Trabalho de Citologia – Assunto: Técnicas de Preparação Citológica – 1º anos

Realizar um trabalho sobre:

Técnicas de preparação citológica para observação no microscópio óptico, dando ênfase

ao objetivo e importância de cada técnica (esfregaço, esmagamento, corte manual,
inclusão e corte com o micrótomo).

E as técnicas de preparação citológica para observação no microscópio

eletrônico (de transmissão e de varredura), destacando suas diferenças e o
objetivo e importância de cada técnica utilizada

técnicas citológicas (microscopia)

Processos utilizados na preparação de material para observação ao microscópio.
Na microscopia ótica podem-se utilizar dois tipos de preparações: as temporárias
ou extemporâneas, usadas para a observação imediata do material, e as
definitivas, preparações que podem ser guardadas e observadas várias vezes.
A preparação do material a observar ao microscópio engloba várias técnicas. Inicia-
se com a colheita do material, que deve ocorrer em condições em que o objeto de
estudo não seja danificado.
A fixação, inclusão, corte, coloração e montagem são algumas das técnicas
utilizadas na preparação do material para observação em microscopia ótica.
Na microscopia eletrónica, são utilizadas técnicas de inclusão, corte, fixação e
contraste para a preparação do material a observar.
http://www.infopedia.pt/$tecnicas-citologicas-(microscopia)

TÉCNICAS CITOLÓGICAS
INTRODUÇÃO:
Entende-se por técnicas citológicas o conjunto de operações a que é preciso
submeter o
material biológico para ficar em condições de ser observado ao microscópio. Estas
técnicas
podem ser divididas em dois grandes grupos de preparações: para microscopia
óptica e para
microscopia electrónica.
Microscopia óptica
São variados os métodos de preparação de material citológico para ser observado ao
microscópio óptico. Podemos considerar 3 grandes tipos de preparações:
I. Preparações a fresco ou extemporâneas
II. Preparações definitivas sem inclusão
III. Preparações definitivas com inclusão (inclusão é uma das etapas da técnica, que
consiste
em colocar a peça citológica num bloco constituído por uma substância protectora e
de
suporte, que permita efectuar facilmente o corte)
I - Preparações a fresco
É um tipo de preparação que pode ser utilizada a qualquer momento, porque permite
uma
observação rápida e imediata. Também é designada por preparação extemporânea.
A este tipo de preparação se devem as primeiras descobertas científicas, pois
permite a
observação de peças ou microorganismos em condições de vida, apesar de ser por
um curto
período. Habitualmente, uma preparação é constituída por uma lâmina de vidro na
qual se
coloca o material biológico a observar, sobrepondo-se a este uma lamela de vidro.
Por vezes usam-se outros tipos de lâminas na observação de preparações a fresco,
como as
lâminas escavadas, que têm no centro uma cavidade. O material fica, assim, rodeado
de maior
quantidade de líquido e ao mesmo tempo não há compressão da lamela sobre as
estruturas a
observar.

Observação in vivo e in vitro

A observação in vivo corresponde ao estudo das células no seu próprio meio. É um
método
muito utilizado para o estudo dos seres vivos de pequenas dimensões (protozoários e
bactérias).
A observação in vitro permite o estudo das células vivas, sendo estas previamente
retiradas do
meio natural em que vivem e colocadas em soluções com composição química bem
definida, de
forma a que se processe sem qualquer alteração o metabolismo celular.
A – Líquidos fisiológicos
Quando há a preocupação de se observar todas as manifestações vitais do material
em estudo,
procura-se rodear a peça de líquidos favoráveis à sua vivência, cuja osmolaridade
deve igualar
aquela em que o ser vivo habitualmente vive. Esses líquidos ou meios denominam-
se
fisiológicos ou isotónicos e os mais usados são:
Líquido fisiológico (artificial) – Solução aquosa de cloreto de sódio a 9 /1000, para
células de
mamíferos e a 7/1000 para células de animais poiquilotérmicos.
Líquido fisiológico do tecido sanguíneo (plasma sanguíneo) – obtido por coagulação
do sangue,
seguida de centrifugação, adição anticoagulante, centrifugação e colheita do
sobrenadante –
plasma sanguíneo.
Líquido de Ringer – geralmente utilizado para exame de células de vertebrados
poiquilotérmicos e invertebrados. Além da isotonia, visa fornecer às células os
elementos
minerais existentes nos meios em que vivem e cuja iria prejudicar o seu
metabolismo e
estrutura. Esta solução pode apresentar diferentes composições quantitativas,
nomeadamente
quando são utilizadas em células de animais homeotérmicos (mamíferos e aves) ou
poiquilotérmicos.
Água do mar ou do rio – natural e filtrada ou artificial.
B – Coloração vital
Quando há necessidade de pôr em evidência certas estruturas celulares, procede-se à
sua
coloração. Os corantes são substâncias que aumentam o contraste e permitem
distinguir regiões
com igual índice de refracção. Porém, tem de haver uma precaução se queremos que
o
protoplasma não morra. Para isso são usadas soluções muito diluídas de corantes
vitais, tais
como: azul de metileno, vermelho neutro, azul do Nilo, vermelho do Congo, azul
brilhante de
cresilo, verde Janus, castanho de Bismark, azur I, azur II, etc., em concentrações da
ordem de
1/10.000 a 1/50.000.
Com as colorações vitais não só observamos as células e microorganismos como
também
granulações de secreção, vacúolos digestivos, grânulos, organelos citoplasmáticos e
ainda partes
do núcleo como, por exemplo, o nucléolo e cromossomas.

Muitos corantes coram certas estruturas celulares de uma cor diferente da sua. Estes
corantes
reveladores de reacções químicas são chamados metacromáticos. Por exemplo: o
vermelho
neutro, solúvel em água destilada com cor vermelho-violácea, vira para vermelho-
cereja sob a
influência de vestígios de ácidos e para amarelo-acastanhado ou alaranjado pela
acção das
bases. Alguns corantes vitais podem mesmo indicar o grupo químico a que pertence
um
determinado elemento da célula, o que se utiliza em técnicas de histoquímica. Por
exemplo, o
Sudão III cora as granulações de gordura nas células vivas.
Limitações do exame a fresco
• Só se aplica a materiais suficientemente transparentes
• A nutrição das células não é suficiente e, dentro de horas, as células começam a
mostrar
sinais de degenerescência, acabando por morrer.
• As observações têm, assim, uma duração muito limitada sendo, portanto,
preparações
efémeras que não se podem conservar.
II e III - Preparações definitivas
Fixadores
São substâncias ou agentes que induzem precipitação (cloreto de mercúrio e ácido
pícrico) ou
coagulação (aldeído fórmico, tetróxido de ósmio e glutaraldeído) das proteínas,
tornando-as
insolúveis. Estes agentes são utilizados em técnicas citológicas para inibir a
actividade
enzimática da célula, para impedir a actividade e a proliferação das bactérias, para
endurecer as
células de modo a que resistam melhor às etapas seguintes da técnica citológica e
para aumentar
a afinidade das estruturas celulares pelos corantes citológicos, tornando-as assim
mais
facilmente coráveis, mantendo-lhes, tanto quanto possível, a sua morfologia e
estrutura.
Submergindo um pedaço de tecido num líquido fixador, a morte da célula não ocorre
instantaneamente. O fixador penetra na peça por difusão, de tal maneira que a
maioria das
células periféricas fixa mais rapidamente e melhor do que as centrais. A rapidez da
fixação
depende da barreira proteica que se origina na periferia do tecido.
Tipos de fixadores
Agentes físicos usados como agentes fixadores: Pelo calor seco (chama, ex.:
bactérias) ou
húmido (fervura). De um modo geral, são métodos grosseiros e violentos que
alteram
profundamente a estrutura das células. Dessecação à temperatura ambiente – em que
há uma
rápida evaporação da água das células e dos líquidos intersticiais.

Agentes químicos usados como agentes fixadores: Metanol, etanol, acetona, ácido
sulfúrico,
ácido clorídrico, ácido tricloroacético, ácido pícrico, tetróxido de ósmio, ácido
acético,
formaldeído, cloreto de mercúrio, etc.
Misturas de fixadores mais usados em microscopia óptica
• Líquido de Bouin (ácido pícrico + formol + ácido acético)
• Líquido de Carnoy (etanol + clorofórmio + ácido acético)
• Líquido de Fleming (trióxido de crómio + tetróxido de ósmio + ácido acético +
água
destilada)
Coloração
Consiste em corar a totalidade da peça ou algumas partes específicas, dando-lhes
tonalidades
diferentes. Usam-se soluções de corantes naturais ou artificiais.
Corantes naturais - Hematoxilina (extraída de uma leguminosa), Carmin (extraído
do ovário
da fêmea de um hemíptero), anil (extraído de uma leguminosa), etc.
Corantes artificiais – Azul de metileno, azul de toluidina, Azur I e II, Sudão,
vermelho neutro.
Os corantes são geralmente constituídos por misturas de sais, que podem apresentar
um pH
ácido (pH = 0 – 6,9), neutro (pH = 7,0) ou alcalino (pH = 7,1 – 14). Os diversos
métodos de
coloração assentam na afinidade particular que certos elementos ou estruturas
possuem em
relação a determinados corantes que sobre eles se fixam electivamente.
Tipos de corantes artificiais:
• Ácidos – eosina, fucsina ácida, vermelho do Congo
• Básicos – vermelho neutro, verde de metilo, azul de metileno
• Neutros – eosinato de azur de metileno
Consoante a afinidade de determinadas estruturas das células ou tecidos para com
um dado tipo
de corantes as estruturas podem ser designadas por:
• Acidófilas – se coram com um corante ácido (citoplasma)
• Basófilas – se coram com um corante básico (cromatina)

Protocolo a efectuar na 6ª aula prática laboratorial (1ª parte)

I - Observação de fenómenos de isotonia, turgidez celular, lise celular,
plasmólise e
desplasmólise
Para que a morfologia das células permaneça intacta, devem ser utilizadas soluções
isotónicas
na observação de células a fresco. Uma solução isotónica é aquela cuja concentração
é igual à
do meio no qual as células vivem.
Quando se utiliza uma solução hipotónica (menos concentrada), a água do meio
difunde para o
interior das células, aumentando o seu tamanho e provocando turgidez celular. Se
esta solução
for muito hipotónica, as células podem mesmo sofrer lise celular, uma ruptura em
certos
pontos da membrana (apenas no caso das células animais).
Se, pelo contrário, se utilizar uma solução hipertónica, a água migra do interior das
células para
o meio extracelular, originando células desidratadas e de menor tamanho, que se
dizem
plasmolisadas.
I A - Observação em células epidérmicas de Allium cepa (n. v. cebola)
1. Cortar uma cebola e, com uma pinça, puxar um pedaço de uma escama delgada e
transparente do interior do bolbo.
2. Deitar uma gota de água sobre a lâmina e colocar nela um fragmento da escama
de cebola.
Cobrir com uma lamela.
3. Observar com a obj. de 10x que não se verificam alterações nas células e
seleccionar o
campo de observação mais favorável.
4. Após ter verificado este fenómeno de isotonização, fazer penetrar por difusão
uma solução
de sacarose 1 M (solução hipertónica) com o auxílio de papel de filtro e de uma
pipeta (não
esquecer que a imagem final obtida no microscópio é invertida). Lentamente,
verifica-se
uma exosmose e dá-se o fenómeno de plasmólise; observar também com a obj. de
40x.
5. Em seguida, pelo mesmo processo de difusão, retirar a solução de sacarose e fazer
penetrar
água (sol. hipotónica). Verifica-se uma endosmose e dá-se o fenómeno de
desplasmólise.
I B - Observação em eritrócitos humanos in vitro
1. Limpar a polpa do dedo indicador com algodão embebido em álcool; deixar secar
ao ar
agitando o dedo; colocar o dedo para baixo e garroteá-lo com a outra mão, de modo
a
aumentar a quantidade de sangue na polpa do dedo.

2. Utilizando uma lanceta estéril, fazer a colheita de uma gota de sangue, a qual sem
perda de
tempo, se coloca entre lâmina e lamela numa gota de sol. de NaCl 0,9% (soro
fisiológico).
3. Focar primeiro com as obj. de 4x e de 10x e observar com a obj. de 40x.
4. Repetir 2 e 3 utilizando uma solução de NaCl 1,5% (sol. hipertónica). Os glóbulos
vermelhos tornam-se globosos e eriçados – plasmólise (Fig. 11)
Fig. 11 - Eritrócitos na presença de diferentes concentrações de NaCl.
5. Repetir o procedimento utilizando NaCl 0,6%. A célula aumenta de volume
devido a uma
endosmose, mas a pressão exercida no interior da célula não é suficiente para a
fazer
rebentar, verificando-se o fenómeno de turgidez celular (Fig. 11).
6. Com uma solução de NaCl 0,4%, a quantidade de água que penetra no interior da
célula
exerce uma pressão que faz romper a membrana celular, libertando a hemoglobina e
ficando
a célula mais pálida e transparente, designada vulgarmente por fantasma. (O meio
que a
rodeia apresenta-se com uma tonalidade avermelhada.) Contudo, a célula mantém a
sua
forma circular, devido à presença do citosqueleto submembranar, que é responsável
pela
forma dos glóbulos. O fenómeno de lise celular em glóbulos vermelhos designa-se
por
hemólise (Fig. 11).
Nota: Na célula vegetal não se verifica a lise celular pelo facto de possuir uma
parede celular
que, não só confere protecção à célula, como faz com que ela suporte pressões
elevadas.

6ª aula prática laboratorial (II – parte)

III - Preparações definitivas com inclusão
Inclusão é uma das etapas da técnica, que consiste em colocar a peça citológica num
bloco
constituído por uma substância protectora e de suporte, que permita efectuar
facilmente o corte.
Preparações definitivas com inclusão (técnica usual de microscopia óptica)
Etapas:
1. Colheita – Cortar em pequenos pedaços, com o auxílio de material de dissecção, o
material
biológico a fixar.
2. Fixação - Depois da colheita, a peça deve rapidamente ser colocada no fixador
para se
evitar a autólise e aí permanecer durante algumas horas e, em certos casos, alguns
dias ou
semanas (em formol, as peças são preservadas indefinidamente). Se necessário,
efectua-se
uma descalcificação - é a dissolução dos sais de cálcio que se encontram, por
exemplo, nos
ossos e no exosqueleto de muitos animais.
3. Desidratação - Consiste em substituir a água das células e dos espaços
extracelulares de um
tecido por um solvente miscível com o solvente do meio de inclusão. Em MO
compreende
uma passagem pela série ascendente dos álcoois (por ex., 50°, 70°, 90°, 95°, 100°I,
100°II,
xilol I e xilol II), cujo tempo de passagem varia, de igual modo, com vários factores.
Vulgarmente, usa-se 30 a 60 minutos em cada passo. Como nos passos seguintes se
utiliza a
parafina, que é insolúvel em água mas solúvel em certos compostos orgânicos, é
necessário
terminar a desidratação com 2 banhos de xilol para substituir o etanol por este
solvente da
parafina.
4. Impregnação - A impregnação consiste em impregnar os espaços intra- e
extracelulares com
parafina. Para isso, inicia-se a impregnação com um banho de 1 a 2 horas de duração
numa
mistura de xilol/parafina (1:1) à temperatura de 55°C (a parafina só fica líquida a
esta
temperatura). De seguida, a peça histológica é imersa em parafina pura, à mesma
temperatura, efectuando-se dois banhos de 1 a 2 horas cada.
5. Inclusão - Nesta etapa é habitual efectuar-se o registo do material processado, ao
qual é
atribuído um número para posterior identificação. Para se incluir a peça histológica
num
bloco de parafina utilizam-se moldes especiais, os moldes de Leuckart, que se
enchem com
parafina líquida, nos quais se introduz a peça histológica e, por último, uma etiqueta.
A
parafina à temperatura ambiente solidifica e a peça fica assim totalmente incluída na
parafina. Nesta etapa procede-se à separação do molde e o bloco fica em condições
depermanecer armazenado (até por anos, se for caso disso) até se proceder à etapa
seguinte, o
corte.
6. Corte - É efectuado por meio de uma faca de aço ou de uma lâmina colocada num
aparelho
especial chamado micrótomo de Minot, no qual se regula a espessura do corte, de
acordo
com a natureza do tecido e do estudo que se pretende realizar. Na maior parte dos
casos
utiliza-se o corte com 7 a 8 μm de espessura.
7. Colagem - As secções são coladas numa lâmina de vidro lavada e
desengordurada. A
colagem efectua-se numa platina aquecida entre 40° e 50°C, utilizando-se água
albuminada
como cola.
8. Secagem - De seguida as lâminas são colocadas na estufa a 40°C durante 1 a 2
dias para
completarem a secagem.
9. Desparafinação - Como os corantes são, de um modo geral, hidrossolúveis, as
secções têm
de sofrer uma sequência de tratamentos que culmina na sua hidratação. O passo
inicial
consiste em retirar a parafina. Para este efeito, as lâminas são mergulhadas numa
tina de
ranhuras com xilol, durante 10 minutos.
10. Rehidratação - Os cortes são transferidos de tina em tina, percorrendo a série
descendente
dos álcoois até ao álcool a 50°, durante 3 minutos em cada passo. Por fim, são
colocados em
água destilada durante 5 minutos.
11. Coloração - Depois de o material estar bem rehidratado, procede-se à coloração
por meio de
corantes aquosos. Se o corante for alcoólico deve-se proceder à rehidratação até ao
grau da
escala do álcool correspondente à riqueza alcoólica do corante.
Geralmente, utiliza-se a associação de dois corantes aquosos: as lâminas contendo os
cortes
são colocadas em tinas de ranhuras contendo hemalúmen (de cor azul arroxeada)
durante
10 a 15 minutos. Segue-se uma lavagem em água corrente durante cerca 5 minutos.
Depois
coram-se nas mesmas condições com a eosina (de cor avermelhada) durante 2 a 3
minutos,
seguindo-se uma lavagem durante cerca de 5 minutos.
12. Desidratação - Uma vez corados os cortes, estes têm de sofrer um determinado
tratamento
que lhes permita serem conservados indefinidamente, o que se consegue através da
adição
de uma resina transparente. Esta substância é hidrofóbica, logo os cortes têm de ser
desidratados (série ascendente dos álcoois) até ao álcool a 100°, durante 1 minuto
em cada
passagem. Por fim, os cortes são diafanizados, o que significa conferir transparência,
com
xilol durante 3 minutos.
13. Montagem - Após a diafanização, os cortes são cobertos com uma gota do meio
de
montagem (resina) podendo ser bálsamo do Canadá ou DPX e, por fim, coloca-se
uma
lamela. O índice de refracção do meio de montagem tem de ser igual ao do vidro.

14. Secagem, Lutagem e Etiquetagem – Para a preparação histológica secar mais

rapidamente é
colocada na estufa a 40°C, durante 24 horas, para que o meio de montagem
endureça. A
lutagem é uma etapa muitas vezes não efectuada, que consiste em cobrir os bordos
da
lamela com um meio totalmente impermeável ao ar. Usa-se geralmente verniz ou
betume.
Para finalizar, coloca-se num dos lados uma etiqueta, na qual se identifica o
material, a
fixação e a coloração utilizadas. As preparações devem ser guardadas ao abrigo da
humidade e da luz.
As etapas da técnica usual da MO irão ser observadas e explicadas através de um
filme.
Numa das aulas práticas serão executadas as etapas 7 a 14.
CITOLOGIA CLÍNICA 

O exame citológico é uma das grandes ferramentas para auxiliar o médico

veterinário no diagnóstico, prognóstico e na tomada de decisões frente a
casos clínicos.
A citologia oferece inúmeras vantagens, uma vez que as técnicas de
obtenção do material são muito simples, de baixo custo e muitas vezes
proporciona resposta diagnóstica rápida, porém como toda técnica, nem
sempre o parecer é definitivo.
A grande maioria dos exames citológicos deve ser confirmada por exame
histopatológico, devido à possibilidade do material colhido ser pouco
representativo e também há restrições quanto à avaliação prognóstica, pois
tal exame avalia somente as características de células isoladas ou em
blocos, ao passo que o exame histopatológico permite avaliar a arquitetura
do tecido como um todo, ou seja, a inter-relação entre células,
demonstrando grau de invasividade e avaliação de margens cirúrgicas, para
exemplificar: obtenção de amostra somente do componente inflamatório de
uma neoplasia infectada por bactérias.

Há três grandes modalidades de obtenção de material para exame

citológico:

Citologia Esfoliativa:
Consiste em remover as células mais superficiais da lesão através de
esfoliação (raspagem), sendo indicada para avaliação do processo de
maturação (diferenciação) de epitélios, para caracterização de tipos de
exsudatos ou para visualização de agentes infecciosos ou mesmo
parasitários. Esta técnica é usada, por exemplo, na determinação da fase do
ciclo estral de cadelas, de processos inflamatórios uterinos, habronemoses,
etc.

Citologia por Decalque ("imprint"):

Tal modalidade também baseia-se na remoção de células superficiais de
uma lesão ou da superfície de corte de um órgão, através do contado da
superfície em questão com a de uma lâmina de microscopia. É uma técnica
muito utilizada em sala de necrópsia para confirmação diagnóstica de
suspeitas levantadas à macroscopia, com resposta rápida.
Citologia Aspirativa por Agulha Fina:
Neste método há remoção das células da lesão pela avulsão promovida
através da utilização de uma agulha fina (30 mm x 0,7 mm ou 22G). Com
esta técnica podemos obter células de vários planos do tecido.
A citologia aspirativa por agulha fina é, sem dúvida, mais interessante que
as técnicas anteriores, pois recolhe material muito mais representativo de
lesões profundas.

Devemos seguir algumas regras básicas para obtenção de bons resultados

através da citologia:

Histórico detalhado: 
Estas informações são muito importantes, pois indicam o tempo de
instalação do processo, como foi o início da lesão, etc.... Estes dados são
muitas vezes fundamentais para determinação de diagnósticos diferenciais
ou para comentários relativos aos possíveis diagnósticos.

Descrição da lesão: 
Uma boa descrição da lesão, como localização precisa do processo e tipo
de lesão (nodular, ulcerativa, etc.), auxilia sobejamente o sucesso
diagnóstico e permite correlacionar achados citológicos com a lesão
macroscópica;

Técnica de colheita: 
Este é um dos passos mais importantes para realização da citologia
diagnóstica e freqüentemente desconhecido. Uma técnica de colheita
inadequada pode impedir a conclusão do caso, pois a amostra colhida deve
necessariamente possuir células características da lesão em questão.

Extensões adequadas: 
No exame citológico as extensões devem ser feitas seguindo-se os seguites
cuidados:
a) não comprima o material - especialmente no caso de suspeitas de
tumores, pois as células neoplásicas são muito frágeis;
b) produza extensões delgadas, evitando sobreposição de várias camadas de
células, pois a sobreposição impossibilita a coloração e visualização
adequada do material;
c) No caso de extensões que serão coradas por corantes hematológicos,
desidrate o material, por movimentação ao ar (abane), o mais rápido
possível. Não guarde as lâminas úmidas, pois isto causa degeneração
celular inviabilizando o resultado.

Técnica de obtenção de material por Citologia Aspirativa com agulha fina:

Material Necessário:
a) Anti-séptico;
b) Seringa plástica descartável de 10 a 20 ml;
c) Agulhas 30 mm x 0,7 mm ou 22 G;
d) Lâminas para microscopia limpas e desengorduradas com álcool;
e) Porta lâminas;
f) Ficha de solicitação de exames. 

Preparo do paciente:
Tratando-se de lesões palpáveis não há necessidade de preparos especiais
para o paciente, sendo a antissepsia o único procedimento necessário.
Lembre-se que a antissepsia é um processo requerido na citologia
aspirativa e deve ser ponderado na citologia por esfoliação, pois se deseja-
se visualizar o tipo de exsudato ou agente infeccioso, estes poderão ser
removidos durante a limpeza do local.
Em muitos casos de suspeita de neoplasias ou processos inflamatórios
crônicos não há necessidade de sedação uma vez que os pacientes
freqüentemente não demonstram qualquer incômodo durante ou após o
procedimento. A dor pode ocorrer nos processos inflamatórios agudos,
onde os anestésicos locais não surtem efeito e como a técnica para
obtenção do material é relativamente rápida, geralmente uma contenção
física eficaz traz ótimos resultados.

Obtenção do material:
A. Realize a contenção física do paciente de maneira adequada e promova a
antissepsia;
B. Acople a agulha à seringa;
C. Fixe a lesão com os dedos indicador e médio;
D. Mantenha o êmbolo da seringa na posição ZERO.
E. Introduza a agulha na lesão;

  

  F. Promova uma forte pressão negativa no interior da seringa e mantenha-

a;
G. Promova com a agulha movimentos de "vai e vem" na lesão e em
diversos planos diferentes, mantendo a pressão negativa;
  

  CUIDADO: Se por acaso, a agulha sair da lesão, descarte esta agulha e

recomece o procedimento escolhendo outro ponto para punção.

ATENÇÃO: Sangue no canhão da agulha ou na seringa não deve ser

encarado como sinônimo de boa colheita, pois elementos sangüíneos
podem diluir as células que representam o processo.

H. Solte o êmbolo da seringa desfazendo a pressão negativa;

I. Retire a seringa e agulha da lesão;

  

  J. Desacople a agulha da seringa;

K. Preencha a seringa de ar e acople novamente a agulha;
L. Com o orifício do bisel da agulha voltado para lâmina de microscopia,
empurre o êmbolo depositando o conteúdo contido na agulha contra esta.
Faça isto na porção central ou em um dos quartos da lâmina;  
  ATENÇÃO: O material contido na agulha é suficiente para o diagnóstico.
A presença de sangue no material causa diluição da amostra, muitas vezes
tornando o exame inconclusivo.

M. Promova a extensão encostando uma lâmina extensora a 45º;

  N. Não estenda o material até o

final da lâmina.  

    Home / Laboratório / Serviços / Informações / Downloads / Lin
ks / Cadastro / Contato/ Informativo

Esfregaço
Origem: Wikipédia, a enciclopédia livre.

Esfregaço é uma leve camada de matéria orgânica sobre uma lâmina de vidro, para
exame microscópico.

A técnica do esfregaço que é utilizada para material que se encontra formado por
células isoladas, como por exemplo as células da mucosa bucal. Esta consiste em
espalhar uma gota do material biológico a observar sobre uma lâmina de vidro
formando uma fina película para uma melhor observação ao microscópio, que mais
tarde pode ser submetida a uma coloração para evidenciar alguns constituintes desse
material a ser visualizado.

Este artigo sobre Biologia é um esboço. Você pode ajudar a Wikipédia expandindo-o.

Esfregaço é um material que pode ser papel filtro ou não tecido, usado para realizar
amostragens de contaminações radioativas em superficies de áreas ou locais onde se
manipularam fontes radioativas, e que por algum motivo ou devido a suas grandes
dimensões, não podem ser medidas diretamente com detector de radiação. O
esgregaço é utilizado como uma medida indireta, e após realizado em uma área de
aproximadamente 100 cm2, é levado para um detector de radiação, onde o nível de
contaminação presente é considerado com sendo em média 10% da contaminação
presente na área amostrada.

Técnicas de colheita de material para exame citopatológico

1. Impressão
Técnica: remover o excesso de secreção, sangue ou fluido com papel
absorvente. Tocar a lâmina com o tecido a ser examinado, várias vezes
em locais diferentes da lâmina. Ser rápido em todos os passos (é
fundamental) Secar imediatamente (secador, agitação), corar e examinar.
Fazer mais de uma lâmina. 
Indicações: É indicada para lesões ulceradas e tecidos obtidos de
cirurgias e necropsias.
Vantagens: técnica fácil e que necessita de equipamento mínimo.
Desvantagens: a amostra obtida é pouco celular (relativamente), obtém
apenas as células superficiais e pode exibir elevada contaminação
bacteriana e celular.

2. Suabe (“swab”)
Técnica: umedecer o suabe com soro fisiológico (ou não, se a lesão for
muito úmida). Esfregar o suabe sobre a região a ser examinada. Rolar
(não esfregar) o suabe sobre a lâmina. Secar imediatamente, corar e
 examinar.
Indicações: É indicado para superfícies epiteliais, tratos fistulosos e onde
as outras técnicas não se aplicam.

3. Raspagem
Técnica: remover o excesso de sangue e fluido. Raspar a lesão com a
lâmina do bisturi perpendicular à lesão até obter material suficiente.
Espalhar o material na lâmina pela técnica do esfregaço ou do
deslizamento. Secar imediatamente, corar e examinar
Indicações: É indicada para lesões externas de pele e mucosas e tecidos
excisados (lesões firmes).
Vantagens: obtenção de grande quantidade de células (maior
probabilidade de diagnóstico preciso)
Desvantagens: obtenção somente de células superficiais, é mais difícil que
outras técnicas e existe grande contaminação bacteriana e celular

4. Biópsia aspirativa por agulha fina

Indicações: Indicada para qualquer tipo de lesão, órgão ou tecido que
possa ser atingido por uma agulha introduzida desde a superfície.
Vantagens: não há contaminação superficial, são colhidas células de
vários locais da lesão (maior representatividade), permite colheita
asséptica (para microbiologia) e é praticamente indolor
Desvantagens: necessita maior contenção (física ou química) do paciente,
existe risco de hemorragia local e existe risco de induzir metástases
(teoricamente – ainda não foi comprovado)
Técnica: utilizar seringa de 10 ml com agulha 30 x 7.

1- Colocar 2 ml de ar na seringa. 
2- Introduzir a agulha na lesão, puxar e segurar o êmbolo e movimentar a
agulha para frente e para a traz, várias vezes (10-12) no interior da lesão,
rapidamente e em várias direções, enquanto se mantém a pressão
negativa na seringa e sem removê-la do tecido. 
3-Soltar o êmbolo, remover a agulha do tecido e expelir o conteúdo na
lâmina. 
4- Espalhar o material, secar imediatamente, corar e examinar.

Nota 1 : a rapidez em todos os passos é ESSENCIAL

Nota 2: para coloração citológica Papanicolau ( uma das melhores

colorações citológicas) é necessário que, imediatamente após espalhar o
material obtido sobre a lâmina de vidro, a amostra seja fixada com
fixador citológico ou com álcool 70 – 90%.

Muito importante: após fixado com álcool ou o fixador citológico o

material contido na lâmina dura até cinco dias sem coloração. Dessa
maneira o clínico/proprietário terão maior prazo de tempo para enviar o
material ao laboratório.

5. Aspirados de fluidos cavitários

Técnica: a colheita do líquido não requer técnica especial. Espalhar o
material colhido pela técnica do esfregaço. Secar, corar e examinar.
Indicações: É indicado para coleções de fluidos em cavidades naturais ou
neoformadas.
Vantagens: é muito representativa.
Desvantagens: pode ser muito pobre em células (neste caso, centrifugar) e
pode coagular (usar seringa com anticoagulante).

Técnicas para espalhar (fazer a extensão) o material colhido nas lâminas:

Pontos muito importantes a considerar: o maior interessado no resultado
do exame é o clínico. Uma lâmina mal feita é irreparável e pode
impossibilitar o diagnóstico. A limpeza das lâminas é muito importante
(cuidado com lâminas engorduradas!). Sempre manusear as lâminas
pelas bordas (evitar marcas de dedos – células epiteliais), muitas vezes os
dedos estão sujos de manusear o próprio paciente. A rapidez é
ESSENCIAL (os artefatos ocorrem muito rapidamente).

1- Técnica do esfregaço: exatamente igual ao esfregaço sangüíneo.

Coloca-se uma segunda lâmina em ângulo de 45° sobre o material
expelido na primeira lâmina e desliza a lâmina inclinada sobre a outra
rapidamente. O material a ser examinado concentra-se nas bordas do
esfregaço

2- Técnica do deslizamento das lâminas: colocar uma segunda lâmina

longitudinal ou transversalmente sobre a primeira. Caso existam grumos,
bastam pequenos toques com o dedo sobre a lâmina para comprimi-los.
Afastar uma lâmina da outra em direções contrárias (resultam duas
amostras). Não comprimir ao espalhar o material (só o peso da lâmina é o
suficiente). O material a ser examinado espalha-se uniformemente pela
lâmina.

3- Técnica do esmagamento: usada apenas para material que contenha

grumos (secreções de tratos fistulosos com infecção por certos fungos ou
certas bactérias). Colocar uma segunda lâmina sobre a primeira contendo
o material. Usar pressão suficiente para desfazer os grumos. Espalhar o
material pela técnica do deslizamento.

4- Outras formas (alça, agulha e suabe): Utilizando alça de microbiologia

(ou qualquer outro instrumento similar): o material é espalhado com
movimentos circulares. A distribuição do material é proporcional em
toda a lâmina.
 Utilizando a própria agulha de biopsia: utilizar a extremidade ou a
lateral da agulha e arrastar o material do centro para a periferia.
Utilizando o Suabe: rolar o suabe sobre a lâmina

Técnicas de coloração para exame citológico

1. Colorações tipo Romanowsky (Panóptico, Diff-Quick, Wright, May-
Grumwald-Giemsa (MGG) ): são baratas, fáceis de preparar, guardar e
usar. Coram bem microorganismos e o citoplasma. Coram mal os
núcleos, mas o suficiente para avaliar critérios de malignidade.
Particularidades: Panóptico Diff-Quick: não cora bem grânulos de
mastócitos (problema)
May-Grunwald-Giemsa: é a melhor delas (é um pouco mais complicada)
TODAS necessitam fixação ao ar (rápida!!!)
2. Papanicolaou: é demorada e complicada, mas é a rainha das colorações
para citologia. Ótima coloração de núcleos e citoplasma. Ótima para
avaliar critérios de malignidade. Permite enxergar os núcleos mesmo em
grumos grandes de células. 
Necessita fixação com álcool 70 a 90% ou fixador citológico !!!!
3. Novo Azul de Metileno: muito fácil de utilizar. Cora mal o citoplasma,
mas cora muito bem o núcleo e permite avaliar detalhes nucleares. Cora
bem grânulos de mastócitos

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http://www.werner.vet.br/html/recom-02.htm

http://pt.wikipedia.org/wiki/Esfrega%C3%A7o

PRÁTICA DA UTILIZAÇÃO DO MICRÓTOMO

Alexandre Pereira

, Aline Helena Araujo Machado

, Fernanda Maria Prado

Braga

, Gabriela de Barros Ferreira

, Karina Carvalho de Oliveira

5

, Renato

Amaro Zângaro

, Marcos Tadeu Tavares Pacheco

1-5 Faculdade de Ciências da Saúde (FCS)

Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), Brasil, 12244-000

Fone: +55 12 3947 9999, Fax: +55 12 3947 9999

6-7 Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D),

Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), Brasil, 12244-000

Fone: +55 12 3947 9999, Fax: +55 12 3947 9999

alexhh@bol.com.br, alineharaujo@aol.com, fefelelezinha@ig.com.br,

bibigabi02@yahoo.com.br,

kakacoliveira@bol.com.br, zângaro@univap.br, mtadeu@univap.br

Palavras-chave: micrótomo, cortes histológicos, citologia, histologia.

Área do Conhecimento: Ciências biológicas.

Resumo - O projeto visa o conhecimento da prática da microtomia, que consiste

basicamente em

obter cortes sucessivos dos blocos de parafina contendo fragmentos de órgão. Quando o

micrótomo está regulado e com todas as etapas de histologia realizadas de forma

adequada,

ocorrem cortes com exata precisão. O conhecimento prático da utilização do

micrótomo é

importante para identificar as falhas que comumente ocorrem na obtenção dos cortes
histológicos.

Introdução

Micrótomo é um aparelho destinado

a cortar blocos de tecido. A Microtomia

consiste basicamente em obter cortes

sucessivos dos blocos de parafina contendo

fragmentos de órgão. É extremamente

importante na microtomia que a faca esteja

muito bem afiada. Existe também a opção de

utilizar para a microtomia lâminas

descartáveis em vez de facas.

Os micrótomos tem um mecanismo

pelo qual se pode controlar a espessura dos

cortes a serem obtido. Com raras exceções,

quanto mais fino o corte, melhor os

resultados. Em geral trabalha-se com cortes

entre 5 µm e 7 µm.

Ocasionalmente algumas técnicas exigem

cortes entre 10 µm à 15 µm. Os cortes assim

obtidos são dispostos em lâminas de vidro.

Há micrótomos para cortes de blocos

de parafina, de congelação e criostático.

Micrótomo de Parafina (Rotativo)

É um aparelho destinado a cortar

blocos de tecido incluídos em parafina ou

celoidina.

Os cortes poderão ter espessura

mínima de 1 µm, sendo que na prática

diária, são cortados com 5 µm de espessura.

Aplicações
A correta observação do material

biológico, em microscopia fotodinâmica,

implica uma série de procedimentos técnicos

prévios.

Estes procedimentos denominam-s e

técnicas histológicas, que são as seguintes:

Fixação

É o processo empregado com a

finalidade de se evitar que as células sejam

destruídas por suas próprias enzimas ou pela

ação das enzimas de bactérias

decompositoras. As substâncias que

executam o processo de fixação são

denominadas fixadores, e têm como principal

função desnaturar as proteínas e insolubilizá-

las, de modo a tornarem o tecido a ser

estudado mais rígido e com as suas

características estruturais preservadas.

Inclusão e corteVIII Encontro Latino Americano de Iniciação Cientifica e

IV Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba

180

Denomina-se inclusão ao

procedimento que tem como finalidade

impregnar os tecidos com uma substância de

consistência firme que permita, em etapa

posterior cortá-los em fatias finas para depois

corá-los, possibilitando assim a sua

visualização no microscópio.

Pelo fato de ser mais simples e dar

bons resultados, a quase totalidade das

inclusões é feita em parafina. A inclusão

conta de várias etapas: desidratação.

diafanização e impregnação.

Desidratação

A desidratação visa à substituição da

água ou do solvente aquoso do fixador por

um solvente não polar.

Diafanização

A clarificação tem como objetivo

remover o álcool, que substituíra a água no

interior dos tecidos, por um solvente que

seja, ao mesmo tempo miscível com álcool e

com a parafina.

Impregnação, Coloração e

Montagem

O xilol é substituído por parafina

fundida a 60°C.

A coloração tem por finalidade

aumentar o contraste entre os diferentes

elementos constituintes do tecido. A maioria

dos corantes comporta-se como base ou

ácido.

Objetivo

Conhecer a prática da utilização do

micrótomo, a identificação de suas limitações

e realizar cortes histológicos.

Materiais

Inclusora;

Banho-Maria;

Microscópio;

Parafina;

Amostra tecidual (fígado de rato);

Micrótomo.

Metodologia

Coletou-se uma amostra do material

a ser analisado.

Foram-se obtidos fragmentos do

tecido colhido, onde foram aparados para a

fixação.

Após a fixação do material, o mesmo

foi submetido a um processo de desidratação

crescente de álcool.

Realizou-se o processo de inclusão

em parafina e após um certo tempo obtevese blocos de parafina.

A seguir, esses blocos foram

colocados no micrótomo e obteve-se cortes

histológicos sucessivos.

Logo após, esses cortes foram

colocados em banho-maria a 37°C e

distendidos em lâminas para secagem.

Retirou-se a parafina do material com

o auxílio do Xilol, onde a amostra foi

submetida à hidratação em concentrações

decrescente de álcool.

O material submeteu-se a coloração

por hematoxilina.

Após desidratação em concentrações

crescente de álcool, o material está pronto

para ser analisado.

Resultados

Num total de 100 secções obtivemos

10 lâminas que apresentaram resultados

satisfatórios para sua posterior observação

microscópica. Utilizamos como material de

análise fígado de rato onde foi submetido a

cortes com espessuras que variam de 3 µm à

5 µm, onde o tamanho ideal para corte neste

tipo de tecido é de 3 µm devido sua

característica de coloração.

A espessura de corte e o tipo de

coloração varia conforme o tipo de tecido e

para qual finalidade ele está sendo

analisado.

Conclusão

Podemos concluir que quando o

micrótomo está regulado e com todas as

etapas de histologia realizadas de forma

adequada, ocorrem cortes com exata

precisão. Das 100 secções realizadas 10

lâminas foram preparadas onde seus cortes

variaram de 3 µm à 5 µm .

O micrótomo é útil para obtenção dos

cortes histológicos, porém, algumas

limitações são encontradas no

desenvolvimento desta técnica que

atribuímos ao aparelho, a parafina, com

http://www.inicepg.univap.br/cd/INIC_2004/trabalhos/inic/pdf/IC2-28.pdf