat warna melalui permukaan yang semi permiabel dan bagian sel bereaksi
dengan zat warna (fisika dan kimia)
Menurut COHN yang disebut cat bakteri (cat biologi) adalah suatu
persenyawaan organik yang mempunyai gugus khromofor dan gugus auxokhrom
yang terikat dalam suatu cincin benzena. Gugus khromofor dapat memberikan warna
pada molekul cat, sedangkan gugus auxkhrom dapat memberikan desosiasi elektrolit
pada molekul cat sehingga cat bersifat lebih mudah bereaksi.
(Winarni,Dyah,Ir.,MT., “Diktat Teknik Fermentasi”, Program Studi DIII Teknik Kimia FTI-ITS,
Surabaya, 2004)
Pada umumnya olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk,
susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran. Zat pewarna khusus
diperlukan untuk melihat spora maupun flagella dan hal-hal terperinci dalam sel zat

II-1
 II-2
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
pewarna yang mengungkapkan perbedaan-perbedaan kimia pada struktur bakteri
dari kelompok lainnya dapat dipakai zat pewarna yang disebut zat pewarna
diferensial.
Untuk dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dengan morfologi
yang sama digunakan prosedur pewarnaan Gram. Pewarnaan ini merupakan salah
satu prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi
bakteri. Dengan metode ini bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua
kelompok besar yaitu:
(1) Organisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal
iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tanpak biru gelap atau ungu)
disebut Gram positif.
(2) Organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu
pembilasan dengan alkohol, namun kemudian terwarnai oleh pewarna
tandingan safranin (sel-sel tampak berwarna merah muda) disebut Gram
negatif.
Karena kemampuannya untuk membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari
kelompok lainnya, pewarna Gram disebut juga pewarnaan differensial.
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)
Salah satu teknik pewarnaan differensial yang paling penting dan paling luas
digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram. Dalam proses ini olesan bakteri yang
terfiksasi dikenai larutan-larutan misalnya ungu kristal, yodium, alkohol, safranin atau
beberapa warna tandingan lain yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode
gram ini dibagi menjadi dua kelompok. Salah satu diantaranya bakteri gram positif
yang mempertahankan zat warna ungu kristal dan karenanya tampak ungu tua.
Kelompok lain bakteri gram negatif yang kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan
alkohol, dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin
tampak warna merah.
(Peterzan,Jr,Michael J, “Dasar-dasar Mikrobiologi”, UI-Pres, Jakarta, 1986)
Prosedur perwarnaan dari pewarnaan Gram terdiri atas empat langkah :
1. Olesan dibasahi dengan lembayung gentian atau lembayung kristal;
2. Setelah 60 detik zat pewarna lembayung dibilas dan olesan dibasahi dengan
larutan yodium;

Laboratorium Teknik Bahan Makanan dan Fermentasi

ProgranStudi D-III Teknik Kimia FTI-ITS
 II-3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
3. 60 detik kemudian, yodium dibilas dan gelas preparat dicuci dengan larutan
alkohol 95 persen selama 15 hingga 30 detik;
4. Gelas preparat kemudian selama 30 detik diwarnai dengan safranin (zat
pewarna merah) atau coklat Bismarck (dipakai bagi orang yang buta warna
terhadap warna merah).
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)
Secara umum zat pewarna berupa garam yang terdiri atas ion positif dan
negatif, salah satu diantaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa warna
itu berada pada ion positif (yaitu zat pewarna Cl-) sedangkan ion negatif (yaitu zat
pewarna Na+). Hubungan bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol
disebabkan oleh adanya asam oleat/nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma
sel. Jadi jika bakteri itu diwarnai muatan negatif dalam asam nukleat dalam bakteri
bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa. Lembayung kristal, safranin, dan biru
metilen adalah beberapa zat warna yang lazim digunakan. Sebaliknya zat pewarna
asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi mewarnai olesan bakteri
dan zat pewarna asam akan dihasilkan hanya pewarnaan daerah latar belakang
yang berwarna. Teknik ini sangat berguna untuk mengamati keseluruhan sel yang
sangat kecil. Proses pewarnaan ini disebut pewarnaan negatif.
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)
Seperti telah dicatat sebelumnya, bakteri dapat dibagi menjadi dua kelompok
besar yaitu gram positif dan gram negatif berdasarkan teknik pewarnaan diferensial
yang disebut pewarnaan Gram. Kedua kelompok ini berbeda terutama dalam dinding
selnya. Dinding sel organisme gram positif adalah cukup tebal (20-80 nm) dan terdiri
atas 60 sampai 100 persen peptidoglikan. Semua sel gram positif memiliki polimer
lurus asam N-asetilmuramat dan N-asetilglukosamin, namun ada variasi dalam
panjang dan komposisi jembatan peptida yang mengaitkan silang tetrapeptida dari
satu asam N-asetilmuramat dengan polimer di sampingnya. Dinding sel bakteri gram
negatif mempunyai susunan kimia yang lebih rumit daripada bakteri gram positif.
Sebagai contoh, dinding sel gram negatif mengandung lebih sedikit peptidoglikan (10
sampai 20 persen bobot kering dinding sel), tetapi di luar lapisan peptidoglikan, ada
stuktur “membran” kedua, yang tersusun dari protein, fosfolipida, dan lipopolisakarida
(asam lemak yang dirangkaikan dengan polisakarida).
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)

Laboratorium Teknik Bahan Makanan dan Fermentasi

ProgranStudi D-III Teknik Kimia FTI-ITS
 II-4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Ingatlah bahwa perbedaan reaksi gram bukanlah suatu fenomena yang
mutlak dan kaku melainkan merupakan perbedaan laju lepasnya kompleks ungu
kristal iodium dari sel pada langkah pemucatan. Organisme gram positif sekalipun
dapat memperlihatkan reaksi gram negatif bila mengalami pemucatan yang
berlebihan. Faktor-faktor lain yang juga dapat menimbulkan keragaman dalam reaksi
gram ialah :
(1) pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan,
(2) kerapatan sel pada olesan,
(3) konsentrasi dan umur reagent-reagent yang digunakan untuk
pewarnaan gram,
(4) sifat, konsentrasi, dan jumlah pemucat yang dipakai,
(5) sejarah biakan.
Olesan bakteri yang dipanaskan secara berlebihan akan menyebabkan
pecahnya dinding sel. Dalam keadaan demikian maka sel-sel gram positif akan
melepaskan warna primer dan menerima pewarna tandingan. Hal ini mendukung
teori bahwa reaksi gram bergantung pada struktur dinding sel. Telah dikemukakan
bahwa olesan yang baik hendaknya jangan terlalu tebal atau terlalu tipis. Pada
pewarnaan gram, olesan yang terlalu tebal tidak akan memucat secepat seperti
olesan dengan kerapatan sel yang normal. Sebagai pemucat, etanol 95%bekerja
paling lambat. Sedangkan aseton bekerja paling cepat sehingga pemucat yang
paling banyak digunakan adalah campuran etanol 95% dan aseton (1:1).
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)
Sejarah biakan yang dimaksud diatas meliputi umur biakan serta keasaman
atau alkalinitas (pH) medium tempat bakteri yang bersangkutan ditumbuhkan. Biakan
organisme gram positif yang lebih tua (terutam bila memperlihatkan autolisis) dan
yang ditumbuhkan dalam medium asam sering kali tampak gram negatif atau gram
variabel (artinya biakan yang sama menampakkan sel-sel baik gram positif maupun
gram negatif). Hal ini berkaitan dengan permeabilitas dinding sel pada biakan tua
yang menyebabkan hilangnya sifat gram positif. Tetapi organisme gram negatif tidak
menjadi gram positif terlepas dari umur atau medium yang dipergunakan. Secara
singkatnya, reaksi gram hanya dapat dipercaya bagi biakan berumur 24 jam atau
kurang dan janganlah terlampau mempersoalkan teramatinya beberapa sel gram

Laboratorium Teknik Bahan Makanan dan Fermentasi

ProgranStudi D-III Teknik Kimia FTI-ITS
 II-5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
negatif didalam suatu preparat yang sebagian besar menampakkan sel-sel gram
positif.
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)
Faktor-faktor yang mempengaruhi pengecatan yaitu fiksasi, substrat, dan
dekolorisator (peluntur cat). Fiksasi (pemanasan) berfungsi untuk mencegah
mengerutnya globula protein sel ; mempertinggi sifat relatif gugusan karboksil, amino
primer, sulfhidri ; merubah afinitas cat ; membunuh bakteri ; melekatkan bakteri pada
kaca ; membuat sel-sel lebih kuat/keras. Dekolorisator dipakai untuk mendapatkan
kontras yang baik pada bayangan mikroskop. Pada umumnya sel yang sukar dicat
akan lebih sukar didekolorizer. Ada beberapa peluntur cat yaitu peluntur cat asam ,
peluntur cat basa, garam-garam logam berat, dan garam-garam logam ringan.
Untuk mengidentifikasi cat dapat dilakukan beberapa cara yaitu mempertinggi
kadar cat, mempertinggi temperatur pengecatan, dan menambah bakteri suatu
mordan. Mordan adalah zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel mudah dicat
(lebih intensif). Beberapa mordan adalah mordan basa (mordan yang bereaksi
dengan anion cat asam yang berwarna, contoh: alum, FeSO 4) dan mordan asam
(mordan yang bereaksi dengan cat basa, contoh: asam pikrat)
(Winarni,Dyah,Ir.,MT., “Diktat Teknik Fermentasi”, Program Studi DIII Teknik Kimia FTI-ITS,
Surabaya, 2004)
Perbedaan pewarnaan ini disebabkan dinding sel bakteri gram positif berbeda
dengan dinding sel bakteri gram negatif dan ini diduga berperan dalam terjadinya
reaksi gram yang berbeda-beda. Boleh jadi dinding sel yang lebih tebal pada bakteri
gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol karena terjadinya dehidrasi
menyebabkan pori-pori dinding sel menutup sehingga mencegah larutnya kompleks
ungu kristal iodium pada langkah pemucatan. Dipihak lain dalam sel-sel gram negatif
mempunyai kandungan lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton.
Larutnya lipid oleh pemucat yang digunakan dalam pewarnaan gram diduga
memperbesar pori-pori dinding sel dan inilah yang menyebabkan proses pemucatan
sel-sel gram negatif berlangsung lebih cepat. Jadi terdapat perbedaan yang nyata
dalam laju pemucatan antara sel gram positif dan negatif.
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)
Beberapa cara pengecatan :
1. Pengecatan negatif

Laboratorium Teknik Bahan Makanan dan Fermentasi

ProgranStudi D-III Teknik Kimia FTI-ITS
 II-6
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Pengecatan tak langsung karena yang dicat adalah latar belakangnya
sedangkan bakterinya sendiri tidak. Tidak dilakukan fiksasi, oleh karena itu
dapat dipkai untuk melihat bentuk sel dan menentukan ukuran mikroba, karena
sel mikroba tidak mengalami perubahan. Cat yang digunakan nigrosin dan tinta
cina.

2. Pengecatan sederhana
Hanya menggunakan satu macam cat saja, dan dilakukan fiksasi sebelum dicat.
Pengecatan dipakai untuk melihat bentuk bakteri. Cat yang digunakan metilen
blue, gantiana violet, basic fuchsin, dan safranin.
3. Pengecatan Gram
Dikembangkan oleh ahli histologi Christian Gram tahun 1884 yang meliputi 4
langkah-langkah yaitu pemberian cat utama (kristal violet ungu), pengintensifan
cat utama dengan ditambah larutan mordan (JKJ), pencucian (dekolorizer)
dengan larutan alkohol, dan pemberian cat penutup (cat lawan/Counter stain)
larutan safranin yang berwarna merah.
4. Pengecatan acid fast (Ziehl Neelsen)
(Winarni,Dyah,Ir.,MT., “Diktat Teknik Fermentasi”, Program Studi DIII Teknik Kimia FTI-ITS,
Surabaya, 2004)

PEWARNAAN TAHAN ASAM

Tujuan dari melakukan pewarnaan tahan asam adalah untuk mengetahui
dasar-dasar kimiawi reaksi tahan asam. Bateri-bakteri dari genus mikrobakterium
dan spesies-spesies tertentu dari genus nocardia mengandung sejumlah besar zat
lipoid (berlemak) didalam dinding-dinding selnya. Hal ini menyebabkan dinding sel
tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel-sel
bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode-metode pewarnaan biasa. Kedua genus
tersebut mengandung spesies-spesies yang patogenik bagi manusia, yang paling
dikenal diantaranya ialah M. Tuberculosis penyebab penyakit tuberkolosis, dan M.
Leprae penyebab penyakit lepra. Untuk menunjang diagnosis penyakit-penyakit
tersebut bakteri-bakteri penyebabnya harus dengan diisolasi dari spesimer si sakit
dan dibuat tampak serta mudah dibedakan dari bakteri-bakteri lainnya. Karena sifat

Laboratorium Teknik Bahan Makanan dan Fermentasi

ProgranStudi D-III Teknik Kimia FTI-ITS
 II-7
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
dinding selnya yang begitu maka untuk memenuhi tujuan tersebut harus digunakan
pewarna khusus.
Teknik pewarnaan khusus itu, yang disebut juga pewarna tahan asam mula-
mula dikembangkan oleh Paul Ehrlich pada tahun 1882 ketika meneliti M.
Tuberculosis. Prosedur pewarnaan yang umum digunakan pada masa ini merupakan
hasil perbaikan teknik Ehrlick yang asli yaitu pewarnaan Ziehl-Neelsen, dinamakan
menurut kedua orang peneliti yang mengembangkannya pada akhir 1800-an.
Prosedur ini menggunakan pewarna utama dengan pemanasan dan biru metilen.
Loeffler sebagai pewarna tandingan. Pada modifikasi teknik ini yang berkembang
kemudian, perlakuan panas diganti dengan penggunaan pembasah (suatu detergen
untuk mengurangi tegangan permukaan lemak) untuk menjamin penetrasi, pewarna
yang mengandung bahan pembasah ini disebut pewarna kinyoun.
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikrobakteri
menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh
zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCl dalam etanol 95%).
Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikeluarkan
dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan gram.
Pada kondisi pewarnaan ini organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan
tahan asam dan tampak merah. Pada bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat
terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah
dipucatkan oleh alkohol asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya
karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru-metilen
oleh sel sehingga bakteri tersebut tampak biru.
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)

PEWARNAAN SPORA
Jenis-jenis bakteri tertentu, terutama yang tergolong genus Bacillus dan
Clustridium membentuk suatu struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang khas,
disebut endospora. Endospora adalah tubuh kecil yang tahan lama yang terbentuk di
dalam sel dan mampu tumbuh menjadi organisme vegetatif yang baru. Proses
pembentukan endospora pada umumnya sebagai berikut : setelah periode tumbuh
aktif yaitu mendekati fase pertumbuhan stasioner (lihat bab 5) struktur yang
dinamakan spora depan (forespore) terbentuk dalam sel. Kemudian membentuk
Laboratorium Teknik Bahan Makanan dan Fermentasi
ProgranStudi D-III Teknik Kimia FTI-ITS
 II-8
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
dinding tebal (lihat Gambar 3.16). Apabila dibuat irisannya, endospora dapat terlihat
terdiri atas pembungkus luar, korteks dan inti yang mengandung struktur nukleus.
Garis tengah endospora mungkin sama, lebih besar, atau lebih kecil daripada sel
vegetatif, dan mungkin berada dipusat (seperti diperlihatkan pada gambar 3.17),
hampir pada ujung, atau pada ujung sel, tergantung pada jenisnya. Sementara
endospora matang, dinding sel vegetatif melebur, melepaskan endospora yang
matang.
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)
Karena dinding yang sangat tebal ini, endospora tak dapat diwarnai dengan
cara pewarnaan yang biasa. Jadi pada preparat yang diwarnai secara gram,
endospora akan tampak sebagai tubuh terang atau yang tidak diwarnai di dalam sel.
Namun, zat pewarna khusus untuk spora telah dibuat yang dengan cara ini spora itu
dipanaskan bersama zat pewarna, atau zat pewarna itu dicampur dengan deterjen
yang aktif permukaan (maupun mempengaruhi sifat pembasahan benda cair) dan
membantu zat pewarna menerobos dinding sel.
Sifat paling jelas yang dimiliki endospora, yang bukan merupakan ciri sel
vegetatif, adalah ketahanannya terhadap panas dan bahan kimia. Selama kondisi
lingkungan tidak menguntungkan bagi pertumbuhan bakteri endospora tetap berupa
spora. Namun, apabila kondisi menjadi lebih baik untuk pertumbuhan, mungkin
terjadi beberapa perubahan.
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)

PERWARNAAN KAPSUL
Banyak bakteri mampu mengeluarkan bahan yang menempel pada sel
bakteri, tetapi yang sebenarnya luar sel (lihat Gambar 3.7). Dalam beberapa hal
bahan ini menjadi bahan menebal yang jelas mengelilingi tiap sel atau pasangan sel.
Bahan ini kemudian disebut kapsul. Ketebalannya cukup bervariasi; pada beberapa
jenis kapsul itu mungkin begitu tipis sehingga dapat dideteksi hanya dengan analisis
kimia. Komposisi kapsul adalah konstan pada galur bakteri tertentu, tetapi sangat
bervariasi bahkan antara organisme diklasifikasikan dalam satu marga dan jenis.
Ada kecenderungan bahwa kapsul tak mudah menerima zat warna, karena itu jarang
ditemukan pada olesan yang diwarnai secara rutin. Namun, kapsul mungkin dapat
dilihat pada preparat basah (suspensi pada cairan) organisme itu.
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)
Laboratorium Teknik Bahan Makanan dan Fermentasi
ProgranStudi D-III Teknik Kimia FTI-ITS
 II-9
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Kegunaan kapsul yang sebenarnya bagi bakteri tidaklah selalu jelas,
meskipun agaknya untuk mencegah kekeringan bagi organisme pada kondisi yang
tidak menguntungkan. Akan tetapi adanya kapsul sangat penting artinya bagi
mikrobiologi kedokteran karena adanya itu dapat meningkatkan kemampuan bakteri
untuk menimbulkan penyakit. Hal ini terjadi karena kapsul bertindak sebagai lapisan
pelindung yang menahan penelanan oleh sel fagosit inang (sel yang menelan dan
mencerna benda asing). Lebih jauh lagi, karena daya tahan yang diberikan oleh
kapsul dapat dipatahkan oleh adanya antibodi khusus, kekebalan terhadap
penyebab infeksi ditunjukan terhadap kapsul organisme itu. Dalam kenyataan,
sebelum adanya pengobatan dengan antibiotika, terlebih dahulu diperlukan
kepastian organisme berkapsul yang mana (S. Pneumoniae atau Niesseria
meningitidis) yang menyebabkan penyakit itu, sehingga antiserum yang tepat dapat
diberikan.
(Wheeler,Volk “Mikrobiologi Dasar”, Jilid 1, Gramedia, Jakarta,1984)

Laboratorium Teknik Bahan Makanan dan Fermentasi

ProgranStudi D-III Teknik Kimia FTI-ITS