TUGAS KELOMPOK BIOTEKNOLOGI

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

KELOMPOK
1. Devianti (10060308082)
2. Sri Eli (10060308083)
3. Iin Indrayani (10060308085)
4. Vina Nur Syaidah (10060308110)
5. Dani Febrian (10060308106)
6. Sendi (10060308105)

DOSEN : Dina Mulyanti,S.Si., Apt.

LABORATORIUM ANATOMI FISIOLOGI MANUSIA

PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG
2010
 Penyebaran penyakit yang disebabkan oleh bakteri Streptococcus pyogenes
dapat dicegah dengan mengadakan/membuat suatu vaksin yang menghalau infeksi oleh
bakteri tersebut. Vaksin untuk pencegahan terhadap infeksi S. Pyogenes diperoleh dari
memproduksi protein Lmb yang dimiliki oleh bakteri tersebut dengan menggunakan
Teknologi DNA rekombinan.
Teknologi DNA rekombinan yang dilakukan adalah jenis kloning gen. Pada
tahap awal yang dilakukan adalah dengan menyiapkan dua jenis DNA yaitu DNA
sisipan (yang dapat berasal dari kromosom) dimana dalam hal ini berasal dari
S.pyogenes dan plasmid ( yang berfungsi sebagai kendaraan, vehicle, vektor) yang
membawa DNA sisipan dimana dalam hal ini adalah vektor pGEM-T Easy. Kemudian
DNA kromosom dari S.pyogenes dipotong oleh suatu enzim restriksi, yaitu suatu enzim
endonuklease yang mengenali urutan spesifik pada DNA. DNA plasmid (vektor pGEM-
T Easy) dipotong dengan enzim restriksi yang sama sehingga plasmid yang asalnya
berbentuk sirkuler menjadi linier. Hasil pemotongan DNA kromosom diligasi oleh
DNA ligase (merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester
dari hasil pemotongan oleh enzim restriksi) terhadap DNA plasmid linier untuk
membentuk DNA sirkuler yang mengandung DNA sisipan. DNA yang telah
mengandung DNA sisipan ini disebut DNA rekombinan.
Untuk melakukan teknologi DNA rekombinan diperlukan peta plasmid. Pada
gambar adalah peta salah satu plasmid pGEM-T. Plasmid ini adalah plasmid linier yang
mempunyai basa T pada ujung 3’nya. Dari peta plasmid ini dapat diketahui bahwa
pGEM-T mempunyai ori (untuk replikasi), gen pengkode resistensi ampisilin (gen b-
lactamase, gen bla) dan gen lacZ. Gen pengkode resistensi berfungsi sebagai marka
seleksi untuk mengetahui apakah sel inang telah mengandung plasmid rekombinan. Gen
lacZ adalah marker untuk mengetahui apakah plasmid telah mengandung DNA sisipan.
Selain itu, plasmid pGEM-T mengandung multiple cloning site (MCS) yang digunakan
untuk menyisipkan DNA sisipan. MCS mengandung beberapa situs yang dikenali oleh
enzim restriksi. Produk PCR yang dihasilkan menggunakan enzim Taq mempunyai 1
basa A pada ujung 3’nya. Basa T ekstra pada ujung 3’ di pGEM-T digunakan untuk 2
tujuan, yaitu agar dapat disisipi produk PCR yang mempunyai 1 basa A pada ujung
3’nya dan untuk menghindari terjadinya self ligation (ligasi plasmid tanda DNA
sisipan).
 Gambar 1. Plasmid pGEM-T Easy

Hasil ligasi (merupakan DNA rekombinan) kemudian ditransformasi dengan

proses heat shock atau elektroporasi ke dalam Escherichia coli (sel inang) dimana satu
sel inang hanya akan menerima satu molekul DNA rekombinan. Transforman (bakteri
berisi DNA rekombinan) ini akan membelah dan ketika pembelahan sel terjadi plasmid
ikut mereplikasi. Karena populasi tersebut berasal dari 1 sel yang mengandung DNA
rekombinan tertentu maka akan dihasilkan klon. Transforman kemudian diseleksi
menggunakan metode seleksi Biru Putih untuk mengetahui apakah DNA sisipan
berhasil diligasi ke dalam vektor atau tidak. Gen lacZ pada MCS yang mengkode
galaktosidase dapat menguraikan X-Gal menjadi berwarna biru. Jika terdapat koloni
biru, maka DNA sisipan tidak terligasi. Sedangkan jika terdapat koloni putih, maka
DNA sisipan terligasi akibat gen lacZ rusak, galaktosidase tidak diproduksi sehingga X-
Gal tidak diuraikan.
 Konfirmasi pGEM-T rekombinan dilakukan setelah memperoleh koloni biru
(tidak mengandung DNA sisipan) dan koloni putih (mengandung DNA sisipan),
plasmid masing-masing diisolasi dari kedua koloni tersebut. Plasmid kemudian
dielektroforesis dengan agarosa. Hasil elektroforesis plasmid hanya memberikan
informasi bahwa ukuran plasmid rekombinan > dari plasmid tanpa DNA sisipan.
Ukuran DNA sisipan hanya dapat diperoleh dari pemotongan menggunakan enzim
restriksi. Untuk mengetahui ukuran DNA sisipan, plasmid rekombinan dipotong dengan
dua enzim restriksi yang mengapitnya sehingga DNA sisipan dapat dipisahkan dari
vektornya. Hasil pemotongan menggunakan dua enzim restriksi yaitu EcoRI dan NdeI
memberikan dua pita yaitu pita pGEM-T Easy (bermigrasi lebih lambat karena
ukurannya 3015 pb) dan DNA sisipan (bermigrasi lebih cepat karena ukurannya lebih
kecil 921 pb). Hasil pemotongan dengan enzim restriksi hanya memberikan informasi
bahwa ukuran DNA sisipan yang kita inginkan adalah benar. Adapun DNA sisipan
mengandung DNA yang kita inginkan dalam hal ini adalah gen Lmb maka harus
dilakukan penentuan urutan nukleotida melalui sekuensing.