TEMA-22.

ASPECTOS CLÍNICOS DE LA ENZIMOLOGÍA

1. Determinación de actividades enzimáticas para

el diagnostico clínico
Mejor conocimiento molecular metabolismo
Desarrollo de métodos de análisis enzimáticas

2. Herramientas analíticas
Purificación de enzimas

3. Terapia enzimática
Industria Biotecnológica

8. Inhibidores enzimáticos (Fármacos)

Conocimiento estructural y funcional
 1. Determinación de actividades enzimáticas para el
diagnostico clínico
a) La enzima debe estar presente en fluido biológico
b) La enzima debe ser fácil de ensayar y automatizar la medida
c) Los valores de actividad entre individuos sanos y enfermos
deben ser significativos y debe haber buena correlación con los
valores patológicos.
d) La enzima debe ser estable

Tipos de fluidos: Suero (Más común) y Orina

LCF, Pleura, Sinovial, etc

 SUERO

1. Enzimas específicas

Enzimas su función radica en el plasma

Ej Enzimas de la coagulación, activación del complemento, metabolismo de lipoproteínas, etc

2. Enzimas no específicas

Enzimas que son secretadas por los tejidos.

Ej. Amilasas, lipasas, fosfatasas, etc.
Enzimas intracelulares.
Daño Tisular
Creatin quinasa 50.000 veces daño en el musculo.
Proliferación Celular (Neoplasia)
Aclaramiento renal deficiente
 Enzima específica de tejidos (Raro)
DIAGNOSTICO
-Abundancia relativa
Fosfatasa ácida (prostata), Acetilcolinesterasa (eritrocitos)

- Patrón de enzimas característico

- Isoenzimas (LDH, Creatin quinasa..

Ciencia forense:, Adenosina deaminasa, adenilato ciclasa, aminopeptidasa, fosfatasa ácida, etc.
ENZIMOLOGIA CLÍNICA DEL INFARTO DE MIOCARDIO

Pruebas enzimáticas : Evidencia de la producción de un infarto

Seguimiento del progreso y la recuperación tras cirugía

Creatina Quinasa
Aspartato aminotransferasa
Lactato deshidrogenasa
Concentración en tejido
Valor en plasma Velocidad del vertido
Grado de degradación

Vida media 10 –130 horas

Test depende del tiempo del infarto
Creatina Quinasa mas específica
LDH se puede diferenciar por electroforesis
Creatina quinasa
Músculo esquelético
Músculo cardiaco (Mayor concentración)
Cerebro
No en el hígado
Proteína dimérica: Hay dos tipos de monómeros M y B
Músculo M-M (99%) y M-B (1%)
Corazón MM (80-70%) y M-B (20-30%)
Cerebro B-B (100%)
Pequeño Infarto M-B (Actividad Total apenas cambia) Inmunoblotting (B)
Lactato deshidrogenasa
Hígado, Corazón
Inmunoblotting LDH-1
Uso de sustratos específicos LDH1/LDH2 = 0.85 Normal
>1 Enfermo

Transaminasas (ALT y AST)

Se utilizan poco actualmente

Hígado AST/ALT (3-5)
Corazón AST/ALT (20-25)
ENZIMOLOGIA CLÍNICA DE ENFERMEDADES HEPÁTICAS
Aspartato aminotransferasa (AST ó GOT)
Alanina aminotransferasa (AST ó GPT)
Fosfatasa alcalina
γ-Glutamil transferasa
Otras: Lactato deshidrogenasa, glutation transferasa, etc
Transaminasas

γ-Glutamil transferasa
Fosfatasa alcalina
4-nitrofenil fosfato Visible

Hepatitis
Enfermedades hepáticas
Crónicas
Cirrosis
Agúdas Tumores
Intermitentes Obstrucción del conducto biliar
 USO DE LAS PRUEBAS ENZIMOLÓGICAS
-Diagnóstico de enfermedades
-Seguimiento de tratamientos con fármacos (Higado metaboliza drogas)
-Seguimiento de operaciones hepáticas
TRANSAMINASAS
No específicas del plasma
Células parenquimales Necroticas (Hepatitis, cirrosis) Vertido al plasma
Hepatitis, cirrosis Progreso de la enfermedad

FOSFATASA ALCALINA
No específicas del plasma
Superficie sinusoidal del células hepáticas y del conducto biliar, Osteoblastos
ISOENZIMAS
Daños en las células del conducto biliar
Ratio Fosf.Alc/Transaminasas
Hepatitis 0,2-0,6
Obstrucción del 10-20
conducto biliar
 γ-GLUTAMIL TRANSFERASA

Alcoholismo crónico Cirrosis

Incremento síntesis y en la secreción

GLUTATION TRANSFERASA
Carcinogénicos
Cataliza reacciones de destoxificación Agentes de quimioterapia
utilizando glutation Paracetamol
Xenobióticos
Contenido alto 5%
Vida media corta 90 min
Marcador muy rápido y sensible de daño hepático

Tiempo de la Protrombina
Función hepática
Tiempo requerido para la activación de la protrombina en Trombina
Indica grado de funcionamiento hepático
Factores de la coagulación están producidos en el hígado y secretados a la
sangre

Trombina Cataliza el proceso de coagulación

 OTRAS ENZIMAS DE INTERES CLÍNICO
α-AMILASA
Páncreas
Glándulas salivares
Suero normal Baja actividad
Suero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30)
Diagnóstico es complicado sin la medida de la amilasa
Suero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30)
Amilasa detección en orina debido a bajo Peso Molecular

CREATINA QUINASA y FRUCTOSA BIFOSFATO ALDOLASA

Indicadores de desordenes en la musculatura esquelética

Creatina quinasa Músculo esquelético, cardiaco, Cerebro

Distrofia muscular, Daños en el músculo, ejercicio intenso,

infarto de miocardio, daño cerebral, etc
ISOENZIMAS

Fructosa bifosfato aldolasa Músculo esquelético (otros tejidos)

Significado clínico menor
Precaución (contaminación Glb rojos)
 FOSFATASA ALCALINA
Diagnóstico de obstrucción del conducto biliar
Enfermedades de huesos
Incremento actividad en células formadoras de huesos (Osteoblastos)
Osteomalacia
Raquitismo
Hiperparatiroidismo
Enfermedad denominada hipofosfatasia Actividad
Pirofosfatos inorgánico (substrato) Crecimiento cristales de hidroxiapatito
No estrictamente Isoenzimas Osteoblastos, Hígado, Intestino,
Placenta
Modificaciones Postraduccionales
Diferenciación Electroforesis muy complicado
Uso de inhibidores, Calor
FOSFATASA ACIDA
Localización Hígado, eritrocitos, PROSTATA, etc
Diagnostico de carcinoma de Próstata
Precaución en el muestreo - Lábil
- Contaminación con FA de eritrocitos

Diferenciación isoformas - Sensibilidad sustratos

- Uso de inhibidores específicos: Formaldehido
 2. HERRAMIENTAS ANALÍTICAS:
USO DE ENZIMAS PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN
DE METABOLITOS
Uso de la enzima para transformar un metabolito en un producto
el cual se pude determinar analíticamente

Ventajas
La enzima es muy específica Metabolito determinado en presencia de
otras sustancias
Evita la purificación necesaria en un análisis químico

Sustancias lábiles

Inconvenientes
El costo de la enzimas Inmovilización
Ureasa, Tripsina, Hexoquinasa
Inmoviliza en las paredes del tubo Análisis en continuo

Inactivación de las enzimas. Presencia de inhibidores, etc

 Puntos importantes para utilizar una enzima
1. La posición del equilibrio de la reacción. Deber ser unidirecional y rápido
Equilibrio no favorable
a) Acoplando la reacción a otra reacción enzimática

b) Trampas químicas. Ej. Glutamato deshidrogenasa

2. Utilizar gran cantidad de enzima

Depende de la Vmax y de la Km.

3. La especificidad de la enzima debe ser conocida

4. Pureza enzimática (reacciones colaterales)

 Determinación de glucosa
Test tolerancia a la glucosa Metabolismo de la glucosa

Métodos enzimáticos
1. Hexoquinasa acoplada con Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

NADPH Cambio 340 nm

Especificidad segundo paso
2. Glucosa oxidasa acoplada con Peroxidasa
Visible (Más utilizado)
Más interferencias productos
sangre
3. Glucosa deshidrogenasa

Determinación de ácido úrico

Diagnóstico de la gota
Método químico y enzimático Falta
Actualmente sólo se utiliza el especificidad
enzimático
Absorbancia (293 nm)
Alantoina; Consumo de O2
Acoplado a peroxidasa
(H2O2)
 Determinación de urea
Test de la función renal: Suero y orina Capacidad de filtración glomerular
Ureasa
UREA Carbonato amónico.
NH4 Acoplado con glutamato DH NADH
Determinación de colesterol y trigliceridos
Colesterol
Evaluar el riesgo de arterioesclerosis y de infarto de miocardio
Método químico (colorimétrico) No específico, contaminante
Esteresa
Colesterol
oxidasa
Peroxidasa
Absorción a 500 nm
Trigliceridos

Seguimiento: Diabetes
Mellitus, Nefrosis,
obstrucción biliar, etc
 Otros metabolitos
Creatina
Creatina quinasa, Piruvato quinasa y Lactato deshidrogenasa

Amonio Glutamato deshidrogenasa

Tiamina difosfato en eritrocitos

Ensayo enzimático usado para detectar una deficiencia en vitaminas
Ensayo diagnostica deficiencia en vitaminas

Malnutrición
Encefalopatía de Wernicke´s
Transquetolasa
Sujetos normales: Actividad no cambia al añadir Tiamina
Enfermos : Actividad al añadir Tiamina
 ENZIMA INMUNOENSAYO
Método indirecto para determinación de metabolitos, enzimas usadas para amplificar la señal

Hormonas, drogas,proteínas, etc Identifican con un anticuerpo.

Anticuerpos son unidos a una enzima: Fácilmente cuantificables

Peroxidasas
Fosfatasas. etc

Virus, cocaína, anfetaminas opiáceos, anfígenos frente a microorganismos patógenos, etc,

 3. Terapia enzimática
Principales áreas de trabajo - Eliminación de sustancias tóxicas de la sangre
- Enfermedades genéticas
- Cáncer

Degradación de tejidos necróticos usando enzimas proteolíticas (Tripsina, quimiotripsina,

Bromelaina, Hialuronidasa).

Eliminación de coágulos usando Estreptoquinasa, Uroquinasa, etc.

Tratamiento de insuficiencia pancreática (Fibrosis cística) utilizando proteasas inmovilizadas

Forma de administración

Eliminación de metabolitos (sangre)

Endógena: Estreptoquinasa

Exógena: Ureasa
Bilirrubina oxidasa
Posibilidad de usar enzimas inmovilizadas
 Tratamiento de Enfermedades genéticas

Enfermedades metabólicas. Deficiencias enzimáticas

Enfermedad de Gauchers Glucosilceramidasa

Acumula un glucocerebrosido en los macrófagos
Macrofagos no funcionales Anormalidades hepáticas, óseas, y hematológicas.
Tratamiento enzima de placentas humanas Alto coste Enzimas recombinantes

Pancreatitis
Extros pancreáticos (lipasas, proteasas, amilasas, etc) Microencapsulados pH 6 liberan

Fibrosis cística
Defecto genético proteína transmembrana (1/2000).
Mucosidad espesa , pulmones, estómago, etc
Conducto pancreáticos bloqueado Igual que pancreatitis
Tubos bronquiales Desosiribonucleasa (Mucosidad ADN y mucopolisacaridos).

Xeroderma pigmentoso
Defecto genético Individuos muy sensibles a la radiación UV
Defecto mecanismo reparador del ADN
Tratamiento enzimas reparadoras del ADN Aplicación tópica con liposomas
 Cáncer

Asparraginasa hidroliza la asparragina Leucemia aguda limfoblástica

Leucemia aguda granulocítica

Tumores Necesitan asparragina

Enzima en plantas, animales y bacterias
Ausente del suero de los mamiferos
Tratamiento en combinación con quimioterapia

Fuente es humana, microbiológica genera problemas de rechazo.

Glutaminasa Experimentación
Serina hidratasa posibles agentes
Fenilalanino amonio liasa
anticancerígenos

Leucina dehidrogenasa

Ciertos tipos de cáncer no tienen la capacidad de

sintetizar aminoácidos y los obtienen del suero
 Activación de prodrogas
Prodrogas son drogas químicamente modificadas y permanecen inactivas hasta
que son específicamente activadas.
Drogas anticancerosas inhiben etapas específicas de vías metabólicas
Metrotrexato análogo estructural del ácido fólico dihidrofolato reductasa
No se produce tetrahidrofolato Síntesis ADN
EVITAR TOXICIDAD EN CELULAS NO CANCEROSAS

Terapia enzimática prodroga dirigida por anticuerpos ADEPT

Terapia enzimática prodroga genética dirigida GDEPT

La enzima usada para activar la prodroga es dirigida hacia el tumor
en la forma de un gen unido a un vector
4. DETECCIÓN Y SIGNIFICADO DE DEFICIENCIAS ENZIMÁTICAS
Deficiencias enzimáticas debido a problemas genéticos
Más de 400 deficiencias

Identificación de un metabolito
Ej. Fenilcetonuria Fenilpiruvato
Biopsia del tejido y medida de la actividad
Pruebas en el ADN
FENILCETONURIA
Déficit de la Fenilalanina 4-mono-oxigenasa

Retraso mental Prevención dieta

Detección precoz es muy importante
 INHIBIDORES ENZIMÁTICOS (FÁRMACOS)

Inhibición de la hidroximetilglutaril CoA reductasa

Hipercolesterolemia familiar Niveles de colesterol en sangre

Inhibición de la xantina oxidasa

Gota Niveles de ácido úrico Metabolismo de las Purinas

Xantina Ácido úrico

Alopurinol Aloxantina SUSTRATO SUICIDA

Inhibidor muy fuerte de la X. Oxidasa
Inhibidores antiretrovirales
Enfermedad: HIV-1 causante del SIDA.
Enzima proteasa cataliza la ruptura de la
nhibidores de la proteasa.
poliproteína que encápsula el virus.
Necesarios para completar su proceso
de replicación dando lugar a nuevos
virus

Dimero de 99 aminoacidos
 Hidrólisis ácido-base: Aspartico proteasa

Centro activo en el centro

de la molécula

Inhibidores análogos del

substrato Cambio en el enlace
peptídico por un isoester
 Conclusiones

Medida de actividades enzimática en diagnóstico clínico

Enzimas estimación de metabolitos

Equipamiento más sofisticado gran automatización

Variedad de enzimas puras: Tecnología de ADN
Procesos tecnológicos:
Inmovilización, Radioinmunoensayo, Inmunoensayo, etc

Terapia enzimática Tecnología de ADN

Estudios estructurales Diseño de inhibidores