Enzim DNA ligase bekerja dengan menyambungkan utas DNA yang memiliki ujung 5′-PO4

dengan ujung 3′-OH pada utas lain. Mekanismenya bisa bermacam-macam, misalnya:

Ligation of Sticky Ends DNA (Image from wikipedia.org)

 Menyambungkan utas-utas DNA yang sama-sama memiliki ujung overhang hasil

pemotongan enzim restriksi. Ujung overhang ini harus saling komplemen agar dapat
menempel dengan baik. Ujung overhang pada utas sense akan berpasangan dengan ujung
overhang utas antisense. Lalu DNA Ligase tinggal membentuk ikatan phosphodiester
sehingga kedua utas kini sudah menjadi satu dengan ikatan yang sangat kuat. Mekanisme
ini cenderung lebih mudah karena kedua ujung overhang dapat menempel lebih dulu
karena memiliki sekuen yang saling komplemen.

Ligation of Blunt Ends DNA (Image from wikipedia.org with modification)

 Menyambungkan utas-utas DNA yang sama-sama memiliki ujung blunt hasil

pemotongan enzim restriksi atau hasil blunt PCR. DNA dengan ujung blunt lebih sulit
untuk ‘dilem’ dengan enzim DNA Ligase karena tidak ada ujung overhang yang
membantu kedua utas untuk saling menempel terlebih dulu sebelum ‘dilem’

http://sciencebiotech.net/bermain-dengan-gunting-dan-lem-dna/