Tugas Enzimologi

ENZIM LIPASE DARI MIKROBA

Oleh

SUMARLIN

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HALUOLEO
KENDARI
2010
 BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang

Enzim adalah golongan protein yang disintesis oleh sel hidup dan
mempunyai fungsi penting sebagai katalisator dalam setiap reaksi metabolisme
yang terjadi pada organisasi hidup. Enzim juga merupakan biokatalisator yang
menunjang berbagai proses industri. Hal ini disebabkan enzim mempunyai
efisiensi dan efektifitas yang tinggi, reaksinya tidak menimbulkan produk
samping, serta dapat digunakan berulangkali dengan teknik amobilisasi
(Lehninger, 1995).
Untuk memproduksi enzim dalam jumlah besar dan mempunyai
aktivitas yang tinggi, perlu diperhatikan faktor-faktor penting seperti kondisi
pertumbuhan, cara isolasi, serta jenis substrat yang digunakan. Kondisi
pertumbuhan yang menunjang produksi enzim secara maksimal adalah pH,
suhu inkubasi, waktu inkubasi, dan komposisi media pertumbuhan harus
mengandung sumber energi, sumber karbon, sumber nitrogen dan mineral
(Wang, 1979).
Pengunaan enzim dalam bioteknologi modern semakin berkembang
secara cepat. Banyak industri-industri yang telah memanfaatkan kerja enzim,
meliputi industri pangan dan non pangan.
Salah satu jenis enzim yang mempunyai peran penting dan tidak ada
bandingan dalam pertumbuhan bioteknologi adalah enzim lipase. Enzim ini
memiliki sifat khusus dapat memecahkan ikatan ester pada lemak dan gliserol.
Selain itu, lipase mempunyai kemampuan mengkatalis reaksi organik baik
didalam media berair maupun dalam media non air (Sumarsih, 2004). Enzim
lipase sangat berperan dalam pemisahan asam lemak dan pelarutan noda
minyak pada alat industri agar minyak dapat dilarutkan dalam air. Beberapa
reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase diantaranya adalah reaksi hidrolisis,
alkoholisis, esterifikasi,dan interesterifikasi (Dosanjh dan Kaur, 2002).
Disamping dari tanaman dan hewan, dewasa ini lipase mulai diproduksi
dari berbagai mikroorganisme. Keuntungan memproduksi enzim dari
mikroorganisme menurut Suhartono (1989) adalah produksi enzim dapat
ditingkatkan dalam skala besar dalam ruangan yang relatif terbatas. Bakteri
merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat menghasilkan enzim lipase,
karena bakteri memiliki kemampuan hidup di berbagai lingkungan yang
 terdapat kandungan makanan atau nutrisi yang kompleks. Oleh sebab itu pada
makalah ini kami akan mengkaji enzim lipase dari mikroorganisme.
B. Rumusan Masalah
Adapun permasalahan dari makalah ini yaitu:
1. Jenis mikroorganisme apakah yang mampu menghasilkan enzim lipase?
2. Bagaimanakah cara memproduksi enzim lipase dari mikroba?
3. Bagaimanakah cara pemurnian enzim lipase?
4. Bagaimana cara mengkarakterisasi enzim lipase?
5. Bagaimanakah cara menguji aktivitas enzim lpase?
C. Tujuan
Tujuan yang ingin dicapai dari pembuatan makalah ini yaitu:
1. Mengetahui jenis mikroba penghasil enzim lipase.
2. Mengetahui cara memproduksi enzim lipase dari mikroba.
3. Mengetahui cara pemurnian enzim lipase.
4. Mengetahui cara mengkarakterisasi enzim lipase.
5. Mengetahui cara menguji aktivitas enzim lpase.
D. Manfaat
Manfaat yang dapat diperoleh dari makalah ini ialah kita dapat mengetahui
jenis mikroba penghasil enzim lipase, cara memproduksi enzim lipase dari
mikroba, cara mengkarakterisasi enzim lipase, dan mengetahui cara menguji
aktivitas enzim lpase.
 BAB II
KAJIAN PUSTAKA

Dewasa ini, enzim adalah senyawa yang umum digunakan dalam proses
produksi. Enzim yang digunakan pada umumnya berasal dari enzim yang diisolasi dari
bakteri. Penggunaan enzim dalam proses produksi dapat meningkatkan efisiensi yang
kemudian akan meningkatkan jumlah produksi.
Lipase (triacylglycerol hydrolase, E.C. 3.1.1.3) merupakan enzim yang penting
pada industri lemak dan minyak, yaitu untuk mengubah bentuk fisik dan kimia minyak
dan lemak alami menjadi produk yang bernilai tambah lebih tinggi (Elisabeth dan
Siahaan, 2000, Ronne, T.H., et.al., 2005, Wang, et.al., 2006, Liu, et.al., 2007) sebagai
contoh yang telah berhasil dengan baik yaitu modifikasi minyak dari tumbuhan
menjadi lemak kakao subtitusi yaitu minyak sawit dengan stearin kelapa sawit,
ataupun dengan mengganti sebagian dengan lemak sapi, minyak bunga matahari yang
dilakukan secara interesterifikasi enzimatis (Macrae, 1983; Forssell, et.al., 1992;
Bloomer, et.al., 1990; Khumalo, et.al., 2002).
Pemanfaatan enzim lipase di dalam industri pangan maupun non pangan
semakin meningkat. Pada industri pangan, lipase banyak digunakan dalam industri
susu (hidrolisis lemak susu), industri roti dan kue (meningkatkan aroma dan
memperpanjang umur simpan), industri bir (meningkatkan aroma dan mempercepat
fermentasi), industri bumbu (meningkatkan kualitas/tekstur), serta pengolahan daging
dan ikan (meningkatkan aroma dan mengubah lemak). Sedangkan pada industri non
pangan, lipase digunakan pada industri kimia dan obat-obatan (transesterifikasi
minyak alami), industri oleokimia (hidrolisis lemak/minyak), industri detergen
(melarutkan spot minyak/lemak), industri obat-obatan (mempermudah daya cerna
minyak/lemak dalam pangan), kedokteran (analisis trigliserida dalam darah), industri
kosmetik (mengubah lemak), dan industri kulit (mengubah lemak dalam jaringan
lemak). Pemanfaatan lipase pada industri lemak dan minyak untuk mengubah bentuk
fisik dan kimia minyak dan lemak alami menjadi produk yang bernilai tambah lebih
tinggi (Khumalo, et.al., 2002).
Lipase diklasifikasikan sebagai enzim hidrolase yang menghidrolisis trigliserida
menjadi asam lemak bebas, gliserida parsial (monogliserida), digliserida dan gliserida
(Macrae, 1983). Aplikasi lipase untuk hidrolisis, interesterifikasi dan esterifikasi telah
menjadi objek penelitian, dengan perhatian utama pada aplikasi minyak dan lemak.
Lipase dapat digunakan dengan baik sebagai biokatalis dalam proses biologis (Dosanjh
and Kaur, 2002).
Lipid terstruktur adalah triasil gliserol yang mengandung campuran asam lemak
berantai pendek, medium, atau keduanya dan berantai panjang yang sebaiknya dalam
molekul gliserol yang sama supaya menunjukkan potensi maksimalnya (Akoh, 1988).
Lipid terstruktur berdasarkan lokasi asam lemak dibedakan menjadi lipid terstruktur
spesifik (LSS) dan lipid terstruktur non-spesifik (LS). LS adalah minyak dan lemak
termodifikasi atau sintetik mengandung asam lemak berantai panjang dan medium
atau pendek. LSS adalah minyak dan lemak termodifikasi atau sintetik mengandung
asam lemak berantai panjang dan medium atau pendek, dimana masing-masing
kelompok menempati secara spesifik pada posisi sn-2 atau sn-1,3 dari kerangka
gliserol. LS dapat diproduksi dengan interesterifikasi kimia (randominisasi) atau
enzimatik. Namun LSS hanya dapat diproduksi melalui interesterifikasi enzimatik
menggunakan enzim lipase regiospesifik (Xu, 2000). Pada akhir-akhir ini produk baru
berupa LSS memperoleh perhatian dunia di bidang teknologi pangan dan gizi. Bahkan
sintesis LSS dapat melalui ester asam lemak misalnya metil atau etil ester asam lemak
yang dapat digunakan pula untuk biodiesel atau bahan baku industri oleokimia.
 BAB III
PEMBAHASAN

A. Lipase
Enzim lipase atau asilgliserol hidrolase (E.C 3.1.1.3) merupakan enzim yang
dapat menghidrolisis rantai panjang trigliserida. Keterangan dari kode enzim ini
adalah :
3 Hydrolases
1 Acting on ester bonds
1 Carboxylic-ester hydrolases
3 triacylglycerol lipase
Enzim ini memiliki potensi untuk digunakan memproduksi asam lemak, yang
merupakan prekursor berbagai industri kimia. Lipase diklasifikasikan sebagai enzim
hidrolase yang menghidrolisis trigliserida menjadi asam lemak bebas, gliserida parsial
(monogliserida), digliserida dan gliserida seperti pada gambar berikut.

Produksi asam lemak secara industri menggunakan katalis kimia menghasilkan

efek samping bagi lingkungan. Selain itu enzim lipase telah banyak dikenal memiliki
cakupan aplikasi yang amat luas dalam bidang bioteknologi, seperti biomedikal,
pestisida, pengolahan limbah, industri makanan, biosensor, detergen, untuk industri
kulit dan industri oleokimia (memproduksi asam lemak dan turunannya).
Lipase sebagai katalis untuk reaksi esterifikasi dapat diperoleh dari species
mikrobia ataupun tanaman. Nelson dkk. (1996) melakukan ”screening” lipase dari
banyak spesies mikroba dalam kemampuannya melakukan transesterifikasi
trigleserida dengan alkohol rantai pendek menjadi alkil ester. Lipase Mucor miehei
ternyata paling efisien mengubah trigliserida menjadi alkil ester dengan alkohol
primer, sedangkan lipase dari Candida antartica paling efisien untuk transesterifikasi
trigliserida dengan alkohol sekunder menghasilkan alkohol ester bercabang. Lipase ini
juga terbukti efektif untuk transesterifikasi minyak nabati dan bahan baku lain yang
mengandung asam lemak tinggi menjadi derivat alkil ester.
B. Sisi aktif enzim lipase
Lipase juga disebut dengan serin hidrolase yang bekerja pada urutan G-X 1-S-X2-G,
dimana G-glycine, S-serine, X1-histidin dan X2-asam glutamat atau aspartat. Fungsi
biologis dari lipase adalah mengkatalisis proses hidrolisis dari triacylglycerols menjadi
asam lemak bebas. Gambar beikut dapat dilihat struktur 3 dimensi dari enzim lipase.

Dari gambar diatas dapat dilihat komponen sisi aktiv dari enzim lipase yang
teridiri dari Serin-77, Aspartat-133 dan Histidin-156. Berikut adalah struktur dari asam
amino serin, aspartat dan histidin.
O O
O H H
H H3N C H3N C
H3N C C O C O
C O
CH2 CH2
CH2 Histidin
C
O OH N
OH
Serin As. aspartat HN

Interaksi residu Asp atau Glu bermuatan negatif memungkinkan residu tersebut
untuk bertindak sebagai basis umum yang dapat menangkap sebuah proton dari gugus
hidroksil situs aktif Serin. Sehingga dihasilkan ion alkoksida yang nukleofilik terhadap
residu Serin untuk menyerang gugus karbonil substrat ester membentuk perantara
asil-enzim. Komponen penting lainnya untuk mekanisme katalitik adalah oxyanion-hole
yang terdiri dari donor ikatan H (kebanyakan ikatan kelompok N-H). Lubang oxyanion
membantu untuk menstabilkan reaksi antara selama katalisis ketika oksigen karbonil
membawa muatan parsial negatif.
Proses aktivasi serin oleh histidin dan asp/glu lipase dapat digambarkan seperti
dibawah ini.
H2 Ser
Ser inactive C +
H Active
His
CH2
CH2
H N
NH O H2
O C
His
H
Ser H N
Active NH
CH2

O H2
C
His

H N
NH
H+

H2
Ser inactive C
His
CH2
N
NH
O

C. Mekanisme Hidrolisis Triasilgliserol

Secara umum proses pemutusan ikatan ester oleh lipase dapat digambarkan
seperti berikut ini.

Dari gambar di atas maka dapat kami tuliskan mekanisme reaksi dari hidrolisis
triasilgliserol secara umum seperti berikut ini.
 Ser Active
CH2
H2
O C
R His
C
O
H2C
O N
R H NH
CH
O
C
H2C
O
O
R
C

O
H2
C
His

H2C CH CH2 N NH
H
O
O O
O C
C C Ser
O O
R O R
R

Ser O R
H2C CH CH2
O
O OH O H
O C
C H
R O R
N

CH2
N
H
His
 O O

Ser Ser O R
O R
HO

O H

H
H

N N

CH2 CH2
N N
H H
His His

H2
C O
Ser
H
O
N
+ R OH
CH2
N As. lemak
H
His
Lipase

D. Mikroorganisme penghasil enzim lipase

Kelompok yeast yang dapat manghasilkan lipase adalah dari Candida rugosa dan
dari kelompok jamur adalah Aspergillus niger dan Penicillium aurantiogriseum. Adapun
pada kelompok bakteri, lipase yang dihasilkan adalah dari genera Bacillus, Aeromonas,
Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Chromobacterium, Serratia, Vibrio, Aeromonas,
dan Staphyloccus.
Di antara sumber lipase baik berasal dari tumbuhan, hewan dan mikroba,
ternyata lipase mikroba yang paling banyak digunakan. Hal ini disebabkan karena
mikroba dapat dengan mudah dibudidayakan dan lipase dapat mengkatalis berbagai
reaksi hidrolisis dan sintetis. Lipase digunakan dalam berbagai bidang bioteknologi,
seperti pengolahan makanan dan susu (keju pematangan, pengembangan rasa, EMC
teknologi), deterjen, farmasi (naproxen, ibuprofen), agrokimia (insektisida, pestisida)
dan oleokimia (hidrolisis lemak dan minyak, sintesis biosurfaktan ) industri. Lipase
dapat lebih dimanfaatkan di daerah baru di mana mereka dapat berfungsi sebagai
biocatalysts potensial.
Lipase yang dihasilkan bakteri dipengaruhi oleh beberapa faktor, salah satunya
adalah lama waktu inkubasi. Lama waktu inkubasi mempengaruhi jumlah lipase yang
dihasilkan. Kemampuan bakteri dalam menghasilkan lipase telah ditemukan dengan
lama waktu inkubasi dari beberapa jam sampai beberapa hari. Pabai et al (1996) dan
Dong et al (1999) melaporkan bahwa Pseudomonas spp., P. fragi, dan P. fluorescens BW
96CC mampu menghasilkan lipase hingga mencapai maksimum setelah inkubasi antara
72 dan 96 jam. Menurut Mahadik et al (2002), aktivitas lipase Aspergillus niger
maksimum pada waktu inkubasi 5 hari. Lima et al. (2005) melaporkan bahwa jamur
Penicillium aurantiogriseum menghasilkan lipase setelah inkubasi 48 dan 72 jam.
1. Lipase Bakteri
Sejumlah relatif lebih kecil dari lipase bakteri telah diteliti dengan baik
dibandingkan dengan tanaman dan jamur lipase. Lipase bakteri adalah glikoprotein,
tetapi beberapa lipase bakteri ekstraseluler adalah lipoprotein. Winkler et al
melaporkan bahwa produksi enzim pada sebagian besar bakteri dipengaruhi oleh
polisakarida tertentu. Sebagian besar lipase bakteri dilaporkan sejauh ini konstitutif
dan tidak spesifik dalam spesifisitas substrat dan lipase bakteri sedikit thermostabil.
Di antara bakteri Achromobacter sp., Alcaligenes sp., Arthrobacter sp.,
Pseudomonas sp, Staphylococcus sp dan Chromobacterium sp, telah dimanfaatkan dalam
produksi enzim lipase. Stafilokokus menghasilkan lipoprotein lipase di alam. Lipase
dimurnikan dari S. aureus dan S. hyicus menunjukkan berat molekul berkisar antara 34-
46 kDa. Mereka dirangsang oleh Ca2+ dan dihambat oleh EDTA. pH optimum bervariasi
antara 7,5 dan 9,0. gen lipase dari S. hyicus dan S. aureus telah diklon, diurutkan, dan
dibandingkan dengan lipase lainnya. Ke-duanya menunjukkan adanya domain terpisah
oleh 100 jenis residu asam amino yang mungkin untuk membentuk sisi aktif. Residu
situs putatif aktif terdapat pada His 269 dan Ser 369, pada lipase S. hyicus sangat
dilestarikan dalam dua lipase S. aureus dan dalam lipase beberapa eukariot.
Lipase dari spesies yang berbeda dari Psuedonomas telah dimurnikan dengan
pengasaman dari supernatan kultur, pengendapan amonium sulfat, kromatografi
kolom, dan fokus isoelektrik menggunakan CHAPS. Lipase yang dimurnikan dari P.
fragi, P. fluorescens, dan P. aeruginosa monomer dengan berat molekul 33 kDa, 45 kDa,
dan 29 kDa. Lipase ini dihambat oleh Zn ++, Fe++, dan Al+++ dan activator oleh Ca++. Gen
lipase dari P. fragi telah dikloning dan sequenced.
2. Lipase jamur
Lipase jamur telah diteliti sejak tahun 1950-an, dan Lawrence, Brockerhoff dan
Jensen telah menyajikan tinjauan yang komprehensif. Lipase ini sedang dieksploitasi
karena biaya ekstraksi yang rendah, stabilitas termal dan pH, spesifisitas substrat, dan
aktivitas dalam pelarut organik. Para produsen utama dari lipase komersial ialah
Aspergillus niger, Candida cylindracea, lanuginosa Humicola, Mucor miehei, Rhizopus
arrhizus, R. delemar, R. japonicus, R. niveus dan R. oryzae.
Di antara Mucorales, enzim lipolitik dari Mucor hiemalis , M. miehei, M. lipolyticus,
M. pusillus, Rhizopus japonicus, R. arrhizus, R. delemar. R. nigricans, R. nodosus, R.
microsporus, dan R. chinesis telah dipelajari secara detail. Termofilik M. pusillus dikenal
sebagai penghasil lipase ekstraseluler termostabil.
1,3 - spesifisitas (regio)-dari Rhizopus, merupakan lipase yang sangat cocok
untuk konversi trigliserida menjadi monogliserida. Lipase R. japonicus telah digunakan
untuk menghasilkan mentega, pembuatan coklat dan interesterifikasi minyak sawit
dengan metil stearate. Lipase (40 sampai 45 kDa) dari berbagai jenis Rhizopus
menunjukkan aktivitas maksimum terhadap asam lemak rantai menengah (C8-C10).
Dalam kasus R. delemar, ekstraseluler dan intraseluler isoenzim lipase telah diisolasi.
Produsen Lipase dari Entomophthorales termasuk Entomophthora apiculata, E.
coronata, E. thaxteriana, E. virulenta, Basidiobolus spp. dan Conidiobolus spp. Untuk
genus Pichia, Hansenula, dan Saccharomyces juga dilaporkan menghasilkan lipase. Dua
macam lipase telah dimurnikan dari Saccharomyces lipolytica. Lipase dilaporkan dari
Candida curvata, C. tropicalis, C. valida, dan C. pellioculosa dan spesifik terhadap obligasi
ester berbeda dalam hidrolisis trigliserida dengan C. deformans.
Jamur Geotrichum candidum berperan dalam pembentukan asam dalam produk
susu oleh lipolyzing lemak. Lipase dari G. candidum spesifisitas terhadap asam lemak
dengan ikatan rangkap cis di C9, sehingga enzim ini diterapkan untuk analisis
struktural triglycerides.
Enzim lipase intraseluler dan ekstraseluler Aspergillus niger adalah 1,3 -
(regio)-specific. A. oryzae dilaporkan efisien untuk ekspresi heterolog dari lipase dari
Rhizopus miehei dan Humicola lanuginosa. Enzim lipase dari Penicillium roqueforti
berperan dalam rasa Blue cheese. Aktivitas lipolitik juga telah terdeteksi pada P.
camemberti, permukaan cetakan putih dan keju Brie Camembert. Lipase dengan
spesifisitas untuk asam butirat telah diisolasi dari strain dari spesies Penicillium seperti
P. cyclopium, P. Verrucosum var, P. cyclopium, dan P. crustosum. Enzim lipase dari P.
cyclopium memiliki aktivitas yang jauh lebih tinggi terhadap mono dan digliserida
selain trigliserida. Enzim lipase dari H. lanuginosa DSM 3819 cocok sebagai aditif
deterjen karena bersifat termostabilitas, aktivitas yang tinggi pada pH basa, dan
stabilitas terhadap surfactant anionik. Lipase dari H. lanuginosa menunjukkan tingkat
tinggi aktivitas hidrolitik pada minyak kelapa dan minyak karena memiliki kandungan
asam laurat yang tinggi.
Keterangan mengenai enzim lipase dari mikroba dapat dilihat pada tabel berikut
ini.

E. Produksi dan Pemurnian Enzim Lipase dari Bakteri

Produksi enzim lipase dari bakteri diawali dengan penanaman bakteri dalam
media fermentasi yang terdiri dari komposisi gum arab 5%, pepton 1%, , minyak zaitun
10% dengan kondisi optimum pertumbuhan bakteri sebagai berikut: waktu inkubasi
24 jam, suhu 35°C, pH 8 (Anissa, 2006). Penanaman media fermentasi menggunakan
kondisi optimum dilakukan untuk memperoleh enzim lipase dengan jumlah yang
cukup besar.
Setelah diinkubasi dalam media fermentasi selama 24 jam, enzim lipase
dipisahkan dengan menggunakan alat sentrifuga dengan kecepatan 3500 rpm, 30 menit
dan suhu 4oC untuk mendapatkan ekstrak kasar enzim lipase. Dari proses ini diperoleh
ekstrak kasar enzim sebanyak 985 mL dengan aktivitas unit rata-rata enzim hasil
pengukuran duplo 0,21 U/ml, kadar protein 3,55 mg/ml, aktivitas spesifik 0,059 U/mg.
Setelah didapat ekstrak kasar dilanjutkan dengan proses pemurnian enzim
secara fraksinasi bertingkat menggunakan garam amonium sulfat. Fraksi tertinggi
adalah fraksi ke V (80-100)% jenuh dengan aktivitas unit 3,5 U/ml, kadar protein 1,74
mg/ml dan aktivitas spesifik 2,011 U/mg. Fraksi tertinggi yang diperoleh ini
selanjutnya didialisis menggunakan bufer fosfat pH 8; 0,025 M. Enzim lipase hasil
dialisis fraksi ke V menunjukkan 2,04 U/ml, kadar protein 0,42 mg/ml.dan aktivitas
spesifik 4,86 U/mg. Hasil ini memperlihatkan bahwa telah terjadi kenaikan sebesar
82,37 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim dengan perolehan 31,48 %.
Enzim lipase yang telah didialisis selanjutnya dimurnikan kembali dengan
sephadex G-100 secara kromatografi kolom, diperoleh 22 fraksi dimana fraksi 19
adalah fraksi tertinggi dengan aktivitas unit 2,83 U/ml, kadar protein 0,57 mg/ml dan
aktivitas spesifik 4,96 U/mg.
Dari 3 tahap pemurnian (fraksinasi, dialisis, dan kromatografi kolom) terlihat
bahwa aktivitas spesifik meningkat yang disebabkan oleh peningkatan kemurnian
enzim. Aktivitas spesifik enzim dipengaruhi oleh kadar protein, semakin tinggi aktivitas
spesifik suatu enzim maka semakin tinggi kemurnian enzim tersebut. Hal ini
menunjukkan terjadinya pemisahan protein lain yang bukan enzim. Dengan
meningkatnya aktivitas spesifik pada tiap tahap pemurnian, menunjukkan bahwa
proses pemurnian yang dilakukan cukup baik.

F. Pemurnian Enzim
a. Fraksinasi Amonium Sulfat
Proses pemurnian sampel ekstrak kasar enzim lipase diawali dengan fraksinasi
bertingkat menggunakan garam ammonium sulfat dengan tingkat kejenuhan (0-20%),
(20-40%), (40-60%), (60-80%) dan 80-100%). Fraksinasi dengan amonium sulfat
dilakukan dengan cara menambahkan amonium sulfat sedikit demi sedikit pada
larutan ekstrak kasar enzim sambil diaduk dengan pengaduk magnet. Pengadukan
diusahakan sedemikian rupa sehingga tidak menimbulkan busa selama kurang lebih 20
menit. Setiap endapan protein enzim yang didapat dipisahkan dari filtratnya dengan
menggunakan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit kemudian
dilarutkan dalam larutan buffer fosfat pH 8 dengan konsentrasi 0,05 M lalu diuji
aktivitasnya menggunakan Metode titrimetri dan ditentukan kadar proteinnya
menggunakan Metode Lowry. Fraksi yang memberi aktivitas tertinggi diuji aktivitas
esterifikasinya.
b. Dialisis
Endapan enzim hasil fraksinasi bertingkat yang memiliki aktivitas tertinggi
dilarutkan ke dalam buffer fosfat pH 8; 0,05 M selanjutnya dimasukkan kedalam
kantong selofan, kemudian didialisis menggunakan buffer fosfat pH 8; 0,05 M selama ±
48 jam pada suhu 4ºC.
c. Kromatografi Kolom
Perlakuan enzim selanjutnya adalah pemurnian berdasarkan ukuran dengan
kolom kromatografi filtrasi gel menggunakan sephadex G-100 sebagai fase diam.
Sampel diteteskan pada bagian atas kolom gel sephadex G-100 yang berfungsi sebagai
fase diam dan larutan buffer fosfat pH 8 yang berfungsi sebagai fase gerak. Sampel
enzim yang memiliki bobot molekul lebih besar dari pori-pori gel akan melewati ruang
antar pori-pori sehingga akan lebih dahulu keluar dari kolom sebaliknya yang berbobot
molekul lebih kecil akan masuk ke dalam pori-pori matriks sehingga akan keluar lebih
lambat. Setelah proses kolom berlangsung, eluen ditampung pada wadah sebesar 15
ml. Eluen yang telah ditampung pada wadah kemudian diukur kadar protein dan
aktivitas enzimnya. Fraksi yang memberikan aktivitas tinggi dikumpulkan dan
dikarakterisasi serta ditentukan aktivitas esterifikasinya.

G. Uji aktivitas enzim lipase

Untuk menentukan aktivitas enzim menggunakan metode titrimetri yaitu,
sebanyak 2 ml minyak zaitun dalam erlenmeyer 100 ml, ditambah 1 ml buffer fosfat
0,05 M (pH 8), dan 1 ml larutan enzim. Campuran substrat enzim ini kemudian dikocok
menggunakan shaker inkubator pada 30°C selama 1 jam. Setelah 1 jam substrat enzim
diinaktifkan dengan menggunakan campuran aseton : etanol (1:1) sebanyak 1 ml.
Campuran tersebut ditambahkan 5 tetes fenolftalein 1% sebagai indikator dan dititrasi
dengan menggunakan larutan NaOH 0,05 N. Titrasi dihentikan setelah campuran
berubah menjadi merah muda. Pengukuran aktivitas dilakukan secara duplo. Untuk
penetuan standar dilakukan dengan komposisi campuran yang sama, tetapi pada saat
dimasukkan larutan enzim dengan segera ditambahkan campuran aseton : etanol
untuk menginaktifkan enzim. Kemudian dititrasi dengan prosedur yang sama dengan
analisis sampel.

H. Penentuan Kadar Protein

Sebanyak 0,1 ml larutan enzim ditambahkan 0,9 ml aquades direaksikan dengan
5 ml larutan C. Larutan didiamkan selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian
ditambahkan reagen Folin-Ciocelteau sebanyak 0,5 ml. Larutan dibiarkan selama 30
menit pada suhu kamar. Warna yang terbentuk dibaca serapannya pada panjang
gelombang 740 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Konsentrasi
protein ditentukan dengan menggunakan kurva standar Bovin serum Albumin (BSA)
dengan konsentrasi 0-800 ppm.

I. Uji Aktivitas Esterifikasi

Pengukuran aktivitas esterifikasi dilakukan menggunakan Metode Hariyadi
(1995) dalam Efendi (2001) yaitu dengan cara mengesterkan 0,2 M asam laurat dan 0,2
M lauril alkohol didalam tabung reaksi bertutup, masing-masing sebanyak 5 ml.
Selanjutnya di inkubasi pada suhu 50°C selama 15 menit. Setelah suhu konstan,
ditambahkan enzim sebanyak 0,1 ml kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu
50°C. Selama reaksi esterifikasi berlangsung dilakukan pengadukan dengan stirer agar
reaksi berjalan lebih baik. Untuk mempertahankan suhu yang konstan, esterifikasi
dilakukan menggunakan circulated water bath. Media pemanas yang digunakan adalah
aliran air yang terus berputar secara kontinyu (Nuraida, 2000 dan Suhendra, 2004).
Setelah reaksi esterifikasi selesai, hasil reaksi segera disaring dengan membran
selulosa 0,45 μm untuk memisahkan enzim. Filtrat yang telah terpisah dari enzim,
dianalisis kandungan asam lemak bebas (ALB).
Untuk pengukuran asam lemak bebas menggunakan Metode Lowry dan Tinsley
yang dimodifikasi. Filtrat yang diperoleh diambil sebanyak 0,4 ml dan dimasukkan
kedalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 4,6 ml heksan. Setelah itu
dihomogenkan menggunakan vortex 30 detik yang dilanjutkan dengan penambahan 1
ml cupric asetat pH 6-6,2 sebagai pewarna. Kemudian dihomogenkan kembali selama 2
menit dan diinkubasikan selama 15 menit. Lapisan atas filtrat diambil dan diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 715 nm. (kurva standar dibuat dengan
menggunakan asam laurat 0-100 mmol).
J. Karakterisasi Enzim
Fraksi yang digunakan untuk tahap karakterisasi enzim adalah fraksi yang
mempunyai aktivitas unit tertinggi. Selanjutnya dilakukan karakterisasi enzim yang
meliputi pH, temperatur, waktu inkubasi, Km dan Vm.
1. pH Optimum
Untuk menentukan pH optimum enzim hasil isolasi, variasi pH yang digunakan
adalah 6, 7, 8, 9, dan 10 hasilnya tertera pada Gambar 1. Dari gambar tersebut terlihat
bahwa aktivitas lipase bervariasi dengan adanya perubahan pH. Hal ini umumnya
terjadi karena adanya perubahan struktur sekunder dan tersier dari enzim. Pada pH
yang optimum muatan gugus samping asam amino berada pada keadaan yang sesuai
sehingga enzim sangat efisien dalam mempercepat reaksi biokimia yang sangat
spesifik. Aktivitas optimum lipase dicapai pada pH 8. Hal ini disebabkan karena pada
kondisi pH 8 gugus pemberi dan penerima proton yang penting pada sisi katalitik
enzim berada pada keadaan yang diinginkan sehingga aktivitas katalitiknya tinggi.

Gambar 1. Penentuan pH optimum

2. Penentuan Temperatur optimum
Pada penentuan temperatur optimum, suhu yang digunakan adalah 30°C, 35°C,
40°C, 45°C, dan 50°C. Dari hasil pengujian yang dilakukan temperatur optimum lipase
adalah 45°C seperti yang tertera pada Gambar 2. Pada temperatur kurang dari 45°C
enzim cukup stabil, tetapi hidrolisis substrat minyak zaitun oleh enzim tidak berjalan
secara maksimal. Dengan meningkatnya temperatur, energi kinetik molekul-molekul
yang bereaksi bertambah sehingga molekul yang bereaksi semakin banyak dan produk
yang dihasilkan semakin besar. Diatas temperatur optimum, aktivitas enzim menurun
tajam hal ini terjadi karena enzim mengalami denaturasi protein yang dapat merubah
konformasi struktur molekul sehingga enzim kehilangan sifat alamiahnya. Pada
temperatur tinggi, substrat juga dapat mengalami perubahan konformasi sehingga
gugus reaktifnya mengalami hambatan dalam memasuki sisi aktif enzim (Suhartono,
1989). Sedangkan pada suhu yang lebih rendah dari suhu optimum, aktivitas enzim
juga rendah. Hal ini disebabkan karena rendahnya energi aktivasi yang tersedia. Energi
tersebut dibutuhkan untuk menciptakan kondisi tingkat kompleks aktif, baik dari
molekul enzim atau molekul substrat.

Gambar 2. Penentuan temperatur optimum

3. Waktu Inkubasi optimum

Selain pH dan temperatur, waktu inkubasi juga mempengaruhi pembentukan
produk. Penentuan waktu inkubasi optimum dilakukan dengan pengujian enzim lipase
pada berbagai waktu inkubasi, yaitu : 5, 10, 15, 20, 25, dan 30 menit. Pengaruh waktu
inkubasi terhadap aktivitas enzim lipase dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas enzim lipase

Berdasarkan pada Gambar 3, aktivitas lipase optimum pada waktu inkubasi 10

menit. Pada waktu inkubasi diatas 10 menit, enzim mulai mengalami penurunan
aktivitas lipase. Hal ini dapat disebabkan adanya perbedaan waktu yang dibutuhkan
oleh setiap enzim untuk bereaksi dengan substrat. Selain itu dengan panas 45°C enzim
lipase tidak dapat terlalu lama bereaksi dengan substrat sehingga lipase mulai
mengalami denaturasi.

4. Nilai Km dan Vm
Kecepatan reaksi enzim akan meningkat seiring dengan meningkatnya
konsentrasi substrat sampai pada suatu harga yang memberikan kecepatan reaksi
tetap. Pada keadaan tersebut, kecepatan reaksi enzim mencapai maksimum karena
reaksi enzim dengan substratnya menjadi jenuh dan tidak dapat bereaksi lebih cepat.
Harga KM dari suatu enzim berfungsi untuk mengetahui konsentrasi dari substrat yang
menghasilkan setengah laju reaksi maksimum.
Dari Gambar 4 dapat dilihat bahwa mula-mula aktivitas unit meningkat dengan
bertambahnya konsentrasi substrat, akan tetapi setelah tercapai aktivitas optimum
terjadi penurunan aktivitas. Hal ini dikarenakan pada konsentrasi substrat optimum
enzim berada pada keadaan “jenuh dengan substrat”. Selain itu, dapat juga disebabkan
pengendalian umpan balik, dimana jika produk yang dihasilkan berlebih maka produk
tersebut menjadi inhibisi bagi kerja enzim.

Gambar 4. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim lipase

Harga KM dihitung dengan mengukur aktivitas enzim lipase dalam berbagai

konsentrasi substrat dengan pH, temperatur, dan waktu inkubasi optimum. Pada
penelitian ini digunakan pH 8, temperatur 45°C, dan waktu inkubasi 10 menit. Harga K M
enzim hasil isolasi adalah 0,07 mg substrat/ml dan V maks sebesar 1,506 μmol minyak/ml
enzim.menit.
K. Uji Aktivitas Esterifikasi
Penentuan aktivitas esterifikasi dilakukan dengan mencampurkan asam laurat
dan lauril alkohol sehingga akan dihasilkan ester dan air. Selain itu dalam penelitian ini
juga digunakan pelarut heksana. Heksana merupakan pelarut organik non polar yang
sering dan cocok digunakan dalam reaksi esterifikasi yang dikatalis oleh lipase. Selain
itu menurut Basri et al.,(1995) aktivitas esterifikasi yang tinggi dari enzim lipase
diperoleh dengan menggunakan pelarut organik yang bersifat non polar karena pada
pelarut hidrofobik, air cenderung akan berpartisi ke dalam molekul enzim sehingga
akan meningkatkan kelarutan dan kestabilan enzim. Sementara itu aktivitasnya akan
rendah pada penggunaan pelarut organik yang bersifat polar karena pelarut tersebut
akan menarik sebagian air esensial dari molekul enzim.
Dalam pengujian aktivitas esterifikasi dilakukan pada ekstrak kasar enzim, fraksi
tertinggi ( Fraksi V) dari fraksinasi amonium sulfat, enzim hasil dialisis, dan enzim hasil
kromatografi kolom. Dari hasil penelitian diperoleh data bahwa aktivitas esterifikasi
meningkat dari ekstrak kasar enzim sampai tahap pemurnian kromatografi kolom
seperti yang terlihat pada Tabel 1.
Dari Tabel 1 dapat dilihat bahwa aktivitas esterifikasi dari ekstrak kasar sampai
dengan kromatografi kolom semakin meningkat. Hal ini dapat disebabkan semakin
meningkat kemurnian enzim lipase maka makin meningkat juga aktivitas esterifikasi
enzim lipase.
Tabel 1. Hasil Uji Aktivitas Esterifikasi Lipase
Aktivitas esterifikasi
Tahap
(mmol/ml enzim.menit)
Ekstrak kasar
2.38
enzim
Fraksi V (80-100%) 3.81
Dialisis 4.29
Kromatografi kolom 5.24

Adanya protein lain yang bukan enzim dapat menghambat sehingga kerja enzim
tidak maksimal dalam proses esterifikasi. Maka ketika dilakukan pemurnian, enzim
telah terpisah dari protein lain yang bukan enzim sehingga dapat memaksimalkan
proses esterifikasi.
L. Aplikasi enzim lipase
1. Lipase dalam industri susu
Lipase digunakan secara ekstensif dalam industri susu untuk hidrolisis
lemak susu. Aplikasi saat ini meliputi peningkatan rasa keju, percepatan
pematangan keju, pembuatan produk keju-suka, dan lipolisis lemak mentega,
dan cream. Sedangkan penambahan lipase terutama lisis rantai pendek (C4 dan
C6) asam lemak yang mengarah ke pengembangan rasa, aroma tajam,
pelepasan rantai menengah (C12 dan C14) asam lemak cenderung memberikan
rasa sabun untuk produk . Selain itu, asam lemak bebas mengambil bagian
dalam reaksi kimia sederhana di mana mereka memulai sintesis bahan rasa lain
seperti aceto-asetat, ß-keto asam, metil keton, ester rasa, dan lactones.
2. Lipase dalam deterjen
Penggunaan enzim dalam sabun bubuk masih tetap menjadi pemasaran
terbesar untuk industri enzyme. Tren di seluruh dunia terhadap suhu
pencucian yang lebih rendah telah menyebabkan permintaan jauh lebih tinggi
untuk formulasi deterjen rumah tangga. program skrining terakhir intensif,
diikuti oleh manipulasi genetik, telah menghasilkan pengenalan beberapa
persiapan yang cocok, misalnya, Novo Nordisk's Lipolase (lipase Humicola
disajikan dalam Aspergillus oryzae).
3. Lipase di industri oleokimia
Ruang lingkup penerapan lipase pada industri oleokimia sangat besar
karena menghemat energi dan meminimalkan degradasi termal selama
hidrolisis, glycerolysis, dan alcoholysis. Miyoshi Minyak dan Lemak.Co Jepang,
melaporkan penggunaan komersial cylindracea lipase Candida dalam produksi
sabun. Pengenalan generasi baru enzim murah dan sangat termostabil dapat
mengubah keseimbangan ekonomi yang mendukung penggunaan lipase.
Kecenderungan saat ini di industri oleokimia adalah suatu gerakan
menjauh dari menggunakan pelarut organik dan emulsifiers. Berbagai reaksi
yang melibatkan hidrolisis, alkoholisis, dan glycerolysis telah dilakukan
langsung dalam campuran substrat menggunakan berbagai lipase amobil. Ini
telah menghasilkan produktivitas yang tinggi serta terus menerus menjalankan
proses. Hidrolisis enzimatis mungkin menawarkan harapan terbesar untuk
membelah lemak tanpa investasi yang besar dalam peralatan mahal serta
pengeluaran dalam jumlah besar energy termal.
4. Lipase dalam sintesis trigliserida
Nilai komersial lemak tergantung pada komposisi asam lemak dalam
struktur mereka. Sebuah contoh khas dari campuran trigliserida tinggi nilai-
asimetris adalah mentega kakao. Potensi lipase 1,3-regiospecific untuk
pembuatan pengganti mentega, coklat diakui oleh Unilever dan Fuji Oil. Ulasan
komprehensif pada teknologi ini, termasuk analisis komposisi produk yang
ditemukan. Pada prinsipnya, pendekatan yang sama berlaku untuk sintesis
banyak lainnya terstruktur triglycerides properti memiliki dietic atau nutrisi
yang berharga, lemak misalnya, susu manusia. Ini trigliserida dan lemak
fungsional serupa mudah diperoleh dengan acidolysis dari fraksi minyak kelapa
sawit yang kaya 2-palmitoil gliserol dengan asam lemak tak jenuh (s).
Acidolysis, dikatalisis oleh lipase 1,3-spesifik, digunakan dalam penyusunan
produk nutrisi penting yang umumnya mengandung lemak rantai asam
menengah. Lipase sedang diselidiki secara ekstensif sehubungan dengan
modifikasi minyak bernilai tinggi asam lemak tak jenuh ganda seperti asam
arakidonat, asam eicosapentaenoic, dan asam docosahexaenoic. Pengayaan
substansial di kandungan asam lemak tak jenuh ganda fraksi mono-gliserida
telah dicapai oleh alkoholisis lipase-katalis atau hydrolysis.
5. Lipase dalam sintesis surfaktan
Poligliserol dan karbohidrat ester asam lemak banyak digunakan sebagai
detergen industri dan sebagai pengemulsi dalam berbagai besar formulasi
makanan (spread yang rendah lemak, saus, es krim, mayonnaises). Enzymic
sintesis surfaktan fungsional yang sama telah dilakukan pada suhu sedang (60-
80 ° C) dengan regioselectivity sangat baik. Adelhorst et al telah melakukan
esterifikasi pelarut-bebas dari sederhana alkil-glikosida menggunakan asam
lemak cair dan lipase amobil antarctica Candida. Fregapane et al diperoleh
mono-dan di-esters dari monosakarida dalam hasil tinggi, menggunakan asetal
gula sebagai bahan awal. Lipase dari A. terreus mensintesis biosurfaktan oleh
transesterifikasi antara minyak alami dan gula alcohol. Lipase juga dapat
mengganti phospholipases dalam produksi lysophospholipids. Lipase Miehei
Mucor telah digunakan untuk transesterifikasi fosfolipid dalam berbagai alcohol
primer dan sekunder. Lipase juga mungkin berguna dalam sintesis berbagai
macam surfaktan bio-degradable amfoter, ester asam amino yaitu berbasis, dan
amides.
6. Lipase dalam sintesis bahan-bahan untuk produk perawatan pribadi
 Unichem Internasional baru-baru ini meluncurkan produksi palmitat
isopropyl miristat, isopropil, dan 2-ethylhexyl palmitate untuk digunakan
sebagai emolien dalam produk perawatan pribadi seperti minyak kulit dan
krim anti sinar matahari, dan sabun mandi. Ester Wax memiliki aplikasi serupa
dalam produk perawatan pribadi dan sedang diproduksi secara enzimatis,
menggunakan lipase C. cylindracea, dalam sebuah batch bioreactor.
7. Lipase di farmasi dan bahan kimia pertanian
Utilitas lipase dalam penyusunan synthons kiral baik diakui dan
didokumentasikan. Beberapa proses baru saja dikomersialkan yang telah
dijelaskan oleh Sainz-Diaz et al., dan Davis et al. Resolusi asam 2-halopropionic,
bahan awal untuk sintesis herbisida phenoxypropionate, adalah proses
berdasarkan esterifikasi selektif (S)-isomer dengan butanol, yang dikatalisis
oleh lipase pankreas babi dalam hexane anhidrat. Contoh lain yang
mengesankan dari aplikasi komersial lipase dalam resolusi campuran rasemat
adalah hidrolisis epoxyester alcohol. Produk reaksi, ester (R)-glisidil dan (R)-
glycidol dapat segera dikonversi ke (R) - dan (S)-glycidyltosylates yang
intermediet menarik bagi penyusunan optik blocker ß aktif-dan berbagai
macam produk lainnya . Sebuah teknologi yang sama telah dikomersialisasikan
untuk menghasilkan 2 (R), glycidate 3 (S)-methylmethoxyphenyl, yang
intermediate kunci dalam pembuatan obat kardiovaskular optik Diltiazem
murni.
Lipase memiliki aplikasi sebagai katalis industri untuk resolusi alkohol
rasemat dalam penyusunan beberapa prostaglandin, steroid, dan analog
nukleosida carbocyclic. Regioselective modifikasi senyawa organik
polifungsional daerah lain belum berkembang pesat aplikasi lipase, khususnya
di bidang AIDS treatment. Lipase dari A. carneus dan A. terreus menunjukkan
kemo-dan regiospecificity di hidrolisis peracetates dari farmasi penting
polifenolik compounds. Lipase juga berguna dalam sintesis dari sucralose
sweetner buatan oleh hidrolisis regioselective dari Octa-acetylsucrose.
8. Lipase dalam sintesis polimer
Stereoselektivitas lipase berguna untuk sintesis polymer optik aktif.
Polimer ini adalah reagen asimetris, dan digunakan sebagai pernyerap. Di
bidang kristal cair, monomer yang sesuai dapat dibuat dengan transesterifikasi
lipase-katalis dari alcohol, yang dengan alkohol rasemat bisa disertai dengan
resolution. Penggunaan glycidyltosylates kiral untuk persiapan crystal
feroelektrik cair juga telah dilaporkan. Dengan demikian, enzim ini telah
melakukan diversifikasi penggunaan komersial, baik dalam hal skala dan
proses. Lipase telah bekerja dengan sukses di industri makanan serta teknologi
tingkat tinggi dalam produksi bahan kimia dan farmasi. Selanjutnya, enzim ini
memiliki potensi di bidang baru, untuk lipase misalnya telah berhasil telah
digunakan dalam pembuatan kertas - ternyata, perlakuan pulp dengan lipase
menghasilkan produk yang berkualitas tinggi dan kebutuhan pembersihan
berkurang. Demikian pula, enzim juga telah digunakan dalam hubungan dengan
koktail mikroba untuk pengobatan limbah lemak yang kaya dari pabrik es krim.
 BAB IV
PENUTUP

A. Kesimpulan
Dari pembahasan dapat ditarik kesimpulan bahwa:
1. Jenis mikroorganisme penghasil enzim lipase adalah Kelompok yeast dari
Candida rugosa, kelompok jamur adalah Aspergillus niger dan Penicillium
aurantiogriseum. Adapun pada kelompok bakteri, lipase yang dihasilkan
adalah dari genera Bacillus, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes,
Arthrobacter, Chromobacterium, Serratia, Vibrio, Aeromonas, dan
Staphyloccus.
2. Produksi enzim lipase dari bakteri diawali dengan penanaman bakteri dalam
media fermentasi yang terdiri dari komposisi gum arab 5%, pepton 1%, ,
minyak zaitun 10% dengan kondisi optimum pertumbuhan bakteri sebagai
berikut: waktu inkubasi 24 jam, suhu 35°C, pH 8.
3. Proses pemurnian sampel ekstrak kasar enzim lipase diawali dengan
fraksinasi bertingkat menggunakan garam ammonium sulfat dengan tingkat
kejenuhan (0-20%), (20-40%), (40-60%), (60-80%) dan 80-100%), dialsis
dan kromatografi kolom.
4. Enzim lipase hasil pemurnian memiliki karakteristik aktivitas optimum pada
pH 8, temperatur 45°C, dan waktu inkubasi 10 menit dengan nilai K M = 0,07
mg substrat/ml dan Vmaks = 1,506 μmol minyak /ml enzim.menit.
5. Aktivitas esterifikasi enzim lipase mengalami peningkatan seiring dengan
bertambahnya kemurnian enzim yaitu dari 2,38 mmol/ml enzim.menit untuk
ekstrak kasar, menjadi 3,81 mmol/ml enzim.menit untuk fraksi amonium
sulfat, selanjutnya meningkat kembali menjadi 4,29 mmol/ml enzim.menit
untuk dialisis dan 5,24 mmol/ml enzim.menit untuk hasil kromatografi
kolom.

6.
 DAFTAR PUSTAKA

Annisa, Y. 2006. Studi Penentuan Aktivitas Enzim Lipase dari Bakteri Proteus vulgaris
Galur Lokal PP-1 dengan Metode Spektrofotometri UV-VIS dan Metode
Titrimetri. Skripsi Sarjana Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung.
Bandar Lampung.

Basri, M., Ampon, K., Wan Yunus, W.M.Z., Razak, C.N.A., dan Saleh, A.B 1995. Enzymic
Synthesis of Fatty Esters by Hydropobic Lipase Derivates Immobilized on
Organic Polymer Beads. JAOCS 72(4):407-411.

Dosanjh, N.S., dan Kaur, J. 2002. Immobilization, Stability and esterification Studies of A
Lipase From Bacillus sp. Journal Biotechnology and Applied
Biochemistry. Vol. 36. Hlm 7-12. Punjab University. Chandigarh.
Efendi, S. 2001. Karakterisasi Enzim Lipase Intraseluler dengan Aktivitas Esterifikasi
dari Kpaang Rhizopus oryzae TR 32. Tesis. Fakultas Teknologi Pertanian,
Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Lehninger, A.L. 1995. Dasar-dasar Biokimia I. Erlangga. Jakarta.

Nuraida, L. 2000. Eksplorasi, Karakterisasi dan Produksi Lipase dengan aktivitas

Esterifikasi Tinggi dari Kapang Indigenus. Laporan Tahunan Pertama
Penelitian Hibah Bersaing VIII/I Perguruan Tinggi. FATETA-IPB. Bogor.

Sumarsih, S. 2002. Uji Aktivitas Lipolitik Beberapa Bakteri Hasil Isolasi dari Pelabuhan
Tanjung Perak dan Produksi Lipase dari Strain Terpilih. JIPTUNAIR.
Surabaya.

Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. PAU Bioteknologi IPB. Bogor.

Suhendra, L., Trenggono, Hidayat, C. 2004. Aktifitas Hidrolisis dan Esterifikasi Lipase
Ekstrak Kecambah Biji Wijen (Sesamun Indicum). Prosiding Seminar
Nasional dan Kongres Perhimpunan Ahli Teknologi Pangan Indonesia
(PATPI). Jakarta, 17-18 Desember 2004.

Wang, I.C. 1979. Fermentation and Enzymes Technology. John Wiley and Sons. New
York.