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provas bioquímicas - identificação de bactérias

provas bioquímicas - identificação de bactérias

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Categories:Types, Research
Published by: Larissa Beuttenmuller on May 02, 2011
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Microbiologia Médica 2006/2007 
 Aula Prática n.º 4 
Métodos de identificação e caracterização: principais provas bioquímicas; sistemasautomatizados.Outros métodos de identificação e caracterização de isolados: métodos imunológicos ede biologia molecular.
CULTURA DE MICRORGANISMOS - PROVAS BIOQUÍMICAS
Conhecer princípios e procedimentos de diversas provas bioquímicasusadas na identificação de microrganismos.
Analisar as provas bioquímicas realizadas (leituras directas e indirectas). TEXTO DE APOIO:
Provas fermentativas
Prova ONPG
Prova de Kligler (agar Kligler) ou agar Triple Sugar Iron (TSI)
Hidrólise do amido
Prova do sulfureto de hidrogénio (H
2
S)
Hidrólise da gelatina
Hidrólise da caseína
Prova IMViC
o
Prova do indol
o
Prova do vermelho de metilo
o
Prova de Voges-Proskauer
o
Prova da utilização do citrato
Descarboxilação da lisina
Desaminação da fenilalanina
Prova da redução dos nitratos
Prova da urease
Prova das oxídases
Prova da catálase
Prova da coagulaseACTIVIDADES BIOQUÍMICAS DOS MICRORGANISMOSOs microrganismos efectuam as suas variadas actividadesbioqmicas utilizando nutrientes obtidos a partir do ambiente que osrodeia. Essas reacções bioqmicas que ocorrem dentro ou fora dosmicrorganismos são catalisadas por enzimas.No laborario, é possível demonstrar algumas das actividadesbioquímicas através da observação da capacidade dos microrganismosusarem enzimas para degradar hidratos de carbono, lipidos, proteínas eaminoácidos. Geralmente, a metabolização destas moléculas orgânicasorigina produtos finais cuja deteão pode ajudar na caracterizão eidentificação dos microrganismos.
 
Microbiologia Médica 2006/2007 
H
IDRATOS
 
DE
 
CARBONO
Provas fermentativasAs fermentações são reacções bioquímicas produtoras de energia emque moléculas orgânicas servem como aceitadores e dadores de electrões.A capacidade dos microrganismos fermentarem hidratos de carbono e ostipos de produtos formados são úteis na sua identificação. Um determinadohidrato de carbono pode ser fermentado originando diferentes produtosfinais consoante o tipo de microrganismo envolvido. Estes produtos finais(álcoois, ácidos, gases ou outras moléculas orgânicas) são característicosdos microrganismos e podem ser usados para os identificar.Na fermentão, substratos como hidratos de carbono e álcooissofrem uma desassimilação anaeróbia, podendo ocorrer prodão decompostos orgânicos ácidos que podem ser acompanhados por gases, comohidrogénio ou CO
2
. Os microrganismos anaebios facultativos ogeralmente os chamados fermentadores de hidratos de carbono.A degradação fermentativa faz-se habitualmente num meio líquidoque contém nutrientes para suporte do crescimento do microrganismo, ohidrato de carbono específico que serve de substrato para determinar a suacapacidade fermentativa e um indicador de pH (ex. vermelho de fenol oupúrpura de bromocresol). Nesse caldo de fermentação existe também umtubo de Durham (pequeno tubo colocado em posição invertida dentro domeio de cultura líquido) que permite detectar a produção de gás.Após incubação, a libertação de compostos ácidos, resultantes dafermentação do hidrato de carbono, faz descer o pH o que conduz àmudança da cor original do meio, pois está presente um indicador de pH(reacção positiva). Em alguns casos, a produção de ácido é acompanhadapela produção de gás (CO
2
) que é visível, pois o meio líquido que estavadentro do tubo de Durham é substituído por gás em forma de bolhas. Nafermentação alcoólica ocorre produção de gás no tubo de Durham, mas omeio de cultura mantém a cor inicial.As culturas que não são capazes de fermentar o hidrato de carbononão conduzem à mudança de cor do meio nem apresentam produção de gás(reacção negativa). O facto de não ter havido fermentação do hidrato decarbono não significa ausência de crescimento, pois o microrganismo podeusar outros nutrientes do meio (ex. peptonas) como fonte de energia. Todas as culturas devem ser observadas às 24 a 48 h, uma vez queuma incubação prolongada pode mascarar a produção de ácido, pois ocorreprodução de substâncias alcalinas resultantes da acção enzimática sobreoutros substratos.São exemplos de provas para identificação de microrganismos asfermentações da glicose, lactose, sacarose, manose, inositol, sorbitol,arabinose, etc.Actividade da
β
-galactosidase (Prova ONPG)Alguns microrganismos, como a
Escherichia coli
, podem usar alactose como a sua única fonte de carbono. As enzimas essenciais aometabolismo deste hidrato de carbono são a
β
-galactosidase que hidrolisaa lactose, a galactose e glicose e uma permease que transporta a lactose
 
Microbiologia Médica 2006/2007 
através da membrana celular, tornando-a disponível para a
β
-galactosidase intracelular. Os verdadeiros não fermentadores da lactosenão possuem a
β
-galactosidase.Nesta prova, em vez de lactose, o substrato natural desta enzima,utiliza-se o substrato artificial ONPG (o-nitrofenil-
β
-D-galactopiranosídeo). A
β
-galactosidase catalisa a hidrólise do ONPG formando-se galactose e o-nitrofenol. O ONPG é incolor, mas após hidrólise origina o-nitrofenol, que éamarelo numa solução alcalina. Num tubo de ensaio contendo águadestilada inocula-se a bactéria, após esta ter sido semeada num meio comlactose, e um disco de ONPG e incuba-se a 37º C. Após 20 minutos a 1 horaverifica-se se ocorreu mudaa de cor de incolor para amarelo, casocontrário a incubação deve continuar até às 24 horas. Assim, se o tubo ficaramarelo é uma prova positiva para a actividade da
β
-galactosidase.Prova de Kligler Iron Agar ou de Triple Sugar Iron AgarEsta prova é, geralmente, usada para diferenciar os diferentesgéneros das
Enterobacteriaceae
e para distinguir esta família de outrosbacilos Gram negativo de origem intestinal. Esta diferencião é feitaatendendo às diferenças na fermentação dos hidratos de carbono presentesno meio e à produção de sulfureto de hidrogénio (H
2
S). Tanto o meio agar TSI (triple sugar iron) como o agar Kligler Ironcontêm glicose em pequena concentração (0,1%), lactose em concentraçãosuperior (1%), o indicador de pH, vermelho de fenol, para detectar aprodução de ácidos resultantes da fermentação dos hidratos de carbono,tiossulfato de sódio, substrato para a produção de H
2
S, e sulfato de ferropara a detecção desse produto final. A diferença entre estes dois meiosdiferenciais é que o TSI possui mais um açúcar, a sacarose, emconcentração igual à da lactose (1%).Ambos os meios são inoculados por picada, no cilindro e por estria, narampa. É essencial que as culturas sejam observadas após 18 a 24 h deincubação para evitar que os hidratos de carbono sejam completamenteutilizados e que ocorra degradação das peptonas, formando produtos finaisalcalinos. É na rampa que se faz a leitura da lactose e da sacarose, no fundodo cilindro a da glicose e no meio do cilindro a de H
2
S.Após incubação podem ser determinadas as actividadesfermentativas, a produção de gás e a produção de H
2
S, podendo ocorrervários resultados:Cilindro ácido (amarelo) e rampa alcalina (vermelha):Só a glicose foi fermentada. Os microrganismos degradam,preferencialmente, a glicose em primeiro lugar, mas como este substratoestá presente em concentração mínima, a quantidade de ácido produzida élimitada e é rapidamente oxidada na superfície da rampa. Por outro lado, aspeptonas do meio o também usadas na prodão de subsnciasalcalinas. No cilindro, a reacção ácida é mantida devido à tensão reduzidado oxigénio e ao crescimento mais lento dos microrganismos. O indicador,vermelho de fenol, muda para amarelo devido à persistência da formaçãode ácido no cilindro.Cilindro ácido (amarelo) e rampa ácida (amarela):Ocorreu a fermentação da lactose e/ou da sacarose, para além da glicose.Como as duas primeiras substâncias estão presentes em altasconcentrações são substratos para a actividade fermentativa contínua com

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