LAPORAN PRAKTIKUM

PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO

NAMA : RIFA’ATUL MAHMUDAH M.

NIM : H 311 08 272
KELOMPOK : II (DUA)
HARI/TGL PERC. : SENIN/27 SEPTEMBER 2010
ASISTEN : NURLAIDA

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2010
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Protein merupakan polimer alami yang terdiri dari sejumlah unit asam

amino yang berikatan satu dengan lainnya lewat ikatan amida (atau peptida).

Peptida ialah oligomer dari asam amino yang memiliki peranan penting dalam

banyak proses biologis. Protein merupakan biomolekul yang sangat penting.

Beberapa fungsi protein adalah sebagai katalisator (enzim), pengangkut dan

penyimpanan, penyebab gerakan, pendukung sistem kekebalan, pembentuk dan

transmisi implus saraf, pengontrol pertumbuhan dan deferensasi, pendukung

kekuatan struktural, dan lain-lain. Protein ini disusun oleh asam-asam amino

yang juga mempunyai peranan penting dalam metabolisme zat hidup.

Seperti yang telah kita ketahui sebelumnya bahwa secara umum ada tiga

gugus yang reaktif pada asam amino yaitu gugus karboksil, gugus amino, dan

gugus rantai samping. Ketiga gugus ini dapat diidentifikasi melalui uji spesifik,

diantaranya adalah dengan melalui tes ninhydrin, dan sebagainya. Akan tetapi,

selain uji spesifik berdasarkan ciri khas reaksi kimianya, asam amino dapat pula

diidentifikasi bahkan dipisahkan dengan beberapa metode, salah satunya adalah

melalui kromatografi lapis tipis (KLT).

Pada kromatografi partisi, kertas digunakan sebagai pendukung air (fase

stasioner). Campuran komponen-komponen tersebut yang akan dipisahkan

ditempatkan pada fasa stasioner (zat padat), kemudian dihubungkan dengan fasa

mobile (zat cair), maka fasa mobile akan melalui fasa stasioner, sambil membawa
komponen-komponen tersebut, dimana perbandingan kecepatan perpindahan

komponen dengan kecepatan permukaan fasa mobile merupakan dasar untuk

mengidentifikasi komponen-komponen yang dipisahkan.

Berdasarkan teori inilah, maka dilakukanlah percobaan ini untuk

mengaplikasikan, membuktikan dan menguji kebenaran dari teori tersebut agar

dapat lebih mudah untuk dipahami dan dipelajari.

1.2. Maksud dan Tujuan Percobaan

1.2.1. Maksud Percobaan

Maksud dari percobaan ini adalah untuk mengetahui dan memahami cara

pemisahan dan identifikasi asam amino melalui metode kromatografi lapis tipis.

1.2.2. Tujuan Percobaan

Tujuan dilakukannya percobaan ini yakni:

1. Untuk menghitung nilai Rf dari asam amino alanin, glisin, serin, dan sampel.

2. Untuk mengidentifikasi jenis asam amino yang terkandung dalam sampel

berdasarkan nilai Rf.

1.3. Prinsip Percobaan

Identifikasi asam amino berdasarkan perbedaaan nilai Rf dengan

menggunakan metode kromatografi lapis tipis yang fase geraknya terdiri dari

campuran n-butanol, asam asetat, dan air.

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup

dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan dalam semua

sel dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi, ratusan jenis yang berbeda

dapat ditemukan dalam satu sel. Semua protein, baik yang berasal dari bakteri

yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari

rangkaian dasar yang sama dari 20 jenis asam amino yang berikatan kovalen

dalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai

samping yang khusus, yang memberikan sifat kimia masing-masing individu,

kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat dianggap sebagai abjad struktur

protein. Yang paling istimewa adalah bahwa sel dapat merangkai ke-20 asam

amino dalam berbagai kombinasi dan urutan, menghasilkan peptida dan protein

yang mempunyai sifat-sifat dan aktivitas berbeda. Dari unit pembangun ini

organisme yang berbeda dapat membuat produk-produk yang demikian bervariasi,

seperti enzim, hormon, lensa protein pada mata, bulu ayam, jaring laba-laba, dan

sebagainya (Lehninger, 1982).

Jika protein dimasak dengan asam atau basa kuat, asam amino unit

pembangunnya dibebaskan dari ikatan kovalen yang menghubungkan molekul-

molekul ini menjadi rantai. Asam amino bebas yang terbentuk merupakan

molekul yang relatif kecil, dan struktur masing-masing telah diketahui. Asam

amino yang pertama kali ditemukan adalah aspargin, pada tahun 1806 dan yang

paling terakhir adalah treonin, yang belum teridentifikasi sampai tahun 1983.
semua asam amino mempunyai nama biasa atau umum, yang kadang-kadang

diturunkan dari sumber pertama nama molekul ini diisolasi. Semua asam amino

yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, gugus karboksil dan

gugus amino diikiat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu

dengan yang lain pada rantai sampingnya, atau gugus R, yang bervariasi dalam

struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan di dalam air (Lehninger, 1982).

Kromatografi kertas merupakan salah satu jenis kromatografi partisi yaitu

pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaan kelarutan dalam dua pelarut yang

tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini

cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis

diteteskan sedikit pada kertas kromatografi pada titik tertentu dan kemudian ujung

kertas dicelupkan ke dalam pelarut tertentu. Pelarut ini akan naik berdasarkan

proses kapilaritas dan akan membawa senyawa-senyawa dalam campuran

tersebut. Asam amino yang mudah larut dalam pelarut tertentu itu, misalnya

pelarut organik, akan terbawa naik lebih jauh dari pada yang sukar larut. Setetlah

mencapai bagian atas atau garis akhir, kertas diangkat dari pelarut dan dibiarkan

mengering dengan sendirinya di udara. Dengan proses ini asam-asam amino akan

terpisah satu sama lainnya, dan dengan penyemprotan dengan pereaksi ninhidrin

pada kertas kromatografi tersebut akan tampak noda-noda biru yang membuktikan

adanya asam amino yang terpisah itu. Jarak yang telah ditempuh oleh suatua asam

amino tertentu (b) dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari

garis awal sampai garis akhir (a) diberi lambang R f (Poedjiadi dan Supriyanti,

2006).
 Ninhidrin merupakan reagen yang berguna untuk mendeteksi asam amino

dan menetapkan konsentrasinya dalam larutan. Senyawa ini merupakan hidrat dari

triketon siklik, dan bila bereaksi dengan asam amino, menghasilkan zat warna

ungu (Hart, dkk., 2003).

Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan olen Egan Stahl

dengan menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan

lapisan tipis. KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat juga merupakan

kromatografi partisi karena bahan penyerap telah dilapisi air dari udara. Sistem ini

segera populer karena memberikan banyak keuntungan, misalnya peralatan yang

diperlukan sedikit, murah, sederhana, waktu analisis cepat dan daya pisah yang

cukup baik. Sebagian besar dasar teori kromatografi kolom juga dapat diterapkan

pada KLT. Konsep “lempeng teori” lebih sukar digambarkan di sini, tetapi

jelaslah bahwa pemisahan itu dilakukan oleh keseimbangan bermuatan cuplikan

dalam dua fasa, satu diantaranya bergerak terhadap yang lainnya. Terjadi proses

penyebaran molekul cuplikan karena proses nonideal. Derajat retensi pada

kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai faktor retensi, R f (Soedjadi,

1988).

Jarak yang ditempuh senyawa terlarut

Rf =
Jarak yang ditempuh pelarut

Harga Rf yaitu b/a merupakan ciri khas suatu asam amino pada pelarut

tertentu. Dengan menggunakan standar asam-asam amino yang telah diketahui

macamnya pada kromatografi kertas seperti yang dilakukan di atas maka dapat

diketahui macam asam amino yang diperiksa. Penentuan macam asam amino
dapat pula dilakukan dengan menghitung harga Rf masing-masing asam amino,

dan dibandingkan dengan harga Rf asam amino yang telah ada (Poedjiadi dan

Supriyanti, 2006).

Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak

sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik

(ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun

(descending). Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan

lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan

yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih

sederhana dan dapat dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan

setiap saat secara cepat (Gandjar dan Rohman, 2007).

Selain untuk mengidentifikasi kandungan asam amino, metode

kromatografi lapis tipis juga digunakan untuk mengidentifikasi kandungan

senyawa yang terdapat di dalam tumbuhan. Analisa kromatografi lapis tipis

dilakukan untuk menentukan eluen yang akan digunakan pada kromatografi

lapis tipis preparatif. Noda memisah dengan baik setelah eluen yang

digunakan kloroform : heksan (8:1/2). Pemisahan terhadap ekstrak n-heksan

dengan pelarut kloroform terdapat tujuh noda yang terpisah dengan baik

sehingga pemisahan selanjutnya dilakukan secara kromatografi lapis tipis

preparatif. Pemisahan Secara Kromatografi Lapis Tipis Sebanyak 2,50 gram

ekstrak pekat n-heksan dilarutkan dalam 8 ml pelarut kloroform sehingga

ekstrak dapat larut sempurna. Cuplikan ini selanjutnya ditotolkan berupa garis

pada jarak 2 cm dari tepi bawah plat kromatografi lapis tipis. Plat

kromatografi lapis tipis dielusi dengan campuran pelarut kloroform : heksan

(8:1/2) dalam ruang pengembang (chamber). Plat yang sudah dielusi

dikeluarkan dari ruang pengembang dan pelarut dibiarkan menguap di udara

terbuka dan disinari dengan lampu UV (Nohong, 2009).

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-

macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa

gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa

cairan ataupun suatu padatan. Pada kromatografi padatan cair (LSC), teknik

kerjanya tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar

seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah satu

bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati atau dipak dengan partikel-

partikel micro or macro particulate or pellicular (berkulit tipis 37 -44 µ).Sebagian

besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapai partikel-partikel

microparticulate lebih kecil dari 20µ. Teknik ini biasanya digunakan untuk zat

padat yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini

terutama sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer (Putra, 2004).

TLC digunakan untuk memantau kemajuan reaksi dan untuk mengenali

komponen tertentu. Teknik ini sering dilakukan dengan lempengan gelas atau

plastik yang dilapisi fase diam. Fase gerak cair adalah pelarut. Campuran yang

akan dianalisis diteteskan pada dasar lempengan, dan pelarut akan bergerak naik

oleh gaya kapiler (Bresnick, 2004).

 BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1. Bahan Percobaan

Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini, antara lain eluen (n-

butanol : asam asetat : aquadest = 2,5 mL : 0,6 mL : 2,6 mL), larutan penyemprot

ninhidrin 2%, dan larutan asam amino (glisin 0,1 M, serin 0,1 M, alanin 0,1 M

dan larutan sampel), aseton, sabun, dan tissu roll.

3.2. Alat Percobaan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini antara lain chamber, kertas

kromatografi lapis tipis, botol semprot, pipa kapiler 0,5 L, gelas ukur 10 mL,

pipet volume 1 mL, pipet volume 5 mL, inkubator, pensil, selotip, dan penggaris.

3.3. Prosedur Percobaan

Eluen dibuat dengan cara dicampurkan n-butanol, asam asetat, dan air

dengan perbandingan 2,5 mL : 0,6 mL : 2,6 mL. Kemudian larutan eluen

dimasukkan ke dalam chamber dan ditutup rapat dengan selotip hingga chamber

jenuh dengan larutan eluen, kurang lebih selama beberapa menit. Kemudian

sebuah plat KLT dibuat garis dengan pensil sejauh kira-kira 1 cm pada bagian

bawah plat dan kira-kira 1 cm dari tepi atas plat. Selanjutnya, plat KLT

dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 90 oC selama 5 menit. Setelah itu,

plat KLT ditotolkan larutan asam amino (glisin, serin, alanin, dan larutan sampel)

dengan menggunakan pipa kapiler dengan jarak yang sama. Lalu, plat KLT

dimasukkan ke dalam chamber yang sudah jenuh dengan larutan eluen, tetapi

totolan larutan asam amino tidak boleh dicelupkan ke dalam larutan eluen. Elusi
dihentikan setelah eluen menempuh jarak yang telah ditentukan sebelumnya yaitu

garis ditandai dengan pensil. Plat KLT dikeluarkan dari chamber lalu dikeringkan

dalam inkubator. Dengan hati-hati, kertas disemprot dengan larutan ninhidrin 2%

kemudian dikeringkan di dalam inkubator kurang lebih pada suhu 60 oC selama

beberapa menit. Noda yang timbul diberi lingkaran dengan pensil. Diukur jarak

dari tempat totolan sampai ke noda yang terpisah. Dihitung Rf dari setiap noda.
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

Tabel 1

Noda Jarak Eluen (cm) Jarak noda (cm) Rf (cm)

Sampel X 3,3 0,5 0,15
Sampel Y 3,3 0,4 0,12
Serin 3,3 0,4 0,12
Alanin 3,3 0,6 0,18
Glisin 3,3 0,5 0,15

4.2. Pembahasan

Percobaan kali ini dilakukan untuk mengidentifikasi adanya larutan yang

mengandung asam amino dengan menggunakan teknik kromatografi lapis tipis,

yang melibatkan perhitungan nilai Rf dari masing-masing larutan yang

mengandung asam amino.

Pada percobaan ini kita menggunakan kertas kromatografi lapis tipis,

kertas harus kering agar mampu menyerap noda larutan sampel dengan baik,

proses penotolan dilakukan dengan menggunakan pipa kapiler karena sampel

yang akan dianalisis hanya dibutuhkan sedikit (uji kualitatif) serta dilakukan

secara hati-hati dan diusahakan noda tidak melebar di absorben, teknik double

spotting dilakukan agar ketelitian proses pengukuran Rf dapat ditingkatkan. Eluen

yang terdapat di dalam gelas merupakan campuran dari n-butanol, asam asetat,

dan air dengan perbandingan 2,5 mL : 0,6 mL : 2,6 mL. Campuran ini berfungsi

agar setiap asam amino dengan gugus yang berbeda dapat diidentifikasi. Adapun

dipilih campuran dari bahan tersebut karena memiliki perbedaan kepolaran

dengan urutan kepolaran yaitu air > n-butanol > asam asetat. Setiap asam amino

memiliki koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Asam amino

yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak (pelarut) yang lebih besar akan

tertahan lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut yang afinitasnya

terhadap fasa gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan

demikian asam amino dapat dipisahkan akibat perbedaan migrasi di dalam fasa

gerak dan fasa diamnya. Prinsip percobaan KLT ini didasarkan pada sifat fisik dan

kimia asam amino. Sifat fisik ditunjukkan oleh kecepatan bergerak pada fase diam

dari kertas kromatografi dan sifat kimianya berdasarkan pada warna yang timbul

ketika disemprot dengan larutan ninhidrin.

Pada percobaan ini proses elusi berjalan cukup lambat, namun karena

waktu yang sedikit, maka kertas diambil terlebih dahulu sebelum mencapai tanda

batas. Setelah kertas diangkat dari eluen, kemudian dikeringkan pada suhu kamar

dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin, maka akan muncul dua warna

dominan dalam identifikasi asam amino, yaitu ungu dan jingga yang merupakan

warna senyawa kompleks yang dibentuk oleh larutan asam amino dan sampel

yang diidentifikasi. Untuk memperjelas noda yang terbentuk maka absorben

dimasukkan ke inkubator dengan suhu 60°C, selama beberapa menit, kemudian

dilakukan proses pengukuran jarak eluen dan jarak noda dari tempat penotolan.

Dari percobaan dapat diketahui bahwa sampel X memiliki Rf yang hampir

sama dengan glisin yaitu 0,15, dapat diambil sebuah hipotesa bahwa sampel X

adalah glisin atau senyawa asam amino yang mempunyai gugus fungsi mirip

dengan glisin. Begitupun juga dengan sampel Y yang mempunyai nilai Rf hampir
sama dengan serin yaitu 0,12 maka dapat disimpulkan bahwa sampel itu adalah

serin.

Adapun kesalahan dalam percobaan ini yaitu nilai Rf yang tidak sesuai

dikarenakan pembuatan eluen yang tidak tepat perbandingannya atau mungkin

karena larutan yang sudah tidak murni. Selain itu, kami menggunakan data dari

kelompok kedua , hal ini karena cara memasukkan kertas kromatografi ke dalam

chamber tidak baik sehingga tanda batas juga terkena percikan eluen.

4.3. Reaksi

4.3.1. Serin

4.3.2. Glisin
4.3.3. Alanin
 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan percobaan yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa:

1. Nilai Rf asam amino glisin adalah 0,15, asam amino serin 0,12, asam amino

alanin 0,18, sampel X adalah 0,15, dan sampel Y adalah 0,12

2. Berdasarkan nilai Rf yang diperoleh, maka dapat diidentifikasi bahwa larutan

sampel X merupakan asam amino glisin dan larutan sampel Y merupakan

asam amino serin.

5.2. Saran
 Untuk praktikum sebaiknya larutan contoh yang diidentifikasi diperbanyak

agar dapat diketahui Rf dari asam amino selain glisin, serin dan alanin dan juga

gunakan teknik identifikasi dan pemisahan asam amino yang lain.

Untuk laboratorium agar kebersihannya tetap terjaga dan kalau bisa asam

amino yang disediakan beragam.

Untuk asisten kinerjanya sudah sangat baik dalam menjelaskan kepada

kami praktikannya tentang prosedur percobaan yang akan dilakukan, saya harap

dapat dipertahankan.
 DAFTAR PUSTAKA

Bresnick, S., 2004, Intisari Kimia Organik, diterjemahkan oleh Hadian Kotong,
Hipokrates, Jakarta.
Gandjar, I. G. dan Abdul Rohman, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta.
Hart, H., Craine, L. E., dan Hart, D. J., 2003, Kimia Organik: Edisi Sebelas,
diterjemahkan oleh Suminar Setiati Achmadi, Erlangga, Jakarta.
Lehninger, A. L., 1982, Dasar-Dasar Biokimia jiid 1, diterjemahkan oleh Maggy
Thenawidjaja, Erlangga, Jakarta.

Nohong, 2009, Jurnal Pembelajaran sains, Skrining Fitokimia Tumbuhan

Ophiopogon jaburan Lodd dari Kabupaten Kolaka Provinsi Sulawesi
Tenggara (online), 5(2), 175,
(http://jurnal.unhalu.ac.id/download/nohong/Skrining%20Fitokimia
%20Tumbuhan%20Ophiopogon%20jaburan%20Lodd%20dari
%20Kabupaten%20Kolaka%20Provinsi%20Sulawesi%20Tenggara.pdf,
diakses tanggal 28 september 2010, pukul 17.08 WITA).
Poedjiadi, A. dan Supriyanti F. M. T., 2006, Dasar-Dasar Biokimia edisi revisi,
UI-Press, Jakarta.

Putra, Effendi D. L., 2004, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang
Farmasi (online),
http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3616/1/farmasieffendy.pdf
(diakses tanggal 28 september 2010, pukul 08.47 WITA).
Soedjadi, 1988, Metode pemisahan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta.
Lampiran 1: Perhitungan Nilai Rf

Noda Jarak Eluen (cm) Jarak noda (cm) Rf (cm)

Sampel X 3,3 0,5 0,15
Sampel Y 3,3 0,4 0,12
Serin 3,3 0,4 0,12
Alanin 3,3 0,6 0,18
Glisin 3,3 0,5 0,15

Jarak noda daritempat penotolan

Rf =
Jarak yang ditempuh oleh pelarut

0,5
Rf = =0 , 15
1. Sampel X : 3,3

0,4
Rf = =0,12
2. Sampel Y : 3. , 3

0,4
Rf = =0 , 12
3. Serin : 3,3

0,6
Rf = =0 , 18
4. Alanin : 3,3

0,5
Rf = =0 , 15
5. Glisin : 3,3
Lampiran 2 : Bagan Kerja

Plat KLT

- Digunting dan diberi tanda

- Dikeringkan dalam oven untuk mengaktifkan lapisan tipis

- Ditotolkan larutan contoh dan sampel

- Dikeringkan

- Dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen (n-butanol : asam

asetat : air = 2,5 L : 0,6 mL : 2,6 mL) yang telah jenuh.

- Dielusi sampai tanda batas yang telah ditentukan

- Dikeluarkan dari chember dan dikeringkan

- Disemprot dengan larutan ninhidrin 2 %

- Dikeringkan dalam oven selama beberapa menit pada suhu 60 oC.

Noda

- Ditandai dengan diberi lingkaran dengan menggunakan pensil

- Diukur jarak noda dari tempat penotolan

- Diukur jarak tempuh eluen

- Dihitung nilai Rf-nya

Data
-
Lampiran 3: Daftar Nilai Rf 20 Asam Amino

Amino acid Rf value

alanine 0.38
arginine 0.20
asparagine 0.5
aspartic acid 0.24
cysteine 0.4
glutamine 0.13
glutamic acid 0.30
glycine 0.26
histidine 0.11
isoleucine 0.72
leucine 0.73
lysine 0.14
methionine 0.55
phenylalanine 0.68
Proline
0.43
not a true amino acid - shows up as yellow
serine 0.27
threonine 0.35
tryptophan 0.66
tyrosine 0.45
valine 0.61
 LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 1 Oktober 2010

Asisten Praktikan

( NURLAIDA) (RIFA’ATUL MAHMUDAH M.)