Produksi Isomaltulosa Menggunakan Sel Bakteria Amobil

Oleh :
Robi Binur (21110003)
PS. Bioteknologi-ITB

Pendahuluan
Industri makanan umumnya mencari cara baru untuk meningkatkan kualitas produk atau
memperkenalkan produk baru. Misalnya bahan-bahan yang baru tersebut harus aman, murni, dan
tidak mahal. Bahan-bahan tersebut juga harus bersifat tekstural dan organoleptik, sehingga dapat
diterima konsumen. Sukrosa merupakan bahan makanan yang berharga, diketahui sebagai bahan
pemanis. Namun bila dibandingkan dengan pemanis berintensitas tinggi seperti aspartam dan sakarin,
sukrosa tidak semanis keduanya. Pada sejumlah kasus sukrosa dibutuhkan untuk meningkatkan cita
rasa pembentuk rasa manis, tekstur atau kepadatan suatu produk makanan, contohnya coklat, kue,
dan biskuit. Beberapa disakarida memberikan tingkat rasa manis yang rendah daripada sukrosa, tetapi
sedikit sekali dari bahan-bahan tersebut yang mempunyai tekstur yang sesuai. Isomaltulosa memilki
tingkat rasa manis sepertiga dari sukrosa, tetapi memiliki cita rasa yang sama dengan sukrosa. Ketika
digunakan dalam produk coklat, tekstur yang terbentuk pada coklat akan sama dengan yang diberikan
oleh sukrosa, namun rasa manisnya lebih rendah. Isomaltulosa dibuat dengan kristalisasi dan jalur
metobolismenya sama dengan sukrosa (Cheetham PSJ and Bucke C, 1999).
Isomaltulosa (palatinosa atau lylosa) (α-D-glucopyranosyl-1,6-D-fructose, C12H22O11)
merupakan disakarida komersial yang dibuat secara enzimatik dari sukrosa melalui fermentasi bakteri.
Sintesis kimia dari sukrosa menjadi isomaltulosa tidak mudah, dibutuhkan sejumlah strain bakteri
untuk membantu proses ini. Isomaltulosa pertama kali di produksi oleh sebuah perusahaan gula di
Jerman Selatan, melalui fermentasi menggunakan strain bakteri Serratia plymuthica dan Protaminobacter
rubrum. Sel ditumbuhkan dalam media sukrosa (5%) dan nutrien lainnya hingga tercapai konsentrasi
sel tinggi, setelah 24 jam sel tersebut kemudian digunakan untuk mengubah sukrosa (20% w/w) yang
telah diaerasi dan dijaga pada pH 7.0 sampai semua sukrosa terkonversi (berubah) menjadi
isomaltulosa. Sel-sel tersebut dapat di peroleh kembali menggunakan separator jet dan dapat
digunakan kembali sampai 6 kali, apabila kondisi steril tetap terjaga. Selain itu isomaltulosa juga dapat
dibuat melalui fermentasi kontinyu menggunakan larutan sukrosa (25% w/w) pada pengenceran
0.1/jam yang dapat menghasilkan ~25 g isomaltulosa/L tiap jam (Cheetham PSJ and Bucke C, 1999).

Gambar 1. Struktur kimia Isomaltulose

(palatinose atau lylosa) (α-D-glucopyranosyl-
1,6-D-fructose, C12H22O11)

1
 Di dalam tubuh manusia, palatinosa tidak ditranspor melalui mukosa usus tetapi di hidrolisis
menjadi glukosa dan fruktosa oleh intestinal disaccharase dalam usus kecil, dan monosakarida di
absorbsi. Kecepatan hidrolisis isomaltulosa lebih lambat dari sukrosa. Salah satu keuntungan
isomaltulosa adalah kemampuan memberi energi yang sama dengan sukrosa dan glukosa, dan tidak
menginduksi gejala penyakit diare. Karena alasan ini, pemanis dari isomaltulosa banyak digunakan
dalam makanan bayi, anak-anak, dan penderita diabetes (Matsukubo T and Takazoe I, 2006).
Isomaltulosa pertama kali diketahui berasal dari aktivitas mikroba oleh stodola et al. (1952) dan
Sharpe et al. (1954) dalam Cheetham PSJ (1984) kedua peneliti tersebut menggambarkan
isomaltulosa sebagai produk dari leucrosa (5-0-o-D-glucopyranosyl-D-fructopyranosa) dan bentuk
dextran yang terbentuk karena aktivitas dari mikroba Leuconostoc mesenteroides. Peneliti lain juga
menyebutkan bahwa reduksi disakarida juga dapat dilakukan oleh Streptococcus bovis (Hehre 1951
dalam Cheetham PSJ 1984), dan Saccharomyces bovis (Bailey & Bourne 1959 dalam Cheetham PSJ
1984). Penelitian terbaru dilakukan oleh Fuji et a.l (1983) dalam Cheetham PSJ 1984 yang mengkaji
bentuk ologosakarida dari adanya aktivitas Serratia plymuthica pada sukrosa. Pada penelitian ini Fuji et
al. (1983) menemukan isomaltulosa sebagai produk utama yang dihasilkan dan gula lainnya menjadi 1-
0-a-D-glucosylfructosa, isomaltosa dan isomelezitose (6F-a-D-glucosylsucrose).
Saat ini, isomaltulosa dapat diproduksi menggunakan sel amobil atau immobilized cells. Sel
amobil diketahui memiliki proses yang lebih efektif dengan penggunaan sedikit oksigen atau tidak
menggunakan oksigen sama sekali dan sangat sedikit molekul yang terlibat dalam proses konversi
menggunakan ikatan biokatalisator sel. Produksi isomaltulosa terjadi sangat efisien ketika
menggunakan sel yang tidak tumbuh, dengan demikian produksi sel dan tahap produksi kemungkinan
mengalami optimasi masing-masing, produksi sel optimal dengan fermentasi konvensional dan
menggunakan metode immobilized cells yang tepat. Sel yang mempunyai kepadatan yang tinggi
kemungkinan immobilized dan dapat digunakan dengan konsentrasi substrat yang berlawanaan dengan
pertumbuhan selnya. Kebutuhan energi pada reaktor yang berisi sel amobil memerlukan sedikit
agitasi dan aerasi. Sel amobil memerlukan substrat yang sedikit untuk menjadi material sel (Cheetham
PSJ and Bucke C, 1999).
Strain Bakteri
Sangat sedikit sekali mikroba yang mampu mengkonversi sukrosa menjadi isomaltulosa,
sebagian besar mikroba tersebut merupakan patogen pada tanaman seperti: Protaminobacter rubrum,
Serratia plymuthica, S. marcescens, Erwinia carotovora, dan E. rhapontici.
Metode
Beberapa metode yang digunakan untuk produksi isomaltulosa menggunakan sel amobil, antara
lain:
1. Menggunakan 2.4-dinitrosalicylate.
Metode ini umum digunakan dan paling direkomendasikan untuk produksi isomaltulosa
(Cheetham PSJ and Bucke C, 1999).
Media tumbuh: Terdiri dari 40 g/L sukrosa, 10 g/L pepton dan 4 g/L ekstrak daging sapi.
Sukrosa: butir gula komersial murni (99,95%). Sodium alginat 5% (w/v) dilarutkan dalam air. Buffer
garam phospat. Inkubator orbital dengan kontrol temperatur. Labu takar 500 ml. Sentrifus (15000g).
Penyemprot (syringes) (paling kecil 10 ml). Tabung (misal: tinggi 30 cm, lebar 5 cm). Pompa
peristaltik dan oven vacum.

2
 Produksi sel: Terdiri dari 40 g/L sukrosa, 10 g/L pepton, 4 g/L ekstrak daging sapi. Encerkan sel
dari kultur stok dengan 10 mL bufer garam phospat. Inokulasikan 200mL aliquaot media tumbuh
dalam labu takar 500mL dengan 0.1 mL aliquot dari suspensi sel. Inkubasi inokulat tersebt pada 30º C
selama 70 jam dalam inkubator orbital (120 osilasi/menit). Sel-sel yang dihasilkan kemudian di
sentrifugasi pada kecepatan 15000g (10 menit) dalam suhu 30º C. kira-kira akan diperoleh sekitar 1
gr sel basah/100 mL.
Imobilisasi sel: Larutan sodium alginat 5% (w/v) dalam air destilata. Suspensikan sel yang
diperoleh, hingga mencapai 20% (berat basah w/v) dalam larutan sodium alginat. Suspensi sel ditekan
turun dari ketinggian 10 cm didalam larutan kalium klorida (0.1 M) yang terdiri dari 15% (w/v)
sukrosa (dalam suhu 30º C). Campur/aduk pelet yang dihasilkan selama 1 jam. Simpan pelet dalam
tabung kalom (jacketed colomn) (misal: tinggi 30 cm, diameter 5 cm) (pada suhu 30º C).
Produksi isomaltulosa: Larutan sukrosa 55% (w/v) dalam air destilata, pH diatur hingga 7.0
menggunakan 1.0 M larutan sodium hidroksida. Pompa larutan sukrosa ke atas kolom, temperatur
dijaga pada suhu 30º C pada kisaran aliran volume kolom 0.01 volume/jam. Dalam kisaran aliran ini
konversi sukrosa menjadi isomaltulosa dapat dicapai dalam waktu 24 jam. Produktivitas sel yang
terbentuk kira-kira 0.2 g produk/g sel basah/jam. Evaporasi kolom pada 60ºC sampai mencapai
sekitar 70% (w/v). Dinginkan dengan menggunakan stiring. Setelah didinginkan akan diperoleh bentuk
kecil kristal putih isomaltulosa. Kristal-kristal tersebut dikumpulkan melalui filtrasi atau sentrifugasi.
Keringkan pada suhu 40ºC dalam oven vakum (700 mmHg) produk yang dihasilkan kira-kira sekitar
95% isomaltulosa (yang dikritalisasi dengan satu air kristalisasi per molekul isomaltulosa). Kristalisasi
kembali sebanyak 3 kali dari air untuk memperoleh produk yang murni. Selanjutnya kristal-kristal
yang diperoleh dikeringkan.
2. Menggunakan Chitosan
Metode ini digunakan pada produksi isomaltulosa dari Serratia plymuthica (Krastanov A dan
Yoshida T, 2003).
Media tumbuh: Terdiri dari sukrosa 5%, ekstrak beef 0,3%, bacto pepton 1%, ekstrak yeast
0,5%, NaCl 0,3%, dan Na2HPO4 0,2%. Ketika inokulum tumbuh mencapai fase mid-log phase
(OD600=0.5–1.0), inokulum ditransfer kedalam tabung erlemeyer (500 ml) berisi 100 ml medium.
Kultur diaduk pada suhu 28ºC dan pH 6,8. Sel dihilangkan dari medium dengan sentrifugasi pada
7.000g selama 20 menit.
Preparasi larutan chitosan: Larutan chitosan asetat 2% dengan viskositas 50-150 cP diperoleh
dengan mencampur 2 g chitosan dengan 75 ml H2O dan 5% asam asetat kemudian diaduk dan
dipanaskan (80ºC). Untuk mendapatkan larutan yang steril, chitosan diendapkan dalam air dan
diautoclave.
Immobilisasi sel: Sebanyak 3,5 g sel basah diendapkan pada 6,5 ml larutan NaCl 0,9% (pH 5
biasanya dengan asam asetat) dan dicampur dengan 20 ml larutan chitosan asetat. Suspensi ini
kemudian ditambah sedikit demi sedikit sampai 500 ml larutan polyphosphate 2% (pH 8.2). Setelah 3-
4 jam kemudian disimpan satu malam pada larutan NaCl 0,9% pada suhu 4ºC.
Aktivitas enzim sukrosa isomerase: Preparasi aktivitas enzim diukur dengan menginkubasi 1 gr
sel immobil dengan 10 ml larutan sukrosa 40% pada 50mM penyangga Na-phospat (pH 6.0) pada
suhu 37ºC dengan agitasi dalam erlenmeyer 50mL. reduksi gula (seperti palatinosa) menggunakan
metode Somogyi-Nelson (pada 660 nm) dan HPLC (high performance liquid chromatography).
Konversi sukrosa menjadi palatinosa merupakan aktivitas utama enzimdalam sel; sehingga unit

3
aktivitas internasional (U) di gambarkan sebagai sejumlah enzim yang dapat melepaskan 1lmol
isomaltulosa per menit pada tahap awal dibawah kondisi uji standar dan ini terhitung sebagai U/g.
Analisis gula: untuk membedakan kualitas dan kuantitas gula, dilakukan dengan analisis TLC
(thin layer chromatography) dan HPLC. Analisis TLC dilakukan pada plate (kaca) silika menggunakan
isopropanol etil-asetat (7:12 v/v) pada suhu ruang. Plate selanjutnya di staining (dibersihkan)
menggunakan reagen carbazole-sulfr (metode Adachi). Analisis HPLC dilakukan pada kolom
ULTRON PS-80C, pompa 880-PUI (Jusco, Chiba, Jepang), detektor 830RI inteligent (Jusco) dan oven
kolom CTO-6A. fase air (mobile phase) dan kisaran pergerakan 0.3 ml/menit pada 80ºC.
Konversi sukrosa menjadi palatinosa: Melalui imobilisasi sel. Proses terjadi dalam 200mL enzim
dengan temperatur dan pengadukan yang terkontrol. Setelah penyesuian suhu yang tepat pada
larutan sukrosa, sejumlah sel imobilisasi ditambahkan, dan proses dibiarkan terjadi hinnga konversi
tidak terjadi lagi.
3. Menggunakan Calcium-Alginate
Metode ini digunakan pada produksi isomaltulosa dari Erwinia sp. (Kawaguti HY and Sato HH,
2006).
Media tumbuh: Menggunakan agar miring dengan komposisi (w/v) 6% sucrose, 4.0% peptone,
0.4% ekstrak beef dan 2.0% agar, kemudian disimpan pada suhu 5ºC.
Inokulum dan kondisi fermentasi: Inokulum ditransfer ke dalam 100 ml medium cair ke dalam
tabung erlenmeyer 250 ml. tabung di sentrifugasi pada 200rpm selama 15 jam pada 30ºC. Aliquot
inokulum (300 ml) dimasukkan ke dalam fermenter yang sudah disterilisasi yang dapat menampung
sebanyak 2.700 ml medium kultur. Fermentasi dilakukan pada tingkat suhu 24, 26 dan 28ºC dengan
aerasi 1 vvm dan kecepatan pengadukan 200rpm. Aliquot kultur medium (20 ml) dikumpulkan setelah
perbedaan waktu inkubasi. Pertumbuhan sel, perubahan pH medium kultur dan aktivitas
glucosyltransferase selanjutnya ditentukan.
Pertumbuhan mikroorganisme: Aliquot broth kultur (20 ml) disentrifugasi pada 12.300 g
selama 15 menit pada suhu 5ºC. Massa sel dicuci dua kali dengan penyaringan air 20 ml dan
pengendapan pada 20 ml air saringan. Pertumbuhan sel dipantau ukuran optikal densitasnya 660 nm
(OD600) dengan Beckman DU 70 spectrophotometer.
Aktivitas glucosyltransferase: Campuran 450 μl larutan sukrosa 4.0% (w/v) pada 0,05 M
penyangga citrate-phosphate buffer, pH 6.0 dan 50 μl larutan enzim kemudian diinkubasi selama 20
menit pada suhu 35ºC. Satu unit aktivitas (U) glucosyltransferase didefinisikan sebagai jumlah enzim
yang dilepaskan sebanyak 1 μmol permenit/ml enzim isomaltulose dari sukrosa dibawah kondisi
pengujuan standar.
Immobilisasi pada Ca-alginate: Pertumbuhan sel dalam 51 bioreaktor dikumpulkan dengan cara
sentrifugasi pada 10.070 g selama 15 menit pada suhu 5ºC dan dicuci dengan menyaring air sebanyak
dua kali. Suspensi sel 40% (sel basa w/v) dicampur sempurna dengan 2% (w/v) larutan sodium alginate
solution (kecepatan 1:2) dibawah kondisi aseptik. Campuran dihentikan dengan menekan sedikit demi
sedikit ke dalam 2% larutan CaCl2 menggunakan pompa peristaltic MasterFlex L/S multicanal. Butiran-
butiran yang berisi immobilized cells dijaga kualitasnya pada 1.0% (w/v) lrutan glutaraldehyde dan 1.5%
(w/v) larutan polyethyleneimine dan disaring dan dicuci dengan menyaring air. Butiran-butiran yang
berisi immobilized cells disimpan dalam dua reaktor kolom. Larutan sukrosa 35% (w/v) dikirim melalui
kolom, kumpulan dan jumlah isomaltulose ditentukan menggunakan high performance liquid
chromatography.

4
4. Menggunakan Modifikasi Fructose-Binding Site
Metode ini digunakan pada produksi isomaltulosa dari Protaminobacter rubrum (Lee HC et al.
2008).
Bahan: Restriksi endonuklease Sac1 dan HindIII. DNA ligaseT4, calf intestinal alkalin-
phospatase (dari Takara, Jepang), dan DNA polymerase Pfu. Vektor ekspresi pQE80L dan vektor
cloning pSTBlue-1. Elektroforesis agarosa, plasmid dan produk PCR dipurifikasi menggunakan minikit
(Qiagen). Escherichia coli BL21 (DE3) (pLysS) yang akan digunakan untuk ekspresi protein, dan E. coli
XL1-Blue yang akan digunakan selama proses cloning. P. rubrum CBS 547.77, gula standar (sukrosa,
glukosa, fruktosa, dan isomaltosa) untuk HPLC.
Ekspresi dari mutasi gen SI pada E.coli: (i) Cloning smuA kedalam vektor ekspresi pQE80L: Primer
PCR didesign berdasarkan urutan sekuen P. rubrum CBS 547.77 SI (GenBank Acc no: CQ765963),
primer PCR didesign untuk sub-kloning gen S1 (tanpa daerah koding dan sekuen sinyal) kedalam
vektor ekspresi pQE80L. Produk PCR di klon ke dalam pSTBlue::PrSI). Vektor ekspresi pQE::PrSI
dibuat dengan menggabungkan pQE80L dan P.rubrum klon gen S1 (smuA) dari pSTBlue::PrSI. (ii) Situs
mutagenesis smuA: Situs mutagenesis smuA ditentukan menggunakan kit mutagenesis QuikChange
(Stratagene) dengan pQE::PrS1 sebagai cetakan. PCR produk ditambahkan 1 U DPnI, selanjutnya
plasmid DNA dengan mutasi terpilih ditransformasikan kedalam sel E. coli BL21 (DE3) (pLysS)
kompeten. Sekuen mutasi SIs dikonfirmasi menggunakan sekuensing DNA. (iii) Ekspresi SmuA pada E.
coli: Lima buah kultur untuk tiap konstruksi disiapkan dalam media LB (5ml) dengan 50 g ml
kanamycin. Sel-sel ditumbuhkan pada suhu 37ºC dengan pengadukan (shaking) pada kecepatan 250
rpm. Tiga kultur untuk tiap konstruksi (OD 600nm dari rata-rata 1.0) dipilih untuk induksi.
Selanjutnya ditambahkan IPTG (isopropyl-D-thiogalactopyranoside) hingga mencapai konsentrasi
akhir 0.5 mM (inkubasi 3 jam, pada suhu 30ºC). setelah inkubasi, volume kultur yang sesuai digunakan
untuk kuantifikasi protein, SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis), dan
kuantifikasi efisiensi dari konversi sukrosa menjadi isomaltulosa, trehalulosa, dan isomaltosa. Untuk
purifikasi protein SI, volume kultur di tingkatkan sampai 250 ml.
Ekstraksi dan purifikasi enzim: Sel-sel yang telah disentrifugasi (3000 g; 4ºC; 10 menit) dan
dicuci dengan 50 mM Tris (pH 8.0)/ 2mM EDTA sebanyak 3 kali, pellet sel disuspensikan kembali
dalam buffer ekstrakso (20 mM Tris [pH 7.4], 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM azide, 10 mM
mercaptoetanol), selanjutnya dilisis menggunakan sonikasi (30-s pulses at 50 W with a Sonoplus
sonifier). Penanda N-terminal 6-His dimasukkan kedalam Vektor pQE80L, selanjutnya protein
dipurifikasi melalui absobsi nickel-nitrilotriacetic acid agarose (Qiagen) dan dengan elusi 25 mM
NaH2PO4, 150 mM NaCl, 125 mM buffer imidazole (pH 8.0). Kemurnian protein S1 dientukan
dengan SDS-PAGE. Konsentrasi protein ditentukan dengan metode bicinchoninic acid menggunakan
serum bovine albumin (sigma) sebagai standar. Reduksi gula ditentukan dengan metode
dinitrosalicylic menggunakan isomaltulosa (Sigma) sebagai standar.
Menentukan aktivitas SI: (i) Pengujian aktivitas enzim SI: aktivitas utama SI adalah konversi
sukrasa menjadi isomaltulosa. Aktivitas enzim diukur dengan inkubasi 200l dari 25 g ml enzim yang
telah dipurifikasi dengan 50l dari 20mM buffer kalsium asetat (pH 5.5) yang terdiri 5% 9wt/vol)
sukrosa pada suhu 25ºC (5 menit). (ii) Konversi sukrosa total: konversi sukrosa dapat diketahui dalam
tabung ependorf yang berisi 250 l dari 20% (wt/vol) larutan sukrosa dan 5 g enzim pada suhu 25ºC
dalam shaking water bath sampai sukrosa tidak dapat terkonversi menjadi bentuk produk lainnya
(sekitar 12 jam). (iii) Efek aktivitas SI pada kehadiran dan ketiadaan penambahan glukosa: aktivitas SI
untuk konversi sukrosa diukur dengan inkubasi enzim yang telah dipurifikasi dalam 20% (wt/vol)

5
larutan sukrosa dengan konsentrasi glukosa yang berbeda (2.5, 5, 10, 15, 20, 25 dan 30% [wt/vol]) di
bawah kondisi uji standar.
Referensi
Cheetham PSJ and Bucke C. 1999. Production of Isomaltulose Using Immobilized Bacterial Cells in
Carbohydrate Biotechnology Protocols Edited by Christopher Bucke. Humana Press
Totowa, New Jersey
Cheetham PSJ. 1984. The Extraction and Mechanism of A Novel Isomaltulose-Synthesizing Enzyme
from Erwinia rhapontici. Biochem. J. 220, 213-220
Kawaguti HY and Sato HH. 2006. Immobilization Of Erwinia sp. Cells In Calcium-Alginate And
Production Of Isomaltulose Using A Packed-Bed Reactor. Faculdade de Engenharia de
Alimentos-Universidade Estadual de Campinas, Sao Paulo, Brasil
Krastanov A and Yoshida T. 2003. Production Of Palatinose Using Serratia plymuthica Cells
Immobilized In Chitosan. J Ind Microbiol Biotechnol 30: 593–598
Lee HC, Kim JH, Kim SY, and Lee JK. 2008. Isomaltose Production by Modification of the Fructose-
Binding Site on the Basis of the Predicted Structure of Sucrose Isomerase from
Protaminobacter rubrum. Applied And Environmental Microbiology, 5183–5194
Matsukubo T and Takazoe I. 2006. Sucrosa Subtitutes And Their Role In Carries Prevention.
International Dental Journal, 119-130