IV Simpósio de Genética

UNESP/IBILCE

RNAi e terapia viral

Doutorando Bruno Moreira Carneiro
Laboratório de Estudos Genômicos
UNESP/IBILCE
 RNAi Terapia Viral
• Histórico
• Vírus da
• Mecanismo de ação
imunodeficiência
• Componentes
– RNAs • Vírus respiratório
– Proteínas sincicial
• Processamento • Vírus da hepatite C
• Aplicações
• Vírus da Febre
• Desenvolvimento Amarela
• dsRNA – > 30 nt

• miRNA – micro RNAs, 21-25 nt

– Codificados por genes endógenos
– Podem reconhecer múltiplos alvos

• siRNA – short interfering RNA, 21-25 nt

– Origem exógena
– Alvo específico
• Antisense RNA – ssRNA homólogo ao mRNA alvo

• Fita guia/passageira: reconhecidas pelo RISC

• 1989: Jorgesen – petúnias
• Chalcone sintase – pigmentação
– Inserção de CHS quimérico

• Efeito contrário: flores claras

• Co-supressão
– Gene endógeno + gene introduzido

• Mecanismo desconhecido!
– “os mecanismos de co-supressão são
desconhecidos … possível envolvimento do
processo de metilação.” (Napoli, 1990)
• 1992: Romano & Macino - Neurospora
crassa
• Inserção de genes al-3 e al-1 –
pigmentação
– 1/3 da linhagem perdeu a cor

• Espontaneamente regressível
• Similar à co-supressão
• Mecanismo também era desconhecido
• Guo & Kemphues, 1995 –
Caenorhabditis elegans
– Par-1: assimetria embrionária

• Antisense RNA Par-1: letal

– Técnica utilizada > 30 anos

• Sense (Controle) RNA Par-1: mesmo

resultado!
• Artefato da pesquisa
– “As bases para o efeito da fita sense
estão sendo investigadas e não serão
discutidas posteriormente...”
RNAi
Fire & Mello, 1999
S e A/S inibem a tradução

ssRNA degradação rápida

dsRNA
• C. elegans: inativação Unc-22
– Fenótipo KO: movimentação espasmódica

• Injeção de ssRNA: S, A/S ou ambos

• dsRNA muito mais efetivo ssRNA
– Efetivo em baixas concentrações

• Inativação devido a degradação do

mRNA alvo
• Cunhou o termo “RNA interference”
(RNAi)
- Contaminação das fitas S ou A/S

- dsRNA é o agente responsável

• Mecanismo conservado em céls. Eucarióticas
– Ausente em procariotos

X
 Preparação

Execução

He and Hannon, 2004

• pri-miRNA -> pre-miRNA
– Overhangs 3’

• Enzima RNAse-III nuclear

• Reconhecimento pri-miRNA?
– Tamanho do loop do hairpin

• Ausente em fungos e plantas

– Dicer?
• Processamento de dsRNA ou pre-miRNA
– overhangs 3’ e grupos fosfato

• RNAseIII citoplasmática
• Domínios funcionais:
– PAZ: ???
– 2x RNAse III

• Vários genes codificam Dicer

– Especificidade funcional?
• Componente RISC
• Expressa também Procariotos
– Sem função determinada

• Atividade de procura de homologia

– Ligação com mRNA
– Seleção da fita guia

• Família de proteínas
– Diferentes funções?
– Afinidades diferentes?
• RNA-Induced Silencing Complex
• Complexo efetor da RNAi
• 3 subunidades
– Dicer
– TRBP: recruta Ago2
– Ago2
• Atividades associadas ao RISC
– Degradação fita passageira
– Endonuclease
– Homologia
• Incorpora preferencialmente uma das
fitas do RNA
– Antisense
• Menor estabilidade 5’ é incorporada ao RISC
– Normalmente antisense

• Se a estabilidade 5’ for similar, ambas as fitas são

incorporadas igualmente
 Degradação Truncamento

100% homologia com Ligação imperfeita entre

mRNA siRNA e miRNA com o
mRNA alvo
Ago é a endonuclease
responsável Preferencialmente 3’

Busca de outras nucleases Mecanismos?

• Identificação de função gênica

• Terapias
– Doenças do Olho
– Infecções virais
– Câncer
– Doenças degenerativas

• Biotecnologia
– Redução de alérgenos em plantas
– Diminuição na produção de toxinas
 Amarzguioui, 2004 Ui, 2004

nt 1 - G/C Fita S - 5' 1nt - G/C

A6
nt 19 - A/U Fita AS - 5' 1nt - A/U

U1 e G19 ( - ) 5/7 nt Fita AS - devem

ser A/U
A/U nos 6 primeiros 3'
Reynolds, 2004
Terapias Virais
• Primeira descrição (Bitko, 2001)
– Inibição das proteínas virais F e P
– Redução na formação de sincício
– Sem resposta IFN (< 22nt)
– Qualquer ponto da infecção
– Dose resposta
• Descrição in vivo (Bitko, 2004/ Zhang, 2004)
– Administração intranasal
– Ausência de agente transfectante
– Saturação da maquinaria RNAi
– Inibição profilática/paliativa
• Próximos passos
– Fase IIa (20-300): dose/resposta
– Fase IIb: início jun/2010
– Fase III (300-3000)
• Liberação FDA!

– Fase IV
• Efeitos adversos longo prazo
• Primeiros trabalhos descritos em 2002
– Demonstraram a inibição do vírus in vitro
– Taxas de inibição altas (Jacque, 2002)
– Inibição do receptor celular CD4 (Novina,
2002)

• In vivo (Kumar, 2008) - eficiente

– Inibição profilática
– Inibição paliativa

• Próximo passo?
Novina, 2002 Jacque, 2002
Vandekerckhove, 2006
• Escape viral
– Alta taxa de mutação
– siRNA para regiões conservadas e proteínas
celulares
X
• Ausência de modelo animal viável
– Símios: alto custo
– Quimeras camundogos/humanos

• Entrega dos siRNAs

– siRNAs ligados a Abs. reconhecedoras de
céls. CD4+
– Vetores virais: NÃO!
• Não se replicam em cultura de células
– Culturas primárias: caras e laboriosas

• Ausência de modelo animal viável

• Alta diversidade genética

– 7 genótipos
– > 100 subtipos
– Quasiespécies
Wakita et al., 2005
• Primeiro trabalho em 2003
(Randall, 2003)
– Replicons subgenômicos
– Redução na expressão de
proteínas

• Outros trabalhos
– Inibição da expressão de todas
as proteínas HCV
– Proteínas celulares
• Poucos laboratórios possuem JFH-1

• JFH-1 x siRNA - ?

• Interação vírus x célula

• Variabilidade genética
– 2 ou mais siRNAs
– Regiões conservadas
– Genes celulares
• In vitro
– Eletroporação
– Lipossomos
– Injeção/Microinjeção
– Nanopartículas
– Vetores virais

• In vivo
– Eletroporação: inviável
– Lipossomos: inespecífica/degradação
– Injeção/Microinjeção: invasivo/caro
– Nano partículas: caro/toxicidade
– Vetores virais: imunicidade ao vetor
• Alterações químicas
– Aumento da meia-vida
plasmática
• Anticorpos
– Específicos
– Difícil ligação Abs. X siRNA
• Lipossomos marcados
– Receptores celulares específicos
– SR-II: hepatócitos
• Uso tópico!
– Mucosas
– HSV-2
• Alguns pontos a serem esclarecidos
– Funcionamento RISC?
– Competição com a via miRNA?
– Silenciamento gênico: riscos?

• Terapia gênica poderosa

– Movimentação estimada para 2010: U$ 1bi
– Inibição eficiente in vitro: virtualmente qualquer gene
– Inibição in vivo: baixa toxicidade e “baixo custo”
– Necessários avanços da tecnologia de entrega
– Efeitos a longo prazo?
 Obrigado
brunocopo@yahoo.com.br