ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI DAUN KETELA POHON

(Manihot utilissiima Pohl)

1. Tujuan Praktikum

Dapat memahami dan dapat melakukan isolasi flavonoid dari daun ketela
pohon.

Dapat memahami dan dapat melaksanakan analisis kualitatif golongan senyawa

tersebut dengan metode kromatografi lapis tipis.

2. Dasar Teori Percobaan

Semua flavonoid, menurut strukturnya, merupakan senyawa induk flavon yang

terdapat berupa tepung putih pada tumbuhan Primula, dan semuanya mempunyai sejumlah
sifat yang sama. Saat ini dikenal sekitar 20 jenis flavonoid.

Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air. Mereka dapat diekstraksi dengan
alkohol 70% dan tetap ada pada lapisan air setelah ekstrak dikocok dengan eter minyak bumi.
Flavonoid berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila di tambah basa atau
amoniak, jadi flavonoid mudah dideteksi pada kromatogram atau dalam larutan.

Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonyugasi dan karena itu

menunjukan pita serapan kuat pada spektrum UV dan spektrum tampak. Flavonoid umumnya
terdapat dalam tumbuhan, terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid.

Flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan berpembuluh tetapi beberapa kelas lebih
tersebar daripada yang lainnya. Penyebaran flavonoid meliputi,

Golongan Tumbuhan Flavonoid

Bakteri Hampir tidak ada sama sekali
Fungi
Ganggang merah
Lumut hati Sedikit tipe flavonoid, terutama 3-
 deoksiantosianin, glikoflavon
Equisetum Flavonoid berstruktur sederhana, 3-
Lycopodium deoksiantosian, flavon, flavonol,
Paku-pakuan leukoantosianidin, kalkon dan flavanon.
Gymnospermae Kebanyakan flavonoid, biasanya tipe
sederhana, biflavonil
Angiospermae Segala macam flavonoid, biflavonil
jarang

Flavonoid terdapat dalam tumbuhan sebagai campuran, jarang sekali dijumpai hanya
flavonoid tunggal dalam jaringan tumbuhan. Disamping itu, sering terdapat campuran yang
terdiri atas flavonoid yang berbeda kelas. Antosianin berwarna yang terdapat dalam daun
bunga hampir selalu disertai oleh flavon dan flavonolol tanwarna.

Flavonoid mempunyai rumus umum, C6C3C6.

Aktivitas biologi flavonoid antara lain,

- anti kanker : kuersetin, mirisetin

- anti oksidant : kuersetin, antosianidin, dan prosianidin

- anti inflamasi : apigenin, taksifolin, luteolin, kuersetin

- anti alergi : nobeletin, tangeretin

- anti hipertensi : prosianidin

- anti virus : amentiflavum, skutellarein, kuersetin

Klasifikasi flavonoid umumnya didasarkan atas inti molekul,

*Harbone membagi flavonoid kedalam kelompok

- Antosianin

- Proantosianidin

- Flavonol
 - Flavon

- Khalkon dan auron

- Flavanon

- Glikoflavon

- Isoflavon

- Biflavonil

*Berdasarkan warna flavonoid

*Berdasarkan flavonoid major dan flavonoid minor

- flavonoid major : flavon, flavonol, biflavonil

- flavonoid minor : khalkon, dihidrokhalkon, auron, flavanon, flavononol dan isoflavon.

Hampir setiap tumbuhan tingkat tinggi menunjukkan pola khas glikosida flavon dan
flafonol dalam daun atau bunga. Senyawa tersebut merupakan penanda taksom idel dalam
pengkajian masalah penggolongan tumbuhan, penghibridaan, atau fitogeografi. Walaupun
banyak yang dipelajari dengan membandingkan pola bercak flavonoid dalam kromatogram
dua arah dari ekstrak 2 jenis tumbuhan yang berbeda, atau dari populasi tumbuhan, tetapi
tetap perlu diidentifikasi komponen utama yang ada. Ini dapat dilakukan dengan
menggunakan sederetan cara fitokimia sederhana, dan untuk mempelajari cara ini dianjurkan
pertama-tama pada flavonoid yang sudah dikenal, yaitu rutin yang merupakan glikosida
kuersetin.

Rutin atau kuersetin 3-rutinosida pertama kali diisolasi dari Fagopyrum esculentum
dan sampai sekarang tumbuhan ini masih tetap digunakan. Tidak dapat diragukan lagi bahwa
dari semua glikosida kuersetin, rutin paling luas penyebarannya dan mungki terdapat pada 25
% dari flora setempat. Sumber yang mudah diperoleh termasuk bunga Magnolia, Viola,
Aesculus hippocastanum, Nicotiana tabacum (daun tembakau), Rheum, teh, dan Phaseolus
vulgaris. Bahan tumbuhan yang diperoleh dari sumber tersebut di atas harus dikumpulkan da
diekstraksi oleh etanol 95 % panas (jaringan segar) atau etanol 70 % (jaringan kering) selama
30 menit, lalu ekstrak dipekatkan sampai volumenya tinggal sedikit.

Kuersetin 3- rutinosida

Kuersetin merupakan salah satu flavonoid yang banyak terdapat di alam dan diketahui
mampu menghambat enzim sitokrom P-450 yang berperan dalam metabolisme parsetamol.
Hasil penelitian menunjukkan kadar parasetamol dalam darah tidak dipengaruhi oleh dosis
kuersetin yang diberikan. Derajat nekrosis hati karena pemberian parasetamol dosis toksik
lebih rendah pada pemberian kuersetin 750 mg/kg BB (p<0,05). Kuersetin dosis 750 mg/kg
BB dapat menghambat aktivitas sitokrom P-450 yang tinggi karena parasetamol dosis toksik
(p<0,05). Dari hasil penelitian dapat disimpulkan kuersetin dosis 750 mg/kg BB dapat
menurunkan efek hepatotoksik parasetamol, dan menurunkan aktivitas enzim sitokrom P-
450.

Pergeseran spektrum UV dan spektrum tampak pada rutin

Larutan λmax (nm) Pengaruh pada Diagnosis

Etanol Spektrum Struktur

Pita I Pita II Pita III
Etanol 259 366 363 Geser hipsokrom 12 nm 3-OH
bh dibandingkan dengan kuersetin (pita tersulih
III 375 nm)
Ditambah 2 tetes 272 327 415 Geser batokrom 52 nm (pita III) 4’-OH bebas
NaOH 2M
Ditambah 2 tetes 275 303 433 Geser batokrom 70 nm (pita III) 5-OH bebas
AlCl3 5% bh
Ditambah serbuk 271 325 393 Pergeseran 12 nm pada pita I 7-OH bebas
NaOAc
Ditambah NaOAc 262 298 387 Geser batokrom 20 nm (pita III) 3’,4’-diOH
dan H3BO3 bebas

3. Materi dan Metode

Alat dan Bahan

- Hot plate 1 buah

- Erlenmeyer 1000 ml 1 buah

- Batang pengaduk 2 buah

- Corong 2 buah

- Gelas kimia 100 ml 1 buah

- Water bath 1 buah

- Tabung reaksi 1 buah

- Lempeng KLT secukupnya

- Kapas secukupnya

- Alumunium Foil secukupnya

- Corong Pisah 250 ml 1 buah

- Cawan porselin 2 buah

- Pipa kapiler 2 buah

- Lampu UV-Vis 1 buah

- Serbuk daun singkong kering 40 gram

- Aquadest 300 ml
- Etanol 96% dingin secukupnya

- HCl 2 N 10 ml

- Dietil Eter 75 ml

- Metanol 2 ml

- Natrium Sulfat Anhidrat 3 gram

Prosedur Kerja

- 40 gram serbuk daun singkong kering ditimbang dan dimasukan kedalam

Erlenmeyer 1000 ml

- Ditambahkan aquadest sebanyak 300 ml kedalam Erlenmeyer tadi,

dipanaskan dengan hotplate selama 45 menit.

- Cairan disaring dengan menggunakan kapas dengan bantuan corong, dan

selanjutnya disaring kembali dengan kertas saring.

- Dimasukan kedalam lemari pendingin hingga terbentuk kristal rutin.

- Jika rutin telah terbentuk, saring larutan dengan menggunakan kertas saring.

- Endapan yang didapat dicuci dengan etanol dingin, endapan terdapat dan
kertas saring dikeringkan dengan oven pada suhu 400 C selama 3 jam.

- Endapan diambil dengan spatel kecil, dan dilarutkan dalam 2 ml campuran

metanol dan air sama banyak (sari I).

- Sisa padatan dimasukan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml HCl

2 N.

- Diatas tabung ditempatkan corong berisi kapas untuk mengurangi penguapan.

Selanjutnya tabung tersebut dipanaskan dalam waterbath selama 1 jam.
 - Cairan hasil hidrolisis tersebut dimasukan kedalam corong pisah.
Ditambahkan dietileter sebanyak 25 ml dikocok dengan hati-hati, kedua
lapisan yang terbentuk dipisahkan.

- Lapisan air asamnya dikocok lagi dengan dietileter sebanyak 25 ml selama 3

kali pengocokan.

- Lapisan eter hasil ekstraksi 1,2 dan 3 dicampurkan lalu disaring melalui
kertas saring yang berisi 3 gram Natrium sulfat anhidrat. Cairan yang
diperoleh lalu diuapkan dalam lemari asam.

- Residu yang diperoleh dilarutkan dengan 2 ml methanol (Sari II)

- Totolkan sebagai titik A adalah Sari I dan titik B adalah Sari II.

- Eluasi dengan n-heksan – etilasetat dengan perbandingan 7:3.

- Hasil yang diperoleh disemprot dengan penampak bercak uap amoniak.

- Dan dibaca dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 254 dan 366
nm.

4. Hasil Pengamatan

 Massa kristal rutin (tidak murni) yang didapat dari 40 gram daun singkong adalah,

Massa vial + rutin = 10,9312 gr

Massa vial kosong = 7,9043 gr

Massa kristal rutin adalah 10,9312 gr - 7,9043 gr = 3,0269 gr

 Rendemen = [3,0269 gram / 40 gram] x 100%= 7,56%

 Hasil pengamatan lempeng KLT dengan sinar UV panjang gelombang 254 nm

 Didapatkan Rf sebesar = 2,6 / 4,1 = 0,63

Nilai Rf untuk aglikon (kuersetin)

5. Pembahasan

Pada praktikum kali ini adalah untuk mengisolasi rutin (flavonoid-3-glikosida)

sebagai salah satu jenis glikosida flavonoid (glikosida flavonol) yang terkandung dalam daun
singkong/ketela pohon. Glikosida flavonoid termasuk rutin merupakan salah satu metabolit
sekunder yang bersifat polar, termasuk kedalam kelompok glikosida O (molekul gula
berikatan dengan O-aglikon). Rutin daun singkong (satu zat aktif) sebagai bahan obat-obatan
dan kosmetik, serta jadi zat pengatur tumbuh tanaman.

Karena sifatnya yang polar maka pengisolasian rutin dilakukan dengan penggunaan
pelarut polar yaitu air, dengan penggunaan air yang kemudian dipanaskan membuat semua
senyawa polar tertarik bersama filtrate. Hal ini merupakan salah satu kerugian penggunaan
air sebagai pelarut karena, banyak sekali komponen-komponen polar yang dapat larut
bersama air.

Filtrate yang diperoleh diuapkan hingga didapat filtrate kental dan disimpan dalam
lemari pendingin untuk mempercepat pembentukan kristal rutin dan mencegah terjadinya
penjamuran. Karena dengan media air memungkinkan timbulnya jamur atau bakteri jika
disimpan di suhu ruang.

Endapan yang diperoleh disaring dan dicuci dengan menggunakan etanol dingin
dengan maksud agar kemurnian filtrate bertambah dan terbebas dari pengotor-pengotor yang
tidak ingin diisolasi, tetapi dengan pencucian ini tidak menyebabkan kristal larut.

Sebagian dari endapan ditambahkan HCl untuk proses hidrolisis dimaksudkan agar
glikosida flavonoid rutin terhidrolisis sehingga aglikon flavonoid (kuersetein) terpisah
dengan molekul gulanya. Kuersetin ini termasuk aglikon flavonoid (zat bukan gula) yang
berdasarkan strukturnya dapat digolongkan menjadi flavonol, kuersetin mempunyai khasiat
sebagai antiinflamasi, antikanker dan antioksidant.

Setelah dihidrolisis, larutan dipartisi dengan pelarut eter dengan menggunakan corong
pisah, eter digunakan karena memiliki kepolaran yang sama dengan aglikon flavonoid
(kuersetin). Maka seluruh senyawa kuersetin akan tertarik kedalam pelarut eter, ekstraksi
dilakukan sebanyak 3 kali untuk memaksimalkan pengisolasian. Seluruh fase eter yang
dicampur disaring dengan tambahan Na sulfat anhidrat agar molekul air yang ada dalam eter
dapat tertarik, sehingga larutan benar-benar murni eter dan aglikon flavonoid. Fase eter ini
diuapkan dan selanjutnya residu yang ada ditambahkan methanol sebagai pelarut (sari II)
untuk dilakukan KLT.

Proses hidrolisis rutin menjadi kuersetin berjalan menurut reaksi berikut:

HCl
Hidrolisis

Rutin Kuersetin Glukosa

Sisa endapan yang tidak dihidrolisis juga dilarutkan dengan methanol untuk
selanjutnya di KLT bersama dengan sari II, dan Rf yang dihasilkan dapat dibandingkan dan
dapat terlihat proses hidrolisis berjalan dengan sempurna atau tidak.

Sari I dan sari II dilakukan pengujian dengan KLT menggunakan eluen etanol 96%.
Dengan digunakannya eluen yang bersifat polar maka senyawa polar akan terelusi lebih dulu
dan memiliki Rf yang lebih tinggi, dibandingkan dengan senyawa non-polar ataupun
semipolar. Pada KLT ini yang diuji adalah senyawa polar yaitu glikosida flavonoid (rutin)
dan senyawa non-polar yaitu aglikon glikosida (kuersetin).

Dari hasil KLT ini, kedua senyawa terelusi dan pada titik B ada senyawa yang tidak
terelusi dan tetap berada pada dasar lempeng KLT, hasil ini menunjukan adanya kuersetin
yang sudah terpisah dari rutin, tetapi karena kedua spot terelusi maka hidrolisis yang
dilakukan tidak berjalan dengan sempurna, ataupun ada pengotor lainnya yang terelusi
dengan pelarut polar.

Pada penelitian sebelumnya terhadap pemeriksaan kadar rutin pada daun singkong
(Manihot utilissima Pohl.) muda, tua dan kuning. Secara KLT-spektrofotodensitometri kadar
rutin daun singkong muda adalah 0,71% (b/b), daun singkong tua 0,35%(b/b) dan daun
singkong kuning 0,16%(b/b) dan secara gravimetri kadar rutin daun singkong muda adalah
0,56% (b/b), daun singkong tua 0,32%(b/b) dan daun singkong kuning tidak terdeteksi. Telah
dilakukan pula isolasi rutin dari daun singkong muda dengan cara maserasi dengan natrium
hidroksida 1% dan rutin yang didapat dari maserasi ini adalah 0,027% (b/b).

Pada praktikum kali ini digunakan daun singkong yang sudah agak tua sehingga kadar
yang didapat tidak maksimal. Dan untuk terbentuknya kristal rutin dibutuhkan waktu yang
sangat lama sekali kurang lebih selama 2 minggu. Dan kristal rutin yang terbentuk sangat
sedikit sekali, dan tercampur dengan endapan lainnya.

6. Kesimpulan

Rutin merupakan salah satu jenis glikosida flavonoid yang bersifat polar, sehingga
dapat diekstraksi dengan pelarut polar, seperti air, methanol atau etanol. Filtrate yang didapat
dari hasil penyarian didinginkan untuk mempercepat pembentukan kristal.

Pemisahan aglikon dan glikosidanya dapat dilakukan dengan hidrolisis asam, seperti
menggunakan HCl. Akan didapat hasil berupa kuersetin dan glukosa dari hidrolisis rutin.

Analisa dari aglikon dan glikosida ini dapat dilakukan dengan menggunakan
kromatografi lapis tipis, dan menggunakan eluen tertentu sesuai dengan kepolaran senyawa
yang dianalisa.

Daftar Pustaka
Harbone, J.B. 1987. Metode Fitokimia penuntun cara modern menganalisis
tumbuhan terbitan kedua. Bandung: ITB.

Markham, K.R. 1988 .Cara mengidentifikasi Flavonoid. Bandung: ITB.