VI JORNADA DE

FORMACIÓN
INTERHOSPITALARIA
DEL LABORATORIO
CLÍNICO
3. TÉCNICAS EN EL LABORATORIO
DE AUTOINMUNIDAD

a PATRICIA MORAIS FERREIRA

a RI. BIOQUÍMICA CLÍNICA
 PRINCIPALES TÉCNICAS DE
INMUNOANÁLISIS
Aglutinación
Inmunoprecipitación en medio líquido
Turbidimetría
Nefelometría
Inmunodifusión doble

Contrainmunoelectroforesis

Inmunofluorescencia

Citometría de flujo

Inmunoanálisis con indicadores marcados

ELISA
Inmunotransferencia
Western blot, Slot blot
 AGLUTINACIÓN

aPrimeras técnicas empleadas en los estudios de

autoinmunidad.
aAntígeno particulado + Acs agregados
macroscópicos con aglutinación.
aSe realiza generalmente en placa, también en tubo.
aSe mezcla la suspensión de células o partículas
con el suero. Se hace oscilar la placa durante unos
minutos y se observa la aglutinación.

aVentajas:
` facilidad de realización
` no equipamiento
aDesventajas:
` baja sensibilidad
` dificultad de cuantificar
 APLICACIONES

aDetección del factor reumatoide isotipo IgM

aglutina partículas recubiertas con IgG humana.
aDeterminación anticuerpos contra el núcleo
(ANA).
aAlgunos anticuerpos específicos de órgano.
aAnticuerpos contra la actina.
aAnticuerpos contra los espermatozoides.
 INMUNOPRECIPITACIÓN

a Antígeno soluble + Anticuerpos

precipitación
ZONA DE EQUIVALENCIA
 INMUNOPRECIPITACIÓN
EN MEDIO LÍQUIDO
TURBIDIMETRÍA
a Mide la disminución de la intensidad de la luz cuando
atraviesa una solución proporcional a la cantidad y
tamaño de las partículas.
NEFELOMETRÍA
a Mide la luz dispersada a diversos ángulos por la
suspensión particulada proporcional a la concentración
de partículas del medio.
INMUNOPRECIPITACIÓN EN
GELES
 INMUNODIFUSIÓN DOBLE

aPatrón de identidad

a Patrón de disparidad

a Patrón de
semiidentidad
 CONTRAINMUNOELECTROFORESIS

aMigración electroforética
aAtg (-) ánodo (+)
aAc (+) cátodo (-)
aMás sensible que la inmunodifusión
aCualitativa

ANODO (+) CATODO (-)

 INMUNOFLUORESCENCIA

a Emplea anticuerpos que llevan unidos compuestos

fluorescentes o fluorocromos.
Excitación Emisión
Isotiocianato de fluoresceína 488nm 530nm
Rodamina B 545nm 585nm
Ficoeritrina 488nm 576nm

¾ directa
¾ indirecta
 INMUNOFLUORESCENCIA
INDIRECTA

a Aparición fluorescencia presencia de

autoanticuerpos
a Patrones de fluorescencia posibilidad de
orientar y caracterizar el autoanticuerpo

Antiinmunoglobulina
Corte de tejido marcada
aVentajas:
` posibilidad de discriminar entre diversos
patrones
` buen método de escrutinio
aDesventajas:
` interpretación subjetiva
` margen de referencia
` baja sensibilidad
` difícil de estandarizar
` no es posible la automatización
 ELISA
aEnzimoinmunoanálisis
` conjugación del anticuerpo con un enzima que produce
una reacción cuyo producto puede ser medido
espectofotométricamente.
aEnzimas:
` peroxidasa de rábano
` fosfatasa alcalina
` B-galactosidasa
` G6PD
 ELISA INDIRECTO

E E
+ +
suero antianticuerpo
marcado

Espectrofotometría
450nm
E E

sustrato
a Evaluación cuantitativa
-curva de saturación de los calibradores :
absorbancia de cada calibrador frente a su
concentración.
-la concentración de autoanticuerpos se
obtiene al leerla en la curva de calibración.
a Evaluación cualitativa
DOCut-off = DOCP* Factor
 INMUNOTRANSFERENCIA

aLa transferencia de proteínas o `blotting´ supone

la inmovilización de las proteínas sobre
membranas sintéticas ya sea mediante
transferencia o mediante aplicación directa.
aDetección reacción antígeno-anticuerpo:
` Métodos radioquímicos emiten radiaciones
ionizantes.
` Enzimas peroxidasa, fosfatasa alcalina
` Reacción de quimioluminiscencia y radiografía
WESTERN BLOT
SLOT BLOT
 CITOMETRÍA DE FLUJO

aTecnología que permite la determinación

simultánea de varios autoanticuerpos en células en
suspensión mediante el empleo de fluorocromos..
aUtiliza conjuntos de microesferas de látex
marcadas internamente con diferentes
proporciones de dos fluorocromos.
 biotina

Atg suero

estreptavidina-ficoeritrina

576 nm
 PARÁMETROS

aDispersión frontal captada por la lente del

detector Forward Scatter (FSC). En posición frontal
respecto a la fuente de luz. Relacionado con el
tamaño de la partícula.
aDispersión lateral captada por el detector Side
Scatter (SSC). Medida relativa de la complejidad
interna de la célula.
aFluorescencia de los dos fluorocromos internos de
las microesferas.
aFluorescencia de los conjugados unidos a las
microesferas (detectores de fluorescencia).
 FL3 FL4
FL2
FL1
complejidad
láser Argón 488nm
side scatter

forward scatter
forward scatter

tamaño