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UNIVERSIDADE DE CUIABÁ-UNIC
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
BACTERIOLOGIA
Cuiabá – 2011
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Apresentação
Todas as informações contidas nesta apostila foram adaptadas conforme rotina do setor de
microbiologia do Laboratório Escola de Análises Clínicas do Hospital Geral Universitário (LEAC-
HGU) como guia teórico-prático.
Entretanto vale ressaltar que outros laboratórios de análises clínicas do Mato Grosso e de
diferentes Estados brasileiro adotam rotinas microbiológicas diversificadas. Desse modo, no
decorrer dos anos e décadas, novas informações teórico-prático do mundo microbiológico nos
enriqueceram durante nossa vida profissional, para que possamos contribuir com a saúde e o bem
estar da população.
As autoras.
“Considerem a diferença de tamanho entre algumas das menores e das maiores criaturas
existente na terra. Uma pequena bactéria pesa 0, 000 000 01 grama. A baleia azul pesa cerca
de 100 000 000 grama. Mas mesmo assim uma bactéria é capaz de matar uma baleia. São tão
grandes a capacidade de adaptação e a versatilidade dos microorganismos, comparados aos
seres humanos e outros organismos tidos como “superiores”, que eles sem dúvida continuarão
a colonizar e alterar a superfície da Terra logo depois que nós e o resto de nossos co-
habitantes deixarmos a cena para sempre . Os micróbios, e não os macróbios, dominarão o
mundo.”
Bernard Dixon, 1994.
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Índice
1- Microbiota Corpo Humano 01
2-Biosegurança em Microbiologia 02
3-Meios de Cultura 06
3.1- Controle de qualidade dos meios de cultura. 10
4- Tipos de Semeadura 15
5- Processamento das Amostras Biológicas nos Meios de Cultura em Bacteriologia. 17
6- Interpretação Macroscópica das Bactérias em Meios de Cultura. 26
6.1- Interpretação do crescimento microbiológico nos meios de cultura. 29
7- Preparo e Fixação do Esfregaço Bacteriológico. 32
8- Principais Colorações em Bacteriologia 35
9- Identificação Bioquímica de Bactérias de Importância Médica. 37
9.1- Cocos Gram Positivos (CGP) 37
9.2- Bacilos Gram Negativos (BGN) 46
9.2.1- Fermentadores de Glicose (Enterobactérias) 46
9.2.2- Não Fermentadores de Glicose 51
9.3- Bacilos Álcool Ácido Resistente (BAAR) 51
9.4- Diplococos Gram Negativos 53
9.5- Bacilos Gram Negativos Pleomórficos 54
9.6- Chlamydia spp. e Treponema spp. 56
9.7- Mycoplasma spp. e Ureaplasma spp. 57
10- Diagnóstico laboratorial das Infecções Genitais. 58
11- Teste de Susceptibilidade Antibacteriana (TSA). 61
11.1- Métodos Utilizados na Execução do TSA. 61
11.2- Procedimentos de Execução do TSA por Disco-Difusão. 62
11.3- Mecanismo de Ação dos Antibióticos. 63
12- Resistência Bacteriana aos Antibióticos. 65
12.1- Principais Mecanismos de Resistência Bacteriana. 65
12.2- Resistência dos CGP e BGN Alguns Antibióticos. 67
12.3- Triagem Fenotípica de Resistência Bacteriana Rotina Laboratorial. 68
13-Referências Bibliográficas 72
14- Anexos 73
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O corpo humano é habitado por um grande número de microrganismo, que, juntos, são chamados
microbiota ou flora normal. A maioria dos membros da flora normal são bactérias, mas fungos e
protozoários também são encontrados.
No corpo humano sadio, os órgãos internos como sangue, cérebro, músculos e outros, são
normalmente livres de microrganismos. De modo contrário, os tecidos superficiais como a pele e
membranas mucosas estão constantemente em contato com os microrganismos do meio ambiente e
são normalmente colonizados por certas espécies microbianas, conforme tabela abaixo.
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2-Biosegurança
Equipamentos de Proteção
Os equipamentos de proteção incluem cabine de segurança biológica combinada com o uso
de EPIs (luvas, jalecos, gorros, pró-pés, máscaras ou óculos de proteção), dependendo do nível de
segurança necessário.
2
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Classe I
O fluxo de ar ocorre de fora para dentro, pela abertura frontal, sem recirculação do ar. O ar
da cabine passa por um filtro HEPA antes de ser liberado para o interior do laboratório.
Classe II
Cabine de abertura frontal na qual uma parte do ar é recirculado. Este tipo de cabine se
subdivide em:
AII
30% de ar ambiente entram pela abertura frontal; 70% é recirculado para o interior da cabine
passando por um filtro HEPA; 30% são exauridos para dentro ou fora do laboratório através de
outro filtro HEPA.
B3
70% de ar ambiente entram pela abertura frontal; 30% é recirculado para o interior da cabine
passando por um filtro HEPA; 70% são exauridos para fora do laboratório através de outro filtro
HEPA e por um sistema de exaustão.
B2
100% de exaustão. Sem circulação do ar protegendo o operador, o material manipulado e o
ambiente.
Classe III
Cabine hermeticamente fechada, impermeável a gases, e todo o trabalho é realizado com
luvas de borracha que estão presas à câmara.
O ar que entra passa por um filtro HEPA e o ar que sai pelo exaustor passa por outros filtros
HEPA dispostos sequencialmente.
Vias de Infecção
Existem diversas vias pelas quais podem ocorrer infecções no laboratório de microbiologia.
Dentre elas podemos citar:
Inalação: provocada pela formação de aerossóis.
Ingestão: provocada devido à pipetagem da amostra com a boca e não lavar as mãos
antes da refeição, de beber ou fumar.
Inoculação Direta: provocada por um acidente
Contato com membrana mucosa: contaminação com certos organismos através da
mucosa oral, ocular, etc.
Limpeza
Uma das atividades mais importantes para manter a área física e os equipamentos em
condições adequadas é a limpeza geral do laboratório. A limpeza inclui o cuidado com as
superfícies e com o resíduo gerado dentro do laboratório.
Para descontaminação de artigos e superfícies do laboratório podem ser utilizados alguns
procedimentos e produtos, tais como:
Autoclave:
Concentração – Vapor saturado 121ºC por 15 minutos
Tempo total de contato – 50-90 minutos
Atividade Contra – Bactérias, micobactérias, esporos, fungos e vírus.
Características Importantes – Risco de queimadura se operado inadequadamente.
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Álcool etílico
Concentração – 70-85%
Tempo de contato – 10-30 minutos
Atividade Contra – Bactérias, micobactérias, fungos, vírus hidrofílicos (germicida variável)
e vírus lipofílicos
Características Importantes – inativado por matéria orgânica, efeito irritante da pele e dos
olhos, tóxico se absorvido ou ingerido.
Aplicação – Superfícies de equipamentos e anti-sepsia de pele
Considerações Gerais
Toda amostra biológica deve ser considerada potencialmente contaminada.
Toda manipulação de material biológico deve ser realizada com o uso de luvas e, ao término
desta, desinfetá-las com ácido fênico 5% antes de descarta-las e quando necessário utilizar
também óculos de proteção.
Usar máscara para evitar a inalação de esporos fúngicos, pois, além das espécies que podem
infectar pulmões, várias outras são responsáveis por fenômenos alérgicos, que se
manifestam também nas vias respiratórias.
Trabalhar com o bico de Bunsen aceso e interposto entre o técnico e o material (clínico ou
cultura).
Todo procedimento em que houver risco de respingos ou formação de aerossóis deve ser
manipulado dentro de uma cabine de segurança biológica.
Não pipetar nenhum tipo de solução ou material com a boca.
Não reencapar agulhas e descartar material perfurocortantes em recipiente apropriado.
Reduzir ao máximo a utilização de materiais perfurocortantes.
O material contaminado deve ser descontaminado antes do descarte.
Determinar áreas limpas e contaminadas.
Os equipamentos devem ser descontaminado antes de ser transportados.
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3-Meios de Cultura
Ágar
Agente gelificante para preparação de meios de cultura microbiológicos, substância obtida de
determinadas espécies de algas vermelhas marinhas, é um poligalactosídeo em que a maioria dos
microrganismos é incapaz de degradá-lo.
Caseína Hidrolisada
Esta substância é obtida pela hidrólise com ácido clorídrico (HCL).
Extrato de Carne
É preparado a partir de carne desprovida de tendões e gordura.
Extrato de Levedura
É obtida por extração aquosa de levedo de cerveja autolisado. Devido ao seu elevado conteúdo em
nitrogênio amínico e vitaminas, oferece excelentes condições de crescimento a uma gama de
microrganismos.
Peptona de Carne
É obtida pela degradação proteolítica da carne por enzimas (pepsina, tripsina). É um excelente
substrato nutritivo.
Proteose-Peptona
É uma peptona, com uma elevada proporção de peptídeos, aminoácidos livres e fatores de
crescimento. Constitui-se de uma excelente base nutritiva para o cultivo de Neisseria spp,
Staphylococcus spp, Haemophilus spp, Salmonella spp, Pasteurella spp e Corynebacterium spp.
Triptona
É um digerido pancreático de caseína. A caseína, proteína principal do leite, é uma rica fonte de
nitrogênio amínico. Tem um alto teor de triptofano e, consequentemente, pode ser usada em meios
para testar a reação de indol.
**Para o aprimoramento dos isolados bacterianos patogênicos atualmente inúmeros são os meios
de cultura produzidos comercialmente. Deste modo, vale ressaltar que serão descritos apenas os
utilizados na rotina do LEAC- HGU/UNIC.
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Ágar Cromogênico
Meio de cultura que utilizam substratos cromogênicos, sobre uma base nutricional rica.
-Princípio: Após a clivagem dos substratos cromogênicos combinados presentes no meio de
cultura por enzimas bacterianas, tais como: beta-glicosidade, beta-galactosidade (grupo Klebsiella-
Enterobacter-Serratia) e triptofano-desaminase (grupo Proteus-Providencia-Morganella) ocorrem à
liberação de radicais coloridos.
- Utilidade: Para facilitar o reconhecimento precoce de vários grupos e espécies de
microrganismos (bactérias e fungos), tais como os uropatógenos.
-Atmosfera de incubação: Aerobiose – O2
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Caldo Todd-Hewitt
Meio líquido seletivo para o isolamento de estreptococos beta-hemolíticos de amostras
clínicas contendo flora mista.
- Princípio: Tem em sua formulação a adição de alguns antibióticos que tornam o caldo
seletivo para o isolamento de estreptococos do grupo B.
- Utilidade: Meio de enriquecimento para o isolamento de Streptococcus agalactiae.
- Atmosfera de incubação: Aerobiose – O2
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Os meios de cultura produzidos em média e grande escala pelo setor de microbiologia clínica dos
laboratórios de análises clínicas devem realizar o controle de qualidade para garantir e monitorar a
integridade dos mesmos, bem como para manter de forma contínua a qualidade dos resultados
microbiológicos. O programa de controle qualidade para meios de cultura deve garantir:
Esterilidade
Todo novo lote de meio de cultura preparado no laboratório de microbiologia deve ser testado para
prova em questão.
Procedimento:
Incubar em estufa de cultura microbiológica a 35°±2°C, 5% do lote de meio de cultivo por 18 às
24h e mais 24h em temperatura ambiente.
Resultado:
Adequado: Ausência de microrganismos contaminantes nos meios de cultura.
Inadequado: Aparecimento de contaminantes nos meios de cultura.
Causas prováveis resultados inadequados:
Processo de autoclavação comprometida, contaminação do ambiente, do sangue ou outro
complemento adicionado contaminado.
Ação corretiva:
O lote de meio de cultivo é desprezado e novo lote é produzido antes da liberação para uso. Os
resultados devem ser anotados em planilha apropriada.
Viabilidade (crescimento)
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Homogeneizar e usar uma alça de 0, 001 mL (1µL) para semeadura, equivalente a 1,5 X 104
unidades formadoras de colônias (UFC);
Semear a suspensão por esgotamento em quatro quadrantes;
Incubar em estufa microbiológica por 24h para o crescimento do microrganismo a ser avaliado
frente ao meios de cultura selecionados para o controle de qualidade.
Resultado:
Adequado: crescimento bom em todos os quadrantes, colônias bacterianas típicas.
Inadequado: Ausência de crescimento ou crescimento de bactérias escassas em somente 01 ou 02
quadrantes. Os resultados devem ser anotados em planilha apropriada.
Causas prováveis resultados inadequados:
Preparação do inóculo bacteriano na escala 0,5 de McFarland pouco carregado para este propósito.
Ação corretiva:
Realizar uma nova suspensão a 0,5 McFarland e repetir o procedimento de crescimento bacteriano.
Os meios seletivos são designados não apenas para permitir crescimento de alguns microrganismos,
mas também para inibir o crescimento de outros.
Procedimento:
O meio deve ser inoculado com bactérias representativas de ambos os grupos (bactéria para o meio
de cultura específico e outra para controle seletivo de inibição). Por ex: no meio MacConkey
semear cepa padrão de Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) e Staphylococcus aureus (ATCC
25923).
Preparar uma suspensão a 0,5 da escala de McFarland com solução salina 0,95%;
Diluir a suspensão 1:10;
Homogeneizar, usar alça 0,01 mL (10µL) para semeadura, equivalente a 1,5 X 10 5 UFC;
Semear a suspensão por esgotamento em quatro quadrantes;
Incubar em estufa microbiológica por 24h para o crescimento do microrganismo a ser avaliado
frente ao meios de cultura selecionados para o controle de qualidade.
Resultado:
Adequado: Inibição do crescimento do microrganismo.
Inadequado: Crescimento abundante do microrganismo seletivo de inibição.
Resposta bioquímica
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Inocular na superfície do meio FENIL (Fenilalanina) uma cepa de Proteus spp ou Morganella spp.
ou Providencia spp.
Incubar em estufa microbiológica a 35°±2°C por 18 às 24h.
Em seguida adicionar 20 gotas do cloreto férrico 10%. Aguardar a reação.
Resultado do exemplo acima citado:
Adequado: Formação de coloração VERDE na superfície do meio FENIL.
Esta reação ocorre devido produção de uma enzima específica (fenilalanina desaminase) presente
nos gêneros bacterianos citados acima para o consumo do aminoácido fenilalanina, que é revelada
pela adição de um reagente químico.
Inadequado: Ausência de coloração verde na superfície do meio fenil.
Causas prováveis resultado inadequado no exemplo acima citado:
Reagente químico e meio de cultura vencidos.
Ação corretiva:
Verificar data de validade do meio de cultura e cloreto férrico.
Os resultados devem ser anotados em planilha apropriada.
Atenção!
Todos os meios de cultura devem ser armazenados em geladeira em temperatura entre 2 - 8°C e
condicionados em embalagens para manter a umidade do meio.
Em todas as placas de meio de cultura produzidas deve conter número do lote, datas de fabricação e
validade e inicial do meio de cultura.
Desprezar meios de cultura sólidos que apresentem sinais de ressecamento e meios líquidos que
apresentem diminuição do volume original e qualquer sinal de contaminação, mesmo que estejam
dentro da data de validade.
Para realização dos testes de meio de cultura pode-se utilizar tipos diferentes de cepas:
o Cepas congeladas a partir de cepas padrão (ATCC), adquiridas comercialmente.
o Cepas isoladas de pacientes no laboratório para controle de crescimento de meios de cultura,
após terem suas identificações confirmadas.
Dosagem do pH
O pH do meio Mueller-Hinton deve estar entre 7,2 e 7,4.
Procedimento:
Separar uma porção pequena do ágar Mueller-Hinton em becker após esterilização;
Após gelificação em temperatura ambiente, macerar o ágar e colocar o eletrodo de superfície do
pHmetro para medir o pH;
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Resultado:
O pH do meio de cultura MH deve estar entre 7,2 e 7,4.
Espessura do meio MH em placas
Para ter halos de inibição de forma fidedignos a espessura do ágar Mueller-Hinton deve ser
mensurada com paquímetro ou régua.
Procedimento:
Após esterilização do ágar Mueller-Hinton deve-se distribuir em placas de petri sobre superfície
absolutamente plana para obter profundidade uniforme de aproximadamente quatro milímetro (04
mm), com auxílio de pipeta graduada estéril. 0
Em placas de 150 mm o volume ideal de meio MH é cerca de 60 mL. Já em placas de 90 mm o
volume ideal de meio é de 25 mL.
Com uma régua ou paquímetro mensurar 04 mm de espessura de ágar MH na placa petri.
Resultado:
A espessura do ágar MH deve ser de 04 mm.
Dosagem dos níveis de Ca2+ e Mg2+ em água destilada para preparação do meio de
cultura Mueller-Hinton
A dosagem de Cálcio e Magnésio na água potável que passa por processos de purificação como
destilação e deionização são de suma importância na qualidade da produção dos meios de culturas,
principalmente do Mueller-Hinton; bem como no resultado final do antibiograma (leitura e
interpretação dos halos de inibição).
Procedimento:
# Dosagem de Ca2+ na água destilada
Colocar 02 ml de água destilada no tubo de ensaio, adicionar 03 gotas de NaOH 03 mol/L e 05
gotas (NH4)2C2O4 1% agitar. Aguardar reação.
# Dosagem de Mg2+ na água destilada
Colocar 02 ml de água destilada no tubo de ensaio, adicionar 03 gotas de NH4OH 05 mol/L e 05
gotas Na2HPO4 0,2 mol/L agitar. Aguardar reação.
Resultado:
→ Dosagem de Cálcio
Resultado positivo: Formação Precipitado Branco.
Resultado negativo: Não há formação de precipitado.
→ Dosagem de Magnésio
Resultado positivo: Formação Precipitado Branco.
Resultado negativo: Não há formação de precipitado.
Importante!
Variáveis que podem interferir no resultado do antibiograma pelo ágar Mueller-Hinton.
*Níveis de Ca2+ e Mg2+
Altas concentrações levam à diminuição na atividade de aminoglicosídeos diante de bactérias como
Pseudomonas aeruginosa e da atividade de tetraciclinas para todas as bactérias. Concentrações
diminuídas levam a resultados contrários.
*pH
Em pH baixo se observa halos de inibição reduzidos para aminoglicosídeos, quinolonas,
macrolídeos e lincosaminas e halos aumentados para outros antibióticos por ex: penicilina e
tetraciclinas. O aumento do pH leva a resultados opostos ao anteriores.
*Espessura do meio MH
Menor que 03 mm leva à falsa sensibilidade geral, e maior que 04 mm à falsa resistência.
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Cor anormal do x x
meio
pH incorreto x x x x x x Armazenamento em alta temperatura. Hidrólise dos
componentes.
pH determinado à temperatura incorreta.
Precipitado atípico x x x x
Solubilidade x Aquecimento inadequado.
incompleta Conservação inadequada em frasco muito pequeno.
Escurecimento ou x x x
caramelização
Perda capacidade x x x Hidrólise do ágar por desvio no pH.
de gelificar Meio de cultura que não deve ser fervido.
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Semeadura Qualitativa
Permite o isolamento de todas as colônias microbiológicas diferentes, através do decrescente
gradiente de concentração do inóculo (amostra biológica).
Utiliza-se alça microbiológica de 0,01mL (10µL), conforme figura abaixo.
Não Esquecer
Semear seguindo a sequência dos meios de cultura mais ricos para os mais seletivos.
Fonte: MENEZES e SILVA. C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia Para o Laboratório Clínico. 2006. p120.
Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. 2004. p80.
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Semeadura Quantitativa
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Cateter
As infecções relacionadas a cateteres são em geral importantes, pois auxilia no diagnóstico para
detecção de bacteremia, fungemia e complicações no local da inserção do cateter.
→Procedimento
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico
2% ou álcool 70%;
Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança;
Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso;
Antes de semear é necessário realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de
boa qualidade, conforme já descrito;
Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico
semeado.
Meio de cultura utilizado: Ágar Sangue (AS)
Para semeadura de cateteres, deve ser utilizada pinça estéril para fazer o processo de rolagem. É
importante observar, no momento da semeadura, que o cateter está rolando na placa e não sendo
esfregado. Isso é fundamental para obter colônias isoladas.
Após realização da semeadura por rolagem em AS do cateter colocar a placa de AS invertida
imediatamente na jarra de vela (microaerofilia) e incubar em estufa microbiológica a 35°±2°C por
até 72h.
Escarro
A cultura de escarro é importante para detecção de patologias pulmonares, pois cerca de 30 a 50%
das infecções são atualmente causadas por outras espécies que não as bactérias álcool ácido
resistente (micobactérias).
→Procedimento
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico
2% ou álcool 70%;
Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança;
Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso;
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Antes de semear é necessário realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de
boa qualidade, conforme já descrito;
Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico
semeado.
Meios de cultura utilizados: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (AC), Ágar MacConkey (MC)
e quando solicitado em Ágar Lowenstein-Jensen (LJ).
Utilizar a porção mais purulenta do escarro e semear por esgotamento (Técnica qualitativa) com
alça bacteriológica de 10µL nos meios de Ágar sangue (AS), Chocolate (AC) e Mac Conkey (MC).
As placas de AS e AC devem ser colocadas invertida imediatamente na jarra de microaerofilia com
a vela acesa e incubadas em estufa microbiológica a 35°±2°C por até 72h. Já a placa de MC em
aerobiose em estufa microbiológica a 35°±2°C também por até 72h.
O ágar Lowenstein-Jensen (LJ) deve ser semeado por estriamento na superfície inclinada do meio,
em seguida fechar o frasco. Incubar em estufa microbiológica a 35°±2°C por 30 dias ou mais.
Fezes
O cultivo de fezes é fundamental para o isolamento de microrganismos causadores de
gastroenterites agudas e/ou crônicas de origem bacteriana.
→Procedimento
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico
2% ou álcool 70%;
Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança;
Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso;
Antes de semear é necessário realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de
boa qualidade, conforme já descrito;
Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico
semeado.
Meios de cultura utilizados: Caldo Tetrationato (CT), Ágar Mac Conkey (MC) e Ágar
Salmonella/Shigella (SS).
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→Procedimento
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico
2% ou álcool 70%;
Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança;
Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso;
Antes de semear é necessário realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de
boa qualidade, conforme já descrito;
Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico
semeado.
Meios de cultura utilizados: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (AC), Ágar MacConkey
(MC).
Homogeneizar o material (LBA ou aspirado traqueal) e imergir a alça bacteriológica calibrada de
1µL na amostra de forma vertical.
Semear por Técnica quantitativa utilizando alça calibrada de 1µL em placa de ágar AS, AC e MC.
Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra
vela) a temperatura de 35± 2ºC e MC em aerobiose na estufa microbiológica por 24 a 48 horas, com
leituras diárias.
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Qualquer fluido estéril do corpo pode ser infectado por bactérias ocasionando patologias graves.
Apesar de esses materiais clínicos serem de diferentes áreas do corpo humano, são processados de
forma semelhante.
→Procedimento
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico
2% ou álcool 70%;
Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança;
Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso;
Antes de semear é necessário realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de
boa qualidade, conforme já descrito;
Meios de cultura utilizados: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (AC), Ágar MacConkey (MC)
e Caldo BHI.
*Amostras purulentas
Não há necessidade de centrifugar.
*Amostras pouco ou não purulentas
Separar parte do material em tubo estéril. Centrifugar por 15 minutos a 3.000- 5.000 rpm. Remover
o sobrenadante, suspender o sedimento para semear.
Em ambos os casos deve ser semear em meios de culturas sólidos padronizados AS, AC, MC pela
Técnica qualitativa por esgotamento, utilizando alça bacteriológica de 10µL. Uma pequena porção
do material biológico a ser processado deve ser coloca em meio de cultivo líquido o caldo BHI.
Em seguida colocar as placas de meios AS e AC em estufa microbiológica com 5 a 10% de CO2
(jarra vela) a temperatura de 35± 2ºC e o MC e caldo BHI em aerobiose na estufa microbiológica
por até 72h, com leituras diárias.
Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico
semeado.
Sangue
A cultura de sangue ou hemocultura é de fundamental importância para detecção de septicemia.
Principal causa de morbidade e mortalidade no âmbito hospital mundialmente.
→Procedimento
Em frascos de hemocultura manual
Após coleta do sangue em frascos específicos para hemocultura manual, o(s) frasco(s) deve ser
colocado em estufa por 24 horas.
Após 24h de incubação, realizar o primeiro repique da amostra de sangue nos meios de cultura:
AS, AC e MC com auxílio de agulha, seringa estéreis e alça de 10µL.
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico
2% ou álcool 70%;
Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança;
Como proceder?
Identificar as placas com números de identificação do paciente(s).
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Realizar descontaminação da tampa do frasco hemocultura com degermante da sua escolha (álcool
70%, hipoclorito ou ácido fênico).
1° Etapa: Transferir até 01 mL do sangue contido no frasco de hemocultura para seringa e colocar
01 ou 2 gotas nos meios de cultura acima citados.
2° Etapa: Desfazer a gota com auxílio de alça bacteriológica de 10µL, após flambagem.
Conforme figura abaixo.
Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. Sarvier: São Paulo. 2004.
3° Etapa: Deixar as placas semeadas por 05 minutos na bancada até que o sangue seja absorvido no
meio de cultura.
4° Etapa: Colocar as placas depois de semeadas em meios AS e AC em estufa microbiológica com
5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35± 2ºC e o MC em aerobiose na estufa
microbiológica. Verificar crescimento ou não de colônias microbianas no dia seguinte.
5° Etapa: Retornar os frascos de hemocultura em estufa.
Após 48h de incubação, realizar o segundo repique da amostra de sangue nos meios de cultura:
AS, AC e MC com auxílio de agulha, seringa estéreis e alça de 10µL.
Identificar as placas com números de identificação do paciente(s).
Realizar descontaminação da tampa do frasco hemocultura com degermante da sua escolha (álcool
70%, hipoclorito ou ácido fênico).
Repetir as etapas 1, 2, 3 e 4 acima descritas.
Após 04 dias da segunda semeadura, realizar o terceiro repique da amostra de sangue nos meios
de cultura: AS, AC e MC com auxílio de agulha, seringa estéreis e alça microbiológica de 10µL.
Identificar as placas com números de identificação do paciente(s).
Realizar descontaminação da tampa do frasco hemocultura com degermante da sua escolha (álcool
70%, hipoclorito ou ácido fênico).
Repetir as etapas 1, 2, 3 e 4 acima descritas.
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- Transferir até 01 mL do sangue contido no frasco de hemocultura com auxílio de seringa e agulha
estéreis e colocar 01 ou 2 gotas do sangue em uma das extremidades dos meios de cultura AS, AC e
MC.
-Em seguida realizar técnica de semeadura qualitativa por esgotamento utilizando alça
microbiológica de 10µL.
- Deixar as placas semeadas por 05 minutos na bancada até que o sangue seja absorvido no meio de
cultura.
- Colocar as placas depois de semeadas em meios AS e AC em estufa microbiológica com 5 a 10%
de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35± 2ºC e o MC em aerobiose na estufa microbiológica.
Verificar crescimento ou não de colônias microbianas no dia seguinte.
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico
2% ou álcool 70%;
Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança;
Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso;
Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico
semeado.
Meios de cultura utilizados: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (AC), Ágar MacConkey
(MC).
Rolar o swab do meio de Stuart (meio de transporte) contendo a amostra biológica em uma pequena
área das placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela técnica qualitativa utilizando
alça bacteriológica 10µL.
Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra
vela) a temperatura de 35± 2ºC e MC em aerobiose na estufa microbiológica por 24 a 48 horas, com
leituras diárias.
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Em caso de:
→ Procedimento para cultura de Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum em secreções
vaginal e uretral.
Realizar procedimento do Kit comercial adotado por padronização de cada laboratório.
→Procedimento
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico
2% ou álcool 70%;
Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança;
Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso;
Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico
semeado.
Meios de cultura utilizados: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (AC), Ágar MacConkey
(MC).
Rolar o swab do meio de Stuart (meio de transporte) contendo a secreção em uma pequena área das
placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela técnica qualitativa utilizando alça
bacteriológica 10µL.
Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra
vela) a temperatura de 35± 2ºC e MC em aerobiose na estufa microbiológica por 24 a 48 horas, com
leituras diárias.
Secreção Ocular
Várias são as patologias responsáveis por infecções nos olhos, dentre elas vale ressaltar por exemplo a
conjuntivite e ceratite.
→Procedimento
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Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico
2% ou álcool 70%;
Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança;
Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso;
Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico
semeado.
Meios de cultura utilizados: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (AC), Ágar MacConkey
(MC).
Rolar o swab do meio de Stuart (meio de transporte) contendo a amostra biológica em uma pequena
área das placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela técnica qualitativa utilizando
alça bacteriológica 10µL.
Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra
vela) a temperatura de 35± 2ºC e MC em aerobiose na estufa microbiológica por 24 a 48 horas, com
leituras diárias.
Urina
Atualmente o aumento do número de casos de infecções do trato urinário complicados vem
alarmando o âmbito hospitalar nacional e mundial, devido ao isolamento de bactérias com alto grau
de resistência as diferentes classes de antibióticos através do cultivo em meios de cultura.
→Procedimento
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico
2% ou álcool 70%;
Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança;
Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso;
Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico
semeado.
Meio de cultura utilizado: Ágar CLED
Homogeneizar a urina.
Introduzir a alça calibrada de 0,001ml ou 1µl após flambagem, verticalmente na amostra biológica e
realizar a semeadura quantitativa.
Incubar por 18 a 24 horas a 35± 2ºC em estufa microbiológica.
Este procedimento permite que se distribua o material de maneira uniforme na placa de meio de
cultura para auxiliar na contagem de colônias microbiológicas.
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Interessante!
A urocultura também pode ser realizada através de outros procedimentos, tais como:
Pour plate
Realiza a diluição da urina para obtenção de um fator a ser utilizado na interpretação.
Por exemplo: diluir 9,9 ml de salina estéril + 0,1ml de urina (10-2); diluir 9,9 ml de salina estéril +
0,1 ml da 1ª diluição (10-4).
Adicionar 01 ml da última diluição em placa de petri estéril (150 mm).
Acrescentar o ágar Mueller-Hinton (fundido), homogeneizando e incubando a 35-37°C em estufa,
incubado em aerobiose durante 24 horas.
A leitura é feita multiplicando o número de colônias obtido, pelo fator de diluição.
Lamino-Cultivo
Consiste de um recipiente plástico cilíndrico com uma tampa ligada a um suporte plástico com duas
faces contendo meios de cultura como CLED e MacConkey ou outras combinações. A leitura é feita
contando o número de unidades formadoras de colônias e o resultado interpretado seguindo as
orientações do fabricante, conforme figuras abaixo.
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♦ TAMANHO
O tamanho das colônias bacterianas deverá ser considerado na placa como um todo; uma mesma
cepa pode formar colônias de tamanhos variados em diferentes pontos da placa de meio de cultura.
Colônias Pequenas
Até 02 mm de diâmetro, bem característico de alguns gêneros:
# Enterococcus spp.; # Alguns estafilococos coagulase negativa (ECN);
# Streptococcus spp.; # Stenotrophomonas maltophilia; # Shigella spp.
Colônias Médias
Até 03 mm de diâmetro, como por exemplo:
# Escherichia coli; # Bacilos Gram negativos não fermentadores de glicose (alguns).
Colônias Grandes
Mais de 04 mm de diâmetro, bem característico dos gêneros:
# Proteus spp pela formação do véu. # Pseudomonas spp;
# Klebsiella spp.; # Enterobacter spp.,
Colônias Grandes
Pseudomonas spp / Ágar CLED
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♦ FORMA
As colônias bacterianas também apresentam formas variadas.
Redonda
A forma redonda das colônias bacterianas são sugestivas dos gêneros Klebsiella, Serratia,
Acinetobacter, Estafilococos, Estreptococos e da espécie Escherichia coli.
Irregular
A forma irregular das colônias bacterianas são sugestivas dos gêneros Pseudomonas e Proteus
(formação de véu).
Elevada
A forma elevada é sugestiva do gênero Klebsiella.
Chata
Esta forma é observada nas colônias de Enterobacter spp. e Pseudomonas spp.
♦ COR
A coloração das colônias bacterianas dependerá do meio de cultura utilizado.
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♦ CONSISTÊNCIA e DENSIDADE
As bactérias quando manuseadas podem apresentar uma consistência mucóide como ocorre com os
gêneros Klebsiella e Pseudomonas; bem como serem secas, casos este evidência em colônias de
Escherichia coli, Staphylococcus aureus ou Citrobacter spp. As colônias bacterianas também
podem ser opacas ou com brilhantes.
♦ PRODUÇÃO de ODOR
O odor produzido por muitas bactérias em determinados meios de cultura é característico e utilizado
em bacteriologia para sugerir algumas espécies, por exemplo:
» Odor adocicado – Pseudomonas aeruginosa;
» Odor de água sanitária – Shigella spp;
» Odor de queijo – Staphylococcus spp;
» Odor de vinagre – Escherichia coli;
» Odor de fermento de pão – Klebsiella pneumoniae;
♦ PRODUÇÃO de HEMÓLISE
Baseada na lise de hemácias contidas no ágar sangue (AS), conforme figura abaixo.
Lise Total → ocorre formação de halo de transparência ao redor e/ou sob as colônias, denominada
Beta-Hemólise (β-hemólise).
Lise Parcial → há formação de halo com coloração esverdeada ao redor das colônias, denominada
Alfa-Hemólise (α-hemólise).
Ausência de lise → meio de cultura AS inalterado, definido como Gama-Hemólise (γ-hemólise).
Fonte: MENEZES e SILVA. C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia Para o Laboratório Clínico. 2006. p472.
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Ϟ Número de colônias
As culturas semi-quantitativas e quantitativas são importantes para determinar uma possível
infecção ou contaminação em diferentes amostras biológicas, através de números pré-estabelecidos
pela literatura.
Isso se deve a alça de 0,001 ml; pois 01 colônia = 20.000 ou 2 x 104 UFC/ml
OBS 01: Qualquer número de colônias crescidas no meio específico para micobactérias deve ser
valorizado laboratorialmente.
OBS 02: Se o aspirado traqueal estiver muito espesso, deve-se realizar uma diluição de 1:10 com
agente mucolítico, ou seja:
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ϞϞ CATETER
A cultura semi-quantitativa dos cateteres com pinça estéril deve ser valorizada, quando a contagem
de colônias bacterianas apresentarem um número maior ou igual a 15 unidades formadora de
colônias de um único tipo de microrganismo; desse modo sugere-se que a ponta de cateter pode ser
fonte de infecção (critério de Maki). Com uma contagem menor, o cateter tem baixa probabilidade
de ser fonte de infecção.
ϞϞ ESCARRO
A cultura qualitativa do escarro com alça de 0,01ml (10µl) nos meios AS, AC e MC deve ser
valorizada se houver:
ϞϞ FEZES
A cultura qualitativa das fezes com alça de 0,01mL (10µL) nos meios de cultura SS e MC devem
ser valorizadas se houver:
**Caso incomum, pois é sabido que a distribuição da microbiota do intestino grosso por ex: é de
10.000.000.000.000 (dez trilhões). Deste modo deve-se verificar o quadro patológico do paciente,
ou possíveis erros pré-analíticos.
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ϞϞ SANGUE
A presença de microrganismos viáveis no sangue do paciente representa, em algumas situações, um
agravamento do processo infeccioso, o que torna a hemocultura um exame crítico e de grande
importância.
Portanto deve-se valorizar a presença de crescimento bacteriano nos meios de cultura AS, AC e
MC; através da semeadura qualitativa pela alça de 10µL. Após detecção de positividade da amostra
em questão pelo equipamento automatizado.
ϞϞ SECREÇÕES GENITAIS ♀ E ♂
A microbiota normal da uretra feminina e masculina é constituída por vários microrganismos.
Assim, a interpretação dos resultados microbiológicos deve ser feita com cautela, certeza de
ausência de outros patógenos potenciais e com ênfase na sintomatologia descrita pelos dados clínico
do paciente.
A cultura qualitativa das secreções genitais com alça de 0,01ml (10µl) nos meios AS, AC e MC
deve ser valorizada se houver:
ϞϞ SECREÇÕES em GERAL
A cultura qualitativa de feridas, úlceras, abscessos entre outras com alça de 0,01ml (10µl) nos
meios AS, AC e MC deve ser valorizada se houver:
ϞϞ SECREÇÃO OCULAR
A cultura qualitativa da secreção ocular com alça de 0,01ml (10µl) nos meios AS, AC e MC deve
ser valorizada se houver:
ϞϞ URINA
A cultura quantitativa da urina em CLED com semeadura por alça de 0,001mL (1µl) de ser valoriza
se houver:
Crescimento de colônias de mesma forma e característica macroscópica.
Crescimento de colônias diferentes em quantidades e que reflitam a presença de microbiota uretral
na amostra biológica, deve solicitar nova coleta.
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→11 a 100.000 UFC/ml: suspeita de infecção urinária deve ser associado à piúria e sintomatologia
do paciente.
→Acima de 100.000 UFC/ml: infecção urinária instalada.
Purulento
Não há necessidade de centrifugação da amostra biológica estéril.
Com auxílio de alça bacteriológica estéril de 10µL pegar a amostra, colocar sobre lâmina limpa e
desengordurada e espalhar realizando movimentos ovais.
Deixar secar a temperatura ambiente ou utilizar fixador químico ou físico.
Realizar coloração conforme solicitação médica.
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O esfregaço deve ser preparado após coleta da amostra biológica com swab estéril.
Com o auxílio do swab estéril, realizar movimentos circular e oval sobre a lâmina (limpa e
desengordurada).
A lâmina deve ser seca em temperatura ambiente e fixada pelo calor.
Realizar coloração conforme solicitação médica.
Materiais Mucóides
Escarro Expectorado
Separar os grumos purulentos ou com sangue da saliva com auxílio de haste de madeira e
placa de petri estéril (ao arrastar o grumo de pus, o excesso de saliva fica aderido à
superfície, e o material purulento deve ser preferencial para o esfregaço).
Com o auxílio de haste de madeira (palito de picolé), realizar movimento em uma única
direção sobre uma lâmina nova, limpa e desengordurada, repetir o movimento.
A lâmina deve ser seca em temperatura ambiente e fixada pelo calor.
Realizar coloração conforme solicitação médica.
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Do tubo do centrifugado, deve-se retirar o sobrenadante com pipeta estéril, reservando de 0,5 a 1
mL de sedimento. O sobrenadante pode ser conservado para ensaios bioquímicos (caso for coletado
apenas um frasco do líquido estéril).
Ressuspender o sedimento (não deve ser utilizada pipeta para misturar o sedimento), pegar duas
alçadas do material, colocar sobre lâmina limpa e desengordurada e espalhar realizando
movimentos ovais.
Deixar secar a temperatura ambiente ou utilizar fixador químico ou físico.
Realizar coloração conforme solicitação médica.
Turvo
Os mesmos procedimentos acima citados podem ser realizados, sendo importante analisar a
consistência da turvação.
Fonte: MENEZES e SILVA. C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia Para o Laboratório Clínico. 2006. p76.
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COLORAÇÃO de GRAM
Descoberto por Hans Cristian Joaquim Gram, bacteriologista dinamarquês, a coloração de Gram
tem importância crucial na microbiologia de urgência.
A técnica se baseia na composição da parede celular bacteriana para diferenciá-las e classificá-las.
Utilizam-se dois corantes neste método: violeta de genciana e fucsina diluída. Ainda é empregado
um mordente (ou fixador): lugol e uma solução diferenciadora (descorante): álcool-acetona.
Esta diferença é devido à composição da parede celular: nos microrganismos Gram positivos, a
parede é rica em peptideoglicano, formando uma espessa camada que retém o complexo Violeta-
Lugol dentro da célula e é pouco permeável ao álcool-acetona. Ao contrário, a parede celular de
microrganismos Gram negativos apresenta uma camada mais delgada de peptideoglicano, que são
mais permeáveis ao álcool e permitem a remoção do corante do interior da bactéria.
Para evidenciar estas características, utiliza-se um corante de contraste, a fucsina diluída que vai
corar as células Gram negativas.
** Técnica
Confeccionar o esfregaço, com auxílio de alça bacteriológica ou swab;
Aguardar a secagem natural do esfregaço e fixar o mesmo pelo calor;
Colocar a lâmina sobre o suporte na cuba de coloração e cobrir com violeta de genciana por
1 minuto;
Desprezar o excesso de violeta e cobrir a lâmina com lugol por 1 minuto;
Lavar com água corrente;
Descorar com álcool-acetona rapidamente;
Lavar novamente com água corrente;
Cobrir com fucsina de Gram por 30 segundos;
Lavar, aguardar a secagem da lâmina e examinar ao microscópio com objetiva de imersão.
COLORAÇÃO de ZIEHL-NEELSEN
É utilizada para detecção das micobactérias de interesse clínico.
A técnica se baseia na composição da parede celular bacteriana composta com alto teor de lipídeos
(cerca de 60%, principalmente de Ácido micólico), que quando tratadas pelo corante Fucsina
fenicada E AQUECIMENTO (chama do bico de bulsen) coram-se de vermelho e persistem ao
descoramento subsequente por uma solução de Álcool-Ácido forte (diferenciador). As outras
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bactérias, que não possuem a mesma composição da parede bacteriana, têm a sua coloração pela
fucsina descorada pela solução de álcool-ácido e coram-se de Azul pela ação do corante Azul de
metileno (contra-corante).
COLORAÇÃO de KINYOUN
É uma técnica de coloração similar a coloração de Ziehl Neelsen, mas realizada a frio para
detecção micobactérias de interesse clínico.
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Dentre os cocos Gram positivos serão enfatizados alguns gêneros: estafilococos, estreptococos e
enterococos.
Após avaliação preliminar da característica macroscópica e crescimento da colônia microbiológica,
bem como realização do esfregaço e coloração de Gram confirmando a presença de CGP em
microscópio óptico (objetiva 1000X – imersão). A identificação e diferenciação dos gêneros dos
cocos Gram positivos se inicia com a prova da catalase.
PROVA DA CATALASE
Finalidade
Verificar a presença da enzima catalase que decompõe H2O2 em H2O e O2, dessa forma, distinguir
os grupos estafilococos dos estreptococos e enterococos.
Procedimento
Com alça bacteriológica, retirar duas ou três colônias do meio de cultura.
Colocar a colônia sobre a lâmina de vidro ou de fundo escuro e adicionar uma gota de H2O2.
Leitura
Observar a formação de bolhas
Interpretação
Formação de bolhas indica ser o gênero Staphylococcus spp.
Sem formação de bolhas indica serem os gêneros Streptococcus spp. e Enterococcus spp.
Finalidade
Verificar se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) livre e ligada que, reagindo
com um fator plasmático, forma um complexo que atua no fibrinogênio do plasma formando a
fibrina.
Procedimento
Colocar 0,5 mL de plasma comercial em tubo de ensaio.
Adicionar um alçada de colônia diretamente no plasma comercial (plasma de coelho liofilizado).
Identificar e incubar por 4 h a 35±2°C em estufa ou banho-maria; caso não haja formação de
coágulo, incubar por 24h.
Leitura
Formação de coágulo observada pela inclinação suave do tubo.
Interpretação
Formação de coágulo inteira ou parcial identifica o Staphylococcus aureus.
Não formação de coágulo identifica os estafilococos coagulase negativa (ECN).
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Finalidade
Verificar se o microrganismo possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada o ácido nucléico
(DNA).
Procedimento
Fazer um inóculo denso de forma circular em uma pequena parte do meio DNase;
Identificar a placa e incubar a 35±2°C por 18 – 24h. Na placa pode ser inoculada com várias cepas.
Leitura
Formação de um halo cor-de-rosa ao redor do crescimento bacteriano.
Interpretação
Formação de halo cor-de-rosa identifica Staphylococcus aureus.
Crescimento bacteriano sem formação de halo cor-de-rosa identifica os estafilococos coagulase
negativa.
OBS: este teste pode também ser usado para identificação dos bacilos Gram negativos não
fermentadores de glicose.
Finalidade
Verificar se o microrganismo tem a capacidade de fermentar o manitol contendo 7,5% de cloreto de
sódio.
Procedimento
Semear com auxílio de alça bacteriológica as colônias (3-4 colônias) na superfície do ágar manitol.
Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h.
Leitura
Formação de superfície amarela produzida pelas colônias no ágar manitol.
Interpretação
Formação de superfície amarela pelas colônias identifica Staphylococcus aureus.
Meio permanece inalterado na superfície, identifica estafilococos coagulase negativa (ECN).
OBS: outras espécies de estafilococos, com pouca frequência, também podem produzir ácido a
partir do manitol, portanto também devem ser testados quanto à produção de coagulase.
Finalidade
Verificar se o microrganismo é resistente à novobiocina.
Procedimento
Semear a colônia em ágar Mueller-Hinton, através da técnica de execução do antibiograma.
Com auxílio de pinça estéril, colocar um disco de novobiocina 5µg/mL.
Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h.
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Leitura
Formação de halo de inibição, que deve ser medido.
Interpretação
Formação de halo ≤ 16 mm identifica Staphylococcus saprophyticus.
Finalidade
Verificar se o microrganismo é sensível ou resistente a polimixina B.
Procedimento
Semear a colônia em ágar Mueller-Hinton, através da técnica de execução do antibiograma.
Com auxílio de pinça estéril, colocar um disco de polimixina B.
Identificar a placa e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h.
Leitura
Formação ou ausência de halo de inibição.
Interpretação
Formação de halo, Staphylococcus haemolyticus, S. saprophyticus, S. intermedius e S.
hominis.
Ausência de halo, Staphylococcus aureus e S. epidermidis.
OBS: Para espécie Staphylococcus lugdunensis a sensibilidade ou resistência a polimixina B é
variável.
Finalidade
O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida também por
alguns estafilococos coagulase negativa (ECN).
Procedimento
Com auxílio de uma pinça, retirar um disco de PYR do frasco e colocá-lo sobre uma lâmina ou
placa de Petri vazia.
Pingar uma gota de água destilada estéril (não utilizar salina, pois torna a reação mais lenta e menos
intensa).
Realizar um esfregaço (de preferência com palito de madeira) com bactéria a ser testada, recém-
isolada, sobre o disco de PYR umedecido.
Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reação ocorre em até um minuto.
Interpretação
Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha.
Os Staphylococcus lugdunensis, S. haemoliticus e S. intermedius são PYR (+).
O aparecimento de coloração amarela ou laranjada indica resultado negativo.
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Procedimento
Com auxílio da alça ou agulha de repique microbiológica, introduzir com uma picada central no
ágar ornitina 03 a 04 colônias do ECN a ser testado.
Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h.
Leitura
Formação de cor amarela ou roxa no tubo contendo ornitina.
Interpretação
Teste (+): Meio com coloração roxa
Teste (-): Meio com coloração amarela
S. epidermidis − − − S R − ----
S. hominis − − − S S −
S. intermedius − + + S S + ----
S. saprophyticus − − + R S − ----
Legenda: + = positivo; − = negativo; S= sensível; R= resistente; V= variação.
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A classificação do tipo de hemólise é fator primordial para indicar quais as provas de identificação
devem ser realizadas a fim de chegar a espécies de cocos Gram positivo, catalase negativa.
Finalidade
Diferenciar Streptococcus pyogenes (grupo A) de outras espécies de CGP catalase negativa.
Procedimento
Com auxílio do swab umedecido com salina estéril, pegar 04 ou 05 colônias puras beta-hemolíticas
da placa primária ou reisolamento.
Semear as colônias presentes no swab, em ágar sangue com movimentos retilíneos e uniformes em
todos os sentidos da placa.
Colocar na superfície do AS um disco de bacitracina 10mcg.
I identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 35±2°C em estufa por 18-24h.
Leitura
Formação de halo de inibição.
Interpretação
A presença de qualquer halo de inibição ao redor do disco é interpretada como sensível a
bacitracina e indicando a espécie S. pyogenes.
Finalidade
O teste visa identificação de cepas de Streptococcus agalactiae (grupo B). Estas cepas produzem o
fator CAMP que atua sinergicamente com a β-hemolisina produzida pelo Staphylococcus aureus em
ágar sangue.
Procedimento
Semear um inóculo na horizontal de S. aureus ATCC 25923 (ou cepa de S. aureus com duplo halo
de hemólise) de um ponto a outro da placa de AS (ágar sangue).
Semear perpendicularmente (90°) a colônia de estreptococo beta-hemolítico a ser testada, sem que
haja contato com a estria de S. aureus.
Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 35±2°C em estufa por 18-24h.
Leitura
Visualizar a imagem de uma seta ou meia-lua no AS.
Interpretação
A formação de uma seta ou meia-lua convergindo para o S. aureus na intersecção do
crescimento das duas bactérias indica que o teste é positivo e indica a espécie de
Streptococcus agalactiae.
Se não houver formação de seta ou meia-lua, o teste é negativo e a cepa não pertence ao
grupo B de Lancefield.
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Finalidade
O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida pelo
Streptococcus pyogenes, mas não pelos demais estreptococos β-hemolíticos. Colônias β-hemolíticas
de enterococos podem ser confundidas com S. pyogenes, pois ambas apresentam positividade neste
teste.
Procedimento
Com auxílio de uma pinça, retirar um disco de PYR do frasco e colocá-lo sobre uma lâmina ou
placa de Petri vazia.
Pingar uma gota de água destilada estéril (não utilizar salina, pois torna a reação mais lenta e menos
intensa).
Realizar um esfregaço (de preferência com palito de madeira) com bactéria a ser testada, recém-
isolada, sobre o disco de PYR umedecido.
Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reação ocorre em até um minuto.
Interpretação
Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha.
Os Streptococcus pyogenes e os Enterococcus spp. são PYR positivo.
O aparecimento de coloração amarela ou laranjada indica resultado negativo.
Finalidade
Diferencia os Enterococcus spp de outros Streptococcus spp., tendo como princípio a hidrólise da
esculetina presente no meio de cultura bile-esculina pela bactéria; formando esculetina e dextrose.
A esculetina reage com sais de ferro presente no meio bile-esculina tornando-o enegrecido.
Procedimento
Semear com auxílio de alça bacteriológica as colônias (3-4 colônias) do ágar sangue na superfície
do ágar Bile-esculina. Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h.
Interpretação
Presença de cor enegrecida na superfície do meio bile-esculina, identifica Enterococcus spp.
Meio permanece inalterado na superfície do meio bile-esculina, identifica outros Streptococcus spp.
Finalidade
Determinar a capacidade do microrganismo de crescer em altas concentrações de sal.
Procedimento
Com auxílio de alça inocular 03 a 04 colônias a serem testadas em um caldo BHI suplementado
com 6,0% de NaCl (com ou sem indicador). Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa
microbiológica por 24h.
Interpretação
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A turvação ou mudança de cor (no caso adição indicador) indica crescimento de Enterococcus spp.
◘ PROVA da OPTOQUINA
Finalidade
Fármaco utilizado para indicar se o estreptococos alfa-hemolítico é um pneumococo. A optoquina é
uma droga solúvel em água que se difunde rapidamente em meio de cultura sólido.
Procedimento
Com auxílio do swab umedecido com salina estéril, pegar 04 ou 05 colônias puras alfa-hemolíticas
da placa primária ou reisolamento.
Semear as colônias presentes no swab, em ágar sangue com movimentos retilíneos e uniformes em
todos os sentidos da placa. Colocar na superfície do AS um disco de optoquina 5µg.
Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 35±2°C em estufa por 18-24h.
Interpretação
Presença de halo de inibição ≥ 14 mm = Sensível a optoquina → Streptococcus pneumoniae.
O pneumococo pode apresentar halos < 14 mm, como os estreptococos grupo viridans.
Deve-se então ser realizado o teste de bile solubilidade.
Finalidade
Capacidade do desoxicolato de sódio (sal biliar) de lisar seletivamente o Streptococcus pneumoniae
em fase logarítmica do crescimento. Este sal ativa as enzimas autolíticas (autolisinas) produzidas
pelo pneumococo, acelerando a reação lítica natural da bactéria.
Procedimento
Preparar uma suspensão bacteriana densa a partir da cultura recente.
Utilizar 02 tubos de ensaio transparentes, para o teste: Tubo controle “C” e Tubo teste “T”.
Adicionar solução de desoxicolato de sódio 2% ao tubo ”T” e solução salina a 0,85% ao tubo “C”.
Os volumes em cada tubo devem ser iguais 0,5ml (500µL). Adicionar a cada tubo o mesmo volume
da suspensão bacteriana.
Homogeneizar e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica.
Fazer a leitura imediatamente, após 1h e até 2h de incubação.
Interpretação
Reação Positiva = Tubo“T” límpido ou turvação visivelmente menor que o Tubo “C”,
confirma a espécie Streptococcus pneumoniae.
Reação Negativa = Tubo “T” com turvação igual ao tubo “C”.
Finalidade
Verificar se os estreptococos não pertencem ao grupo A, B ou D de Lancefield.
Procedimento
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Com auxílio do swab umedecido com salina estéril, pegar 04 ou 05 colônias puras beta-hemolíticas
da placa primária ou reisolamento. Semear as colônias presentes no swab, em ágar sangue com
movimentos retilíneos e uniformes em todos os sentidos da placa.
Colocar na superfície do AS um disco de STX. Identificar e incubar em jarra de vela, a 35±2°C por
18-24h.
Interpretação
Ausência de halo (Resistente), Streptococcus pyogenes; S. agalactiae e Enterococcus spp.
Presença de halo (Sensível), estreptococos não A, B ou D.
◘ TESTE da ARGININA
Finalidade
Determinar se o Enterococcus spp em estudo é capaz de hidrolisar o aminoácido arginina.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias, depositando o inóculo na
parede do tubo, abaixo do óleo mineral. Incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h.
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Leitura
Hidrólise da arginina
Cor púrpura do meio mais acentuado que tubo controle: utilização do aminoácido.
Cor do meio igual ou mais amarelada que tubo controle: não utilização do aminoácido.
Finalidade
Determinar se o Enterococcus spp. em estudo é capaz de consumir os açucares manitol, sorbitol e
arabinose, sendo detectado pela produção de ácido.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias por picada central nos
tubos de meio de cultura manitol, sorbitol e arabinose. Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em
estufa por 24h.
Leitura
Consumo do manitol/sorbitol/arabinose
Cor rosa intenso dos tubos: Reação Positiva.
Cor rosa claro dos tubos: Reação Negativa.
◘ MOTILIDADE do microrganismo
Finalidade
Determinar a capacidade de movimentação do enterococos em estudo, distinguindo deste modo, a
espécie do microrganismo em questão.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias por picada central nos
tubo de meio de cultura do teste de motilidade.
Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24 horas.
Leitura
Crescimento além da picada, motilidade POSITIVA.
Crescimento somente na picada, motilidade NEGATIVA.
Finalidade
A identificação da coloração da colônia tem como finalidade auxiliar na diferenciação das espécies
de enterococos.
Procedimento
Com auxílio de swab estéril branco passar o mesmo nas colônias e verificar as cores.
Leitura
As colônias dos enterococos podem apresentar coloração branca ou amarela.
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9.2.1-ENTEROBACTÉRIAS
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CITRATO
Finalidade
Verificar se as bactérias são capazes de utilizar o citrato como única fonte de carbono.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril estriar 03 a 04 colônias na superfície do tubo de
meio citrato. Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h.
Interpretação
Crescimento bacteriano e/ou mudança de cor para azul intenso → Reação Positiva
Ausência de crescimento bacteriano, cor inalterada → Reação Negativa.
FENILALANINA (FENIL)
Finalidade
Verificar se as bactérias são capazes de degradar o aminoácido fenilalanina através da enzima
fenilalanina desaminase, tendo como produto final da reação o ácido fenilpirúvico.
O ácido fenilpirúvico é detectado com adição do Cloreto férrico 10% (indicador da reação).
Somente os gêneros: Proteus, Morganella e Providencia possuem a enzima fenilalanina desaminase.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril estriar 03 a 04 colônias na superfície do tubo de
meio citrato. Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h.
Após 24h de incubação adicionar o cloreto férrico 10%.
Interpretação
Coloração verde musgo na superfície do fenil, após adição do cloreto férrico → Reação Positiva.
Ausência de coloração verde musgo, após adição do cloreto férrico 10% → Reação Negativa.
LISINA
Finalidade
Verificar a capacidade das bactérias de descarboxilar o aminoácido lisina em amina, resultando em
alcalinidade do meio de cultura lisina; bem como verificar a motilidade bacteriana e a visualização
do indol (produto final da descarboxilação do aminoácido triptofano) detectado com a adição do
reativo de Ehrlich ou Kovacs.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias por picada central no
tubo do meio lisina. Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h.
Após 24h de incubação interpretar as reações metabólicas.
Interpretação
# Descarboxilação da lisina
Teste (+): Lisina com coloração roxa
Teste (−): Lisina com coloração amarela
# Motilidade bacteriana
Crescimento além da picada (turvação do meio lisina). Motilidade POSITIVA.
Crescimento somente na picada (meio lisina límpido). Motilidade NEGATIVA.
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# Produção de indol
Adicionar o reativo de Ehrlich ou Kovacs e observar a reação.
Teste (+): formação de anel róseo na superfície do meio, após adição do reativo Ehrlich.
Teste (−): formação de anel amarelado na superfície do meio, após adição do reativo Ehrlich.
RUGAI
Finalidade
Verificam se as bactérias são capazes de: fermentar glicose e lactose, produzir gás e H2S (gás
sulfídrico), degradar uréia e o aminoácido triptofano. Todas estas informações são visualizadas nas
bases inferior e superior do tubo Rugai.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias por picada central até o
final do tubo e ao chegar à superfície do meio Rugai realizar estrias. Identificar e incubar o tubo a
35±2°C em estufa por 24h. Após 24h de incubação interpretar as reações metabólicas.
Interpretação
Na Base Inferior do Tubo Rugai
→ Fermentação da Glicose
Teste (+): base inferior do rugai amarela = bactéria fermentadora de glicose.
Teste (−): base inferior do rugai inalterada (verde) = bactéria não fermentadora de glicose.
→ Produção de Gás
Teste (+): bolhas na base inferior do tubo rugai.
Teste (-): ausência de bolhas na base inferior do rugai.
→ Degradação da Uréia
Teste (+): base inferior do rugai azul = bactéria degrada uréia pela ação enzima urease.
Teste (−): base inferior do rugai sem a coloração azul = bactéria não degrada uréia.
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GUIA SIMPLIFICADO
Para Provas Manuais de Identificação Bioquímica de Algumas Enterobactérias.
OBS: Nos casos em que as provas manuais de identificação não determinam as espécies das
enterobactérias deve-se utilizar o painel comercial, descrito em ANEXOS.
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Importante
Identificação complementar das enterobactérias causadoras de infecções, isoladas na
coprocultura.
É realizada com sorotipos comerciais (SoroKit-PROBAC®) para Salmonella spp, Shigella spp. e
Escherichia coli clássica e invasora.
Procedimento
Adicionar ao tubo de rugai da bactéria a ser testada 0,5 ml (500µL) de solução de salina estéril,
homogeneizando bem para obter uma suspensão bem concentrada.
Em placa de fundo escuro, realiza-se a reação:
Colocando 50 μl da suspensão bacteriológica a ser testada nas áreas da placa;
Adiciona-se, em cada reação, o soro correspondente, homogeneizando com bastão de plástico;
Agitar a placa de reação por 2 minutos (agitador de Kline ou manualmente com movimentos
giratórios);
Após término de 2 minutos, observar se há presença de grumos de aglutinação, o que indica
positividade da reação.
Não Esquecer
Dentro da família Enterobacteriaceae, encontram-se espécies bacterianas relacionadas
bioquimicamente, mas divididas em subgrupos por critérios sorológicos, de acordo com a presença
de antígenos, tais como:
Ag somático (O)
Ag flagelar (H)
Ag Capsular (K)
Em atividades de rotina de bacteriologia clínica a confirmação é feita apenas para bactérias de
importância patogênica e epidemiológica em gastroenterites como:
# Salmonella spp: utilizando sorotipos para pesquisa de antígeno somático (O) e flagelar (H).
#Shigella spp; utilizando sorotipos específicos somente para o antígeno (O) de cada espécie desse
microrganismo (S. sonnei, S. flexneri, S. dysenteriae e S. boydii).
# Escherichia coli
Enteropatogênicas (EPEC) e Enteroinvasoras (EIEC) utilizando sorotipos para antígenos (O) e (H).
As EPEC são móveis isoladas em coproculturas de crianças até 2 anos de idade e pesquisadas com
soro polivalente A, B e C. Já as EIEC são imóveis, isolada de pacientes adultos, com uso de soros
polivalentes A e B.
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São bactérias incapazes de utilizar carboidratos (principalmente glicose) como fonte de energia
através da fermentação, degradando-os pela via oxidativa. A maioria dos BGNÑF são móveis e
oxidase positiva.
Possuem como habitat natural o meio ambiente, sendo encontrados na água e solo.
As amostras oriundas do meio ambiente hospitalar são frequentemente isoladas de respiradores,
cateteres de sucção, antissépticos, soros, etc.
Dentre os principais gêneros causadores de infecções em seres humanos, destacam-se:
Pseudomonas spp.;
Acinetobacter spp.;
Complexo Burkholderia;
Stenotrophomonas sp.;
Chryseobacterium spp.
As provas de identificação das espécies de BGNÑF foram padronizadas de forma manual e semi-
automatizada (Kit comercial) pelo setor de microbiologia do LEAC-HGU.
Dentre as provas manuais, o Rugai é o teste que presume a não fermentação da glicose pela via
fermentativa, pois a base inferior do tubo de rugai apresenta-se inalterado (verde). Então se deve
utilizar o kit comercial (Kit NFII-Probac®) para identificar as espécies de BGNÑF, descritas em
ANEXOS.
Os bacilos álcool ácido resistente (BAAR) são causadores da Tuberculose e Hanseníase. O quadro
abaixo mostra outros possíveis materiais biológicos que podem ser isolados os BAAR.
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Diagnóstico Laboratorial
o Baciloscopia
Após realização do esfregaço do material biológico e coloração pelo método de Ziehl-Neelsen ou
Kinyoun. Deve-se observar o esfregaço em objetiva de imersão.
→ A quantidade de BAAR existentes nos agrupamentos é variável. O aspecto agregado dos bacilos
é devido à produção do “fator corda”.
→O aspecto fragmentado é encontrado com frequência nas baciloscopias de controle de tratamento.
A fragmentação é decorrente, principalmente pela ação das drogas antituberculosas que agem na
parede celular do BAAR.
→ Já os BAAR na linfa são visualizados de forma arranjados e organizados denominados globias.
BAAR em esfregaço de escarro corado em Ziehl-Neelsen. “Efeito corda” do BAAR, meio de cultura líquido.
Leitura e Interpretação
Em amostras de escarro, quando:
♦ não são encontrados BAAR em 100 campos visualizados, relata-se:
Não foram visualizados BAAR na amostra analisada.
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o Cultura
Responsável pelo isolamento e a multiplicação de BAAR.
Diferentes meios de cultura tem sido desenvolvidos para o isolamento das micobactérias porém, os
mais utilizados nos laboratórios de microbiologia são os meios sólidos e os meios líquidos, como
por exemplo: Lowenstein-Jensen, Ogawa-Kudoh, Middlebrook 7H10 e 7H9.
O crescimento de colônias de BAAR é de aproximadamente 30 dias.
OBS: Quando solicitado, a cultura para BAAR o material biológico é encaminhado ao laboratório
de apoio.
Dentre os diplococos Gram negativos os mais comumente isolados na rotina laboratorial são:
Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae e Moraxella catharralis, estas espécies são
analisadas juntas devido à possibilidade de haver confusão na sua identificação.
Os diplococos Gram negativos são: achatados nas laterais, dando a forma de rins ou dois grãos de
feijão unidos, imóveis, oxidase e catalase positiva e utilizam carboidratos por via oxidativa e não
fermentativa.
Diagnóstico Laboratorial
Vários podem ser as amostras clínicas coletadas para o isolamento dos diplococos Gram negativos,
tais como:
Secreção uretral, endocervical, orofaringe, conjuntiva, glândula de Bartholin, líquor, líquido
sinovial, sangue, entre outros.
▪▪ Bacterioscopia
Após realização do esfregaço do material biológico e coloração pelo método de Gram. Deve-se
observar o esfregaço em objetiva de imersão.
→ Leitura
Relatar a bacterioscopia de modo a quantificar no material analisado a presença ou ausência de
diplococos Gram negativos, se estão intracelulares ou extracelulares e quantidades de neutrófilos.
▪▪ Cultura e Identificação
O isolamento dos diplococos Gram negativos devem ser realizados em ágar específicos (Chocolate
e Thayer-Martin) e ágar não seletivo (ágar Sangue). Identificar e incubar em jarra de vela placa de
meio a 35±2°C em estufa por até 72h caso não haja crescimento de colônias.
Algumas provas para identificação manual das principais espécies de diplococos Gram negativos
podem ser realizadas, conforme descritas no quadro abaixo.
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# Neisseria gonorrhoeae
No homem causa: uretrite, prostatite e estenose uretral.
Na mulher causa: corrimento vaginal, endocervicite, uretrite, doença inflamatória pélvica entre
outras patologias.
Em recém-nascidos pode causar uma conjuntivite denominada Oftalmia neonatorum.
# Neisseria meningitidis
Podem causar meningite e infecção sistêmica grave com coagulação intravascular disseminada
(CIVD).
# Moraxella catarrhalis, pode causar otite, sinusite e pneumonia.
Diagnóstico Laboratorial
▬ Bacterioscopia
Após realização do esfregaço do material biológico e coloração pelo método de Gram. Deve-se
observar o esfregaço em objetiva de imersão.
→ Leitura
Relatar a bacterioscopia de modo a quantificar no material analisado a presença ou ausência de
microrganismos visíveis de várias formas = pleomórfico, ou seja, cocobacilos Gram negativos.
▬ Cultura e Identificação
O isolamento dos Haemophilus spp. devem ser realizada em ágar chocolate suplementado e para
realização do antibiograma o meio de cultura recomendado é o ágar HTM (Haemophilus Test
Medium). Identificar e incubar em jarra de vela placa de meio a 35±2°C em estufa por até 72h caso
não haja crescimento de colônias.
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Algumas provas para identificação manual das principais espécies de Haemophilus podem ser
realizadas, conforme descritas abaixo.
→ FATORES X E V
Finalidade
Determinar a afinidade dos Hamophilus spp. em crescer utilizando fatores protéicos como hemina
e/ou NAD+.
Procedimento
Com auxílio do swab estéril umedecido com salina estéril, pegar 04 ou 05 colônias puras da placa
primária (ágar chocolate suplementado) ou reisolamento.
Semear as colônias presentes no swab, em ágar chocolate ou HTM com movimentos retilíneos e
uniformes em todos os sentidos da placa. Colocar na superfície do ágar chocolate os discos
comerciais com os fatores X e V com pinça estéril a uma distância de 1,5 cm um disco do outro.
Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 35±2°C em estufa por 18-24h.
Interpretação
Crescimento bacteriano entre os discos = Haemophilus influenzae.
Crescimento bacteriano ao redor apenas do disco com fator X = H. parainfluenzae.
Crescimento bacteriano ao redor apenas do disco com fator V = H. ducrey.
Fonte: Manual de Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica para Controle Infecção Hospitalar.
→ PROVA DO SATELITISMO
Finalidade
Determina a capacidade do gênero Haemophilus em crescer ao redor da lise total das hemácias em
ágar sangue devido ação do Staphylococcus aureus.
Procedimento
Com auxílio alça calibrada, pegar colônias puras dos cocobacilos Gram negativos para realização de
suspensão bacteriana em salina estéril na escala de 1 a 2 de Mc Farland.
Em seguida semear a suspensão em ágar sangue e inocular uma única estria de S. aureus hemolítico
(ATCC 23922). Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 35±2°C em estufa por 18-24h.
Interpretação
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▪Cultura de Células
É o método de eleição para o diagnóstico até o momento; porém é pouco utilizada na rotina de
laboratórios clínicos, devido às dificuldades técnicas.
▪ Técnica de ELISA
Empregam anticorpos mono ou policlonais que detectam o LPS da bactéria. Na sua maioria estes
testes não são espécie-específica podendo dar reação falso-positiva para outras bactérias presentes
no material biológico como, por exemplo, na secreção vaginal.
▪Imunofluorescência Direta
Emprega conjugados de fluoresceína-isotiocianato e anticorpos monoclonais direcionados para
proteínas de membrana ou LPS (endotoxina) de C. trachomatis. Comercialmente disponível em
forma de Kits.
▪Técnicas Moleculares
Hibridização com Sondas de ácidos nucléicos;
Amplificação de ácidos nucléicos (PCR-Reação de Cadeia Polimerase).
Ambas as técnicas são utilizadas na detecção de Chlamydia trachomatis.
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Já as espiroquetas são helicoidal, móveis através de flagelos, não são coradas pelo método de Gram.
Pode ser observada em microscopia de campo escuro das amostras clínicas obtidas a partir de
lesões. A espécie Treponema pallidum é o principal agente patogênico humano, causador da sífilis.
O Treponema pallidum não cresce fora do hospedeiro humano, deste modo todas as tentativas de
cultivar in vitro os treponemas não foram possíveis.
♦ Bacterioscopia
Devido a sua dimensão e ausência de parede celular, não são corados pelos corantes
bacteriológicos, consequentemente não são visualizados com auxílio de microscópios ópticos.
OBS: A implantação do kit comercial para tais microrganismos estão em fase de adequação pelo
setor de microbiologia do LACHGU.
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Vaginite Infecciosa
Os principais microrganismos envolvidos são leveduras do gênero Candida e Trichomonas
vaginalis (protozoário que afeta aproximadamente 180 milhões de mulheres em todo mundo).
Manifestações Clínica
Diagnóstico Laboratorial
Finalidade
Visualizar a presença dos protozoários flagelados e móveis, bem como leveduras em brotamento ou
pseudo-hifas. A presença de leucócitos, hemácias e células epiteliais descamativas também devem
ser descritas e quantificadas.
Procedimento
Deve-se colocar a suspensão formada (secreção + salina estéril) em lâmina com auxílio do swab e
em seguida colocar lamínula.
Observar toda lâmina em microscópio óptico em objetiva de 10X e 40X.
Leitura
Descrever de forma quantitativa a presença de leucócitos, células descamativas, leveduras e
protozoário.
Bacterioscopia
Após realização do esfregaço bacteriológico, as lâminas devem ser coradas pela coloração de Gram.
Observar em microscópio óptico em objetiva de imersão a presença de estruturas leveduriformes
(pseudo-hifas) que se coram de roxo, leucócitos e células epiteliais corados de róseo.
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Cultura
Conforme padronização do setor de microbiologia do LEAC-HGU as secreções vaginais e uretrais
masculinas são semeadas em AS, AC e MC. Microrganismos capazes de crescer nestes meios de
cultura são identificados e avaliados quanto a sua importância clínica.
Vale ressaltar que o isolamento do Trichomonas vaginalis ocorre em meios de cultura específicos,
não sendo realizado no LEAC-HGU de forma rotineira.
Manifestações Clínica
Leucorréia cinza e fétida, prurido e irritação. O eritema e edema são incomuns na região vaginal.
Diagnóstico Laboratorial
Finalidade
Visualizar a presença de bactérias, leucócitos e células epiteliais descamativas.
O procedimento já foi descrito anteriormente.
Leitura
Descrever de forma quantitativa a presença de leucócitos, bactérias e células epiteliais.
Bacterioscopia
Após realização do esfregaço bacteriológico, as lâminas devem ser coradas pela coloração de Gram.
Observar em microscópio óptico em objetiva de imersão a presença de:
Mobilluncus spp.
Cocobacilos Leucócitos
Gram Variáveis Clue Cells
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Cultura
Conforme padronização do setor de microbiologia do LEAC-HGU as secreções vaginais e uretrais
masculinas são semeadas em AS, AC e MC. Microrganismos capazes de crescer nestes meios de
cultura ricos são identificados e avaliados quanto a sua importância clínica.
Vale ressaltar que o isolamento da Gardnerella vaginalis ocorre em meio de cultura seletivo
(Ágar Vaginalis), não sendo realizado no LEAC-HGU de forma rotineira.
Manifestações clínicas
Diagnóstico Laboratorial
Bacterioscopia
Após realização do esfregaço bacteriológico, as lâminas devem ser coradas pela coloração de Gram.
Observar em microscópio óptico em objetiva de imersão a presença de numerosos leucócitos
polimorfonucleados (>10 por campo) e diplococos Gram negativos intracelulares e extracelulares.
Cultura
A secreção uretral deve ser semeada em meio de cultura específico como Thayer-Martin, caso não
seja possível pode ser semeado em ágar chocolate. Incubar em jarra de vela em estufa a 35±2°C por
até 72horas. A identificação da espécie pelo crescimento da colônia ocorre por provas de
metabolismo bioquímico da bactéria.
Manifestações clínicas
Secreção de cor clara ou turva menos espessa que a desencadeada pela gonorréia e disúria.
Diagnóstico Laboratorial
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O antibiograma é uma das principais tarefas executadas pelo setor de bacteriologia clínica, pois tem
como funções avaliar o padrão de resposta da bactéria (padrão de sensibilidade) diante de
concentrações preestabelecidas de antibióticos, orientar a escolha da terapia antimicrobiana mais
adequada, monitorar a evolução da resistência bacteriana e um método auxiliar na implantação de
medidas de controle da disseminação de bactérias multiresistentes.
Todas as etapas envolvidas na realização do TSA, desde a seleção dos antibióticos a serem testados
até a interpretação dos resultados, são padronizadas por organizações especializadas como:
Estas organizações elaboram documentos de consenso, gerados por diversos especialistas que
apresentam recomendações detalhadas sobre a realização e interpretação dos testes de sensibilidade.
A maioria dos laboratórios brasileiros segue as padronizações recomendadas pelo CLSI.
Método Qualitativo
O teste de difusão de discos foi descrito por Kirby e Bauer em 1966 e fornece resultados em
categorias definidas como: sensível, intermediário e resistente. É um dos métodos de sensibilidade
mais simples e confiáveis.
Métodos Quantitativos
Os métodos quantitativos podem ser realizados por várias técnicas, tais como:
# Macrodiluição em tubos
Envolve a preparação de diluições seriadas e logarítmicas (log2) de antimicrobianos em um meio de
cultura líquido, o qual permitirá o crescimento bacteriano.
# Microdiluição em caldo
Utilizam placas plásticas estéreis com vários poços, com fundo em formato de “U”, para permitir
melhor visualização do crescimento bacteriano. Nesta placa, um número variável de
antibacterianos, é colocado em distintas concentrações.
# Etest®
É uma fita plástica fina e inerte (5mm de largura x 60mm de comprimento) disponível
comercialmente, que se baseia na difusão do gradiente antimicrobiano no ágar para determinação da
sensibilidade da amostra bacteriana ao antimicrobiano testado.
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Um lado desta tira é calibrado com uma escala visual indicando a concentração da droga naquele
local. Duas letras no alto da tira indicam o antimicrobiano que está sendo usado, do outro lado desta
fita encontra-se impregnada um gradiente exponencial pré-estabelecido do antimicrobiano.
Ao aplicar a tira no meio de cultura (com a face escrita voltada para cima), imediatamente a droga
começa a se difundir. Deste modo, as tiras não podem ser removidas uma vez aplicadas à superfície
do ágar. Após a incubação, uma elipse simétrica de inibição é formada.
Método de crescimento
O método de crescimento é recomendado para culturas com mais de 24 horas ou de meios seletivos.
→ Procedimento
Com auxílio da alça calibrada pegar colônias puras e isoladas e suspender as mesmas em caldo TSB
ou BHI e incubar em estufa a 35±2°C por 2 a 6 horas. Esta suspensão deve ser comparada com a
escala 0,5 de Mc Farland de turvação através de luminosidade intensa (luminária).
Esta multiplicação pode ser observada por um aumento de bactérias se comparadas com
concentrações de partículas químicas (BaCl2 e H2 SO4), através da passagem de luz. A escala de Mc
Farland está disponível comercialmente ou pode ser realizada manualmente no laboratório de
análises clínicas, conforme descrição abaixo.
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Agitar constantemente.
Medir a densidade da solução preparada em espectrofotometria no comprimento de onda de
652nm.
O resultado da absorbância deve estar entre 0,08 e 0,10.
Distribuir a solução sob agitação, em tubos com tampa de rosa da mesma espessura dos
tubos utilizados para fazer o antibiograma. Vedar ao redor da tampa do tubo para evitar a
evaporação e manter protegido da luz à temperatura ambiente.
Importante
Para verificar a sensibilidade de bactérias exigentes contra diferentes antibióticos deve-se verificar
qual atmosfera de incubação e meios de culturas ideais para o seu crescimento, facilitando a
visualização dos halos formados.
Os antibióticos são substâncias químicas produzidas por microrganismos ou de forma sintética, com
a capacidade de inibir ou matar bactérias. São agrupados em classe, de acordo com sua estrutura
química e mecanismo de ação, conforme descrito abaixo.
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O uso indiscriminado, errôneo ou desnecessário de antibióticos ao longo dos anos, é apontado como
um dos maiores agentes potenciais da aparição de bactérias resistentes aos antibióticos mais
comumente usados, devido à pressão seletiva, ou seja, as bactérias se adaptam e sobrevivem a
mudanças das condições ambientais gerando descendentes mais resistentes aos antimicrobianos.
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No início da era dos antibióticos, o fenômeno da resistência bacteriana não parecia ser um problema
tão grave. Essa resistência era resolvida com introdução de novos agentes bacterianos. Atualmente
bactérias multiresistentes vem aumentando no âmbito hospitalar, diminuindo a sobrevivência dos
pacientes. Deste modo, é de fundamental importância compreender tais mecanismos de resistência
bacteriana para que se possa adotar medidas de controle e prevenção no ambiente hospitalar.
Resistência Adquirida
Mutação Cromossômica
Ocorre durante o processo de replicação das bactérias. Pode ocorrer erros que modificam a
sequência da codificação do DNA e, consequentemente alteração da informação contida no DNA
original, produzindo células com mutação especifica, que será transferida as futuras gerações.
As mutações são consideradas a forma menos frequente da resistência adquirida.
Transdução
A transferência dos genes de resistência é realizada por intermédio de um vírus (bacteriófago).
Transformação
Transferência de genes de resistência da célula doadora para a receptora sem contato entre as
células.
Transposição
Genes determinantes de resistência podem transferir-se de um plasmídeo a outro, para o
cromossomo ou para um bacteriófago. O elemento responsável pela transferência é o transposon.
Inativação Enzimática
Certas bactérias produzem enzimas que neutralizam a droga ou seus efeitos antimicrobianos.
As enzimas podem ser:
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Ϟ Constitutivas
Produzidas independentemente da presença do antibiótico, que quando presente passa e exercer um
efeito seletivo.
Ϟ Induzíveis
Determinados antibióticos, quando em contato com a bactéria, desencadeiam ou estimulam a
produção enzimática que protegerá a bactéria dos efeitos dos antibióticos.
Efluxo de antibióticos.
Ocorre expulsão da molécula pelo transporte ativo.
Exemplo: Estafilococos tetraciclina-resistentes.
Porinas.
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OXACILINA
Algumas cepas de Staphylococcus aureus e os ECN possuem a capacidade de modificar o sítio de
ação deste antibiótico, por meio da produção alterada da proteína ligadora à penicilina (PBP). Esta
PBP é codificada pelo gene cromossomal mecA, fazendo com que a oxacilina e os outros
compostos β-lactâmicos não reconheçam o seu alvo na célula bacteriana. Por esta razão, os
Staphylococcus spp., resistentes à oxacilina são resistentes a todos os β-lactâmicos
independentemente dos resultados in vitro.
Os Staphylococcus aureus resistentes a oxacilina são chamados ORSA.
GLICOPEPTÍDEOS - Vancomicina
Algumas cepas de S. aureus com sensibilidade reduzida à vancomicina (classe dos glicopeptídeos)
apresentam um espessamento da parede celular bacteriana, pois agem inibindo a síntese da parede
(peptideoglicano) através do seu precursor a D-alanil-D-alanina alteradas.
Os S. aureus com sensibilidade intermediária aos glicopeptídeos são chamados GISA.
PENICILINA
Algumas cepas de S. pneumoniae modificam o sítio (alvo) de ligação do antibiótico. Outros
antibióticos como os macrolídeos e sulfametoxazol também apresentam resistência o que faz dessas
drogas uma escolha empírica arriscada.
CEFALOSPORINAS
Os enterococos apresentam uma resistência intrínseca (natural) contra todas as gerações de
Cefalosporinas, bem como a Oxacilina, Clindamicina e Sulfametoxazol+Trimetoprim.
GLICOPEPTÍDEOS – Vancomicina
Algumas cepas de Enterococcus spp. modifica o sítio (alvo) de ligação do antibiótico na parede
bacteriana, impedindo o fármaco de agir contra estas cepas. Os Enterococcus spp., resistentes a
Vancomicina são chamados VRE.
ΒETA-LACTÂMICOS
Os β-lactâmicos representam a classe mais amplamente utilizada de antibacterianos. Esta classe
inclui os grupos das penicilinas, das Cefalosporinas, dos monobactâmicos e dos carbapenens.
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☺Metalo-β-lactamases (MβL)
Dentre os BGNÑF (bacilos Gram negativos não fermentadores) as principais espécies produtoras de
β-lactamases são:
** Acinetobacter baumannii produzem MβL, Carbapenemases.
** Pseudomonas aeruginosa produzem Amp-C e Carbapenemases.
** Stenotrophomonas maltophilia produzem ESBL.
→ Procedimento
Realizar a suspensão bacteriana, em seguida semear em ágar Mueller-Hinton e colocar os discos de
Cefoxitina (CFO) e Oxacilina (OXA) com auxílio de pinça estéril.
Incubar em estufa a 35±2°C por 24horas.
→ Leitura
Para os S. aureus e S. lugdunensis com halo de inibição da CFO ≤ 21 mm predizem resistência à
Oxacilina.
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→ Procedimento
Realizar a suspensão bacteriana, em seguida semear em ágar Mueller-Hinton e colocar a fita E-Test
de vancomicina com a escala numérica do gradiente de concentração para cima em contato com o
ágar. Pressionar com auxílio de uma pinça, levemente ao longo da mesma, para retirar bolhas que
eventualmente se formem. Incubar em estufa a 35±2°C por 24horas.
→ Leitura
Para S. aureus, ECN e Enterococcus spp., com Concentração Inibitória Mínima (CIM) de ≤ 4.0
µg/mL prediz sensibilidade à vancomicina.
Para S. aureus e ECN com CIM de ≥ 4.0µg/mL predizem cepas intermediárias ao glicopeptídeos
vancomicina (GISA) e devem ser rapidamente encaminhadas para laboratórios de referência para
confirmação genotípica.
Enterococcus spp., com CIM de ≥ 4.0µg/mL predizem cepas resistentes à vancomicina (VRE).
OBS: Todos os valores de CIM são seguidos pela padronização da CLSI.
Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. Sarvier: São Paulo. 2004.
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→ Procedimento
Realizar a suspensão bacteriana, em seguida semear em ágar Mueller-Hinton e colocar os discos de
Eritromicina (ERI) e Clindamicina (CL) próximos (03 cm, centro a centro) com auxílio de pinça
estéril e incubar em estufa a 35±2°C por 24horas.
→ Leitura
Se houver achatamento do halo de clindamicina e resistência a eritromicina, indica a presença do
fenótipo MLS ou Teste D positivo.
Se não houver achatamento do halo de Clindamicina, indica ausência do gen causador do fenótipo
MLS ou Teste D negativo.
Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. Sarvier: São Paulo. 2004.
→ Procedimento
Realizar a suspensão bacteriana, em seguida semear em ágar Mueller-Hinton, colocar um disco de
Amoxicilina+Ácido clavulônico situado no centro da placa e distante a 25 ou 30 mm (de centro a
centro) dos outros discos de β-lactâmicos (Ceftazidima, Ceftriaxone, Cefotaxima e Aztreonam)
outras Cefalosporinas de amplo espectro também podem ser usada.
Incubar em estufa a 35±2°C por 24horas.
→ Leitura
Aparecimento de um “halo fantasma” ao redor dos discos dos β-lactâmico indica a presença de uma
cepa bacteriana produtora de ESBL, conforme figura abaixo.
Halos Fantasmas.
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→ Procedimento
Realizar a suspensão bacteriana, em seguida semear em ágar Mueller-Hinton e colocar os discos de
Cefoxitina (CFO) e/ou Ceftazidima ou Cefotaxima próximos (30 mm, centro a centro) com auxílio
de pinça estéril e incubar em estufa a 35±2°C por 24horas.
→ Leitura
Se houver achatamento do halo de inibição de Ceftazidima e/ou Cefotaxima e resistência da
Cefoxitina, indica à presença de uma cepa bacteriana produtora Amp-C, conforme figura abaixo.
Se houver resistência a Cefoxitina, Ceftazidima e Cefotaxima também indica a presença de Amp-C.
→ Procedimento
Realizar a suspensão da cepa E. coli (ATCC 25922) a 0,5 da escala de McFarland, semear a mesma
no ágar Mueller-Hinton com auxílio de swab estéril. Em seguida colocar um disco de imipenem ou
Ertapenem no centro da placa. Com auxílio de uma alça, estriar do centro do disco do β-lactâmico
até a periferia da placa de petri cepas de Klebsiella pneumoniae produtora e não produtoras de
carbapenemase. Incubar em estufa a 35±2°C por 24horas
→ Leitura
Formação de halo de sensibilidade pela ATCC 25922 de E. coli e formação de distorção de halo
pela cepa teste que esta produzindo a enzima carbapenemase, capaz de inativar o imipenem.
Escherichia coli ATCC 25922 K. pneumoniae não produtora carbapenemase.
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ANEXOS
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ESCARRO PURULENTO ou
ESCARRO por INDUÇÃO.
2° Etapa
Líquidos Biológicos
Estéreis.
Outra porção do líquido estéril a ser processado deve ser semeada por
esgotamento nos Meios de Cultura Ágar Sangue (AS), Chocolate (AC) e
MacConkey (MC). Técnica de semeadura qualitativa com alça de 10µL.
Incubar em atmosfera de CO2 (AS e AC) e aerobiose MC e BHI em estufa a 35±2°C por até 72h.
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4º Dia 2° Positivo
Semear em
AS, AC e MC Liberar Hemocultura
Negativo Negativa
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Incubar em atmosfera de CO2 (AS e AC) e aerobiose MC em estufa a 35±2°C por até 72h.
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Incubar em atmosfera de CO2 (AS e AC) e aerobiose MC em estufa a 35±2°C por até 72h.
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Homogeneizar
URINA.
Cocos Gram-positivos
Staphylococcus spp.
Coag. (−)
Coag. (+) Coag. (−) Coag. (−) Coag. (−)
DNAse (−)
DNAse (+) DNAse (+) DNAse (−) DNAse (+)
Manitol (−) Manitol (−)
Manitol (+) Manitol (−) Manitol (+)
Novob. (S) Novob. (S)
Novob. (S) Novob. (S) Novob. (S)
Pol. B (R) Pol B. (S)
Pol. B (R) Pol. B (S) Pol. B (S)
PYR (−) PYR (+)
PYR (–) PYR (−) PYR (+)
Ornit. (−)
S. lugdunensis S. saprophyticus
Isolamento de Cocos
Gram positivos.
Teste de Catalase
Negativo
Teste de CAMP
+: Streptococcus agalactiae
–: Outros estreptococos
PYR +: S. pyogenes
PYR –: S. β-hemolíticos
Catalase (+)
NCG**
(−)
(–)
NCG** PYR
(+)
Motilidade (+)
Pigmento
(–)
(−) (+)
Arabinose e
Sorbitol
E. gallinarum E. casseliflavus
ARA – ARA +
SOR + SOR +
E. faecalis E. faecium
Legenda: **NCG: Não característico ao gênero enterococos. ARA= arabinose, SOR= sorbitol.
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Citrato Negativo
Citrato Positivo
Prova do Citrato
Fenil Negativo
Fenil Positivo
Cloreto Férrico 10%
Prova Fenilalanina
Lisina Positiva
Lisina Negativa
Indol Positivo
Formação de halo róseo após adição
do Reativo de Ehrlich ou Kovacs.
Rugai Inalterado
Formação de Coágulo.
DNAse (+)
Formação de halo róseo
ao redor colônia bacteriana.
Prova do Manitol
Manitol Negativo
Manitol Positivo
Fonte LEAC-HGU2010.
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Fonte: MENEZES e SILVA, C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia para o Laboratório Clínico. 2006. p 236.
Fonte: MENEZES e SILVA, C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia para o Laboratório Clínico. 2006. p 237.
ATM
03 cm 03 cm
CAZ
Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. Sarvier: São Paulo. 2004.
Teste D NEGATIVO.
Teste D POSITIVO.
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