METABOLISMO DEL

NITROGENO
 Funciones del nitrógeno en la
levadura
• Función estructural
– Membranas
– Orgánulos subcelulares
– Síntesis de proteínas estructurales

• Función regulatoria
– Formación de ácidos nucleicos
– Síntesis de enzimas
– Síntesis de transportadores

• El contenido de nitrógeno en la levadura es de un 6% de

su peso: de este del 10 al 30% está formando parte de la
estructura proteica.
 FUENTES DE NITROGENO

• Las principales fuentes de nitrógeno para la

levaduras son:
– Ion amonio (NH4)
– Aminoácidos
– Aminas
• La levadura puede sintetizar todos los
aminoácidos a partir del amonio y de las cadenas
carbonadas producidos en el metabolismo de los
azúcares.
 Utilización de compuestos
nitrogenados

• Se pueden considerar tres grupos:

– Compuestos utilizados directamente en la
biosíntesis
– Compuestos que deben ser modificados antes de
ser utilizados en la biosíntesis
– Compuestos utilizados como donadores de N o de
catión amonio mediante reacciones de
desaminación y transaminación.
Mecanismos de transporte de metabolitos

Transportador

Transportador
 Difusión Facilitada

• Es asistida por un transportador proteico,

pero no requiere de suplementación directa
de energía para funcionar
– Este modo de transporte se utiliza para igualar
concentraciones entre el medio y la célula
– Para aumentar la velocidad de transporte a bajos
gradientes
– No permite concentrar intracelularmente
metabolitos (No funciona contra gradiente)
Difusión facilitada de aminoácidos

• El transporte está acoplado al movimiento de iones.

• Muchos transportadores de aminoácidos son
simportes con iones de hidrógeno
– La estrategia permite acoplar el transporte de iones,
con alto gradiente, a un compuesto con bajo gradiente.
• Los protones que entran a la célula deben ser
excretados nuevamente para impedir la acidificación
del citoplasma
• Este sistema de transporte solo funciona activamente
en las primeras etapas de la fermentación
Difusión facilitada de aminoacidos en
Sacch. cerevisiae

A: Acoplado a la escresion B: acoplado a un intercambio

de protones de iones potasio
 Características de los
transportadores de aminoácidos

• Algunos transportadores son altamente

específicos
• Otros transportadores actúan con un grupo
de aminoácidos relacionados.
• Algunos transportadores son reprimidos por
la presencia de ión amonio.
 Tipos de transportadores de
aminoácidos
• Transportador General de Aminoacidos: GAP
– Es reprimido por el ión amonio
– Numero de protones co-transportados = 2

• Dicarboxilic Aminoacid permeasa: DAP

– No es reprimido por el ión amonio
– Numero de protones co-transportados = 2 o 3

• Branched chain aminoacid permeasa: BAP

– No es reprimido por el ión amonio
– Numero de protones co-transportados = ?
 Transporte de Amonio

• Se han descrito dos permeasas para el ión amonio

• El transporte es inhibido de manera no competitiva
por ciertos aminoácidos (arginina y ac. Aspartico)
• El ingreso del ión esta acoplado, por razones de
carga, a la excreción de protones por la ATPasa de
la membrana.
• Por tanto, esta actividad de transporte necesita una
fuente energía para poder funcionar.
Mecanismos de absorción de
nitrógeno amoniacal

ATPasa
 FACTORES QUE AFECTAN LA
UTILIZACION DE NITROGENO POR LA
LEVADURA

Concentración de etanol
Temperatura
pH
Presión de CO2
Composición de la membrana Plasmatica
Grado aireación
Cepa de levadura
 Efecto de concentración de
etanol
• Disminuye la fuerza motriz a través de la
membrana
• Inhibe el bombeo activo de protones
provocado por la ATPasa de la membrana.
• Los mecanismos de trasporte activo
disminuyen o se eliminan
• El etanol desactiva la GAP por
modificación de su parte proeíca.
 Efecto del etanol sobre el
transporte de N
La difusión facilitada
de aminoácidos es
fuertemente inhibida por
el etanol (aumenta la
difusión pasiva de
protones).

La levadura acumula

aminoácidos en la
vacuola cuando la
concentración de etanol
todavía es baja.
 Efecto de la Temperatura
• El transporte de amonio ha demostrado ser
independiente de la temperatura
• La velocidad de acumulación de aminoácidos
disminuye con las bajas temperaturas porque
afecta al transporte activo.

• La demanda cuantitativa de aminoácidos afecta la

intensidad de la función de transporte

• .
 Efecto del pH

• Los mecanismos de transporte activo son afectados por

los pH bajos del mosto
• El pH optimo para el transporte del amonio esta entre
6,0 y 6,5.
• Se ha observado que las levaduras disminuyen en un
50% la utilización del amonio cuando crecen a pH 3,25
respecto de pH 4.0.
 Efecto de la composición de la
membrana plasmática
• Su efecto se ve regulado por varios factores:
– Concentración de esteroles (aireación)
– Grado de insaturación de los residuos acidos de
los fosfolípidos de la membrana. (mejor una doble
insaturación linoleico que monoinsaturado oleico.
– El grado de insaturación de los ácido grasos de la
membrana afecta la actividad de la GAP.
– El efecto es atribuido a una mayor fluidez en la
vecindad de los sitios de las permeasas.
 Efecto de la aireación
• La aireación influye indirectamente a través de su
acción sobre la composición de la membrana plasmática
• Como ya sea ha mencionado la utilización de prolina
esta condicionada a la disponibilidad de oxígeno en el
mosto
• En condiciones de anaerobiosis se ha determinado la
excreción de prolina y urea posiblemente como
resultado del metabolismo de la arginina.
• La aireación mejora la utilización del nitrógeno del
mosto en fermentación (mayor producción de energía
metabólica)
 Efecto de la presión de CO2

• La presión de CO2 disminuye la velocidad y

la concentración de absorción de
aminoácidos del mosto (alrededor de un
50%)
• El CO2 altera la formación y la excreción
de productos secundarios del metabolismo
de los aminoácidos afectando su ingreso a
la célula
Efecto del Nitrógeno sobre la
Fermentación Alcohólica
 Nitrógeno en los mostos

• Amplio rango de concentraciones:

TOTAL = 60 - 2400 mg/L
• Principalmente nitrógeno orgánico
( polipeptidos aminoácidos, proteínas, ión
amonio)
• Los nitritos y los nitratos están presentes en
niveles muy bajos < 0,3%.
NITROGENO LIBRE ASIMILABLE

• La determinación del N total no tiene una gran

relevancia para predecir deficiencias para la
levadura.
• La determinación del N total mediante el
método de Kjeldal no es un buen predictor.
• Sólo tienen relevancia la fracción de nitrógeno
asimilable por la levadura (YAN).
 Aspectos relacionados con el
Nitrógeno
• Como sabemos las principales fuentes de
nitrógeno para la levadura corresponden a:
Hay 1 excepción

Amonio + Aminoácidos = YAN

La nutrición dependerá de la disponibilidad en el
mosto y de la posibilidad que las formas nitrogenadas
ingresen a la célula.
Concentraciones de YAN en el mosto

• Su concentración es muy variable pues

depende de varios factores.
• Un estudio en 90 mostos de 25 c.v.
provenientes de cuatro distintas
regiones, entregó valores muy variables
28 - 336 mg/L
Media 120 mg/L
 Aspectos relacionados con el YAN
• Desgraciadamente no existe una concentración fija
que permita definir una disponibilidad suficiente de
YAN
• El YAN debería ser analizado en cualquier mosto
pero de preferencia:
– En viñas de suelos pobres que provocan limitaciones al
crecimiento (bajo vigor)
– Viñas con enfermedades degenerativas (virus, nematodos,
filoxera)
– Viñas con estrés hídrico prolongado
– Viñas con historial de fermentaciones flojas o que se
paralicen.
Antecedentes sobre la concentración
de YAN
• En ocasiones 140 ppm se citan como nivel mínimo
necesario.
• Cuando existen factores de estrés, las necesidades
aumentan
• En general se establece que las levadura en fase de
crecimiento prefieren unas 500 ppm pero con estos
niveles pueden fermentar demasiado rápido
(mayores necesidades de refrigeración).
• Valores entre las 200 y las 400 ppm parecen
suficientes; las concertaciones depende de los grado
Brix y otras condiciones.
 Antecedentes sobre la
concentración de YAN (2)
• En el mosto de uva el contenido de N alfa-amino es mayor
que el de amonio (promedio de unas 2 a 3 veces).
• Cuando se adiciona una elevada concentración de amonio
se altera el equilibrio drásticamente lo que puede
perturbar la síntesis de algunos aminoácidos.
• Un ejemplo de interés industrial es: Si la concentración de
metionina es baja y la de amonio elevada, puede
producirse la síntesis de H2S aunque la concentración de
nitrógeno asimilable sea elevada. Una adición de este
aminoácido elimina la alteración.
• Las fuentes de aminoácidos ( extracto de levadura,
hidrolizados de proteínas de soya) suelen impartir defectos
sensoriales.
 EFECTOS DEL NITROGENO

• Los estudios efectuados con mostos de distintas

concentraciones de nitrógeno inicial permiten
afirmar lo siguiente:
– La concentración inicial no modifica la velocidad
especifica máxima de crecimiento.
– Afecta el nivel de crecimiento máximo y la tasa de
descenso poblacional.
– La velocidad máxima de producción de CO2 es
proporcional a la concentración de nitrógeno inicial.
– El tiempo total de fermentación depende de la conc.
inicial de nitrógeno de acuerdo a una relación
exponencial inversa (r = 0,931)
 Aspectos cuantitativos
• Cuando la disponibilidad aumenta fuertemente: 300 a
800 mg/L. la asimilación de nitrógeno se eleva en
pequeña extensión 200 a 260 mg/L
• Los datos de Bely (1991) muestran un pequeña reducción
en la duración de la fermentación cuando el contenido de
FAN excede los 300 mg/L.
• La respuesta eficiente más tardía coincide con la mitad
de la fermentación.
• En las etapas avanzadas de la fermentación tienen un
mayor efecto las fuentes más complejas de nitrógeno,
efecto que se debería al cambio de transportadores.
• Las condiciones redox afectan las asimilación del
nitrógeno. El oxígeno estimula la eficiencia en la
utilización del nitrógeno
 Concentración de azúcar y asimilación de
nitrógeno, biomasa y velocidad media de
fermentación

Nitrógeno Rendimiento Nitrógeno Velocidad de

Azúcar Asimilado Biomasa asimilado/biomasa fermentación
conc. (g/l) (mg FAN/l) (g M.S./l) (%p/p) (gCO2/l dia)
183 71.8 2.06 3.3 8.4
208 127.5 2.63 4.9 12.3
233 128.6 2.85 4.5 11.5
258 143.2 2.38 6.0 9.1
 Efecto de la cepa de levadura
• Se ha determinado una amplia variación entre cepas de
Sacch. cerevisiae en relación a su patrón de utilización
de aminoácidos y concentración total de nitrógeno.
• Las diferencias cuantitativas son mas amplias que las
cualitativas
• La cepa Montrachet es muy exigente en sus
requerimiento de nitrógeno.
• Las cepas AWRI72 Y AWRI77 muestran una gran
sensibilidad para la acumulación de tirosina y baja para
glicina y alanina.
• La cepa Epernay2 excreta elevadas cantidades de
arginina luego de haberla absorbido del medio.
 Utilización de YAN por
distintos strain
mg/L
• Epernay 2 392
• Prise de Mousse 449
• Montrachet 473
• AWRI 350 330
• AWRI 2 430
• Flor 402
Competencias microbiológicas

• El crecimiento de hongos disminuye de

manera dramática el YAN
• Botrytis cinerea puede disminuir el YAN
entre un 7 y 61%
• Un importante desarrollo de flora
apiculada puede hacer que el YAN sea
deficiente para Saccharomyces
 Antecedentes sobre
suplementación de YAN
• La forma de suplementación más utilizada es la
adición de (Fosfato de amonio) FDA.
• La adición de FDA no es un panacea, en ocasiones
los suplementos complejos presentan mejores
respuestas
• Lo anterior puede deberse a que la levadura trabaja
mejor si dispone de un equilibrio entre aminoácidos
y amonio.
Porcentaje de y correlación entre el N
inicial y el N asimilado a dos
temperaturas

15.5ºC 20ºC
CEPA % r2 % r2
Residual Residual
EPERNAY 2 23.2 0.571 15.5 0.485
FLOR 16.8 0.619 16.0 0.414
PRISE DE MOUSSE 12.2 0.506 10.6 0.427
MONTRACHET 10.8 0.504 9.0 0.248
MEDIA 15.8 0.593 12.8 0.456
 Práctica de la suplementación
Nitrogenada
• Cuando se efectúan suplementaciones abundantes, es muy
importante hacerlas en forma parcializada.
• Las aplicaciones masivas al inicio de la fermentación
provocan un desequilibrio en la distribución del nitrógeno
asimilable, esto origina: problemas sensoriales, baja
eficiencia de la aplicación, acelera demasiado la
fermentación, generando calor y provocando perdida de
aromas.
• Las adiciones deberían parcializarse en los 2 a 4 primeros
días.
• Todas las adiciones deberían haberse realizado cuando la
concentración de sólidos soluble llega alrededor de 10º Brix.