1

Isolasi, Purifikasi, Kinetika, Dan Karakterisasi Enzim Invertase

Saccharomyces cerevisiae

Anggun Widya Ninggar (G84070034)1, Amelinda2, dan Waras Nurcholis3

Mahasiswa Praktikum1, Asisten Praktikum2, dan Dosen Praktikum3
Pengantar Penelitian Biokimia
Departemen Biokimia, FMIPA, IPB
2010

ABSTRAK
Invertase merupakan katalis pada hidrolisis sukrosa menghasilkan glukosa dan fruktosa (gula invert).
Praktikum ini bertujuan mengisolasi dan mempurifikasi enzim invertase dari ragi, menentukan aktivitas
dan kuantitas protein enzim invertase menggunakan assay Nelson dan metode Lowry, menentukan nilai
Km dan Vmaks dari enzim invretase melalui study kinetika, dan mengkarakterisasi enzim invertase
berdasarkan bobot molekul, pengaruh suhu, dan pengaruh pH. Assay Nelson berprinsip pada
pengukuran jumlah gula pereduksi. Pada metode ini aktivitas enzim invertase ditunjukkan oleh
bertambahnya produk reaksi (glukosa dan fruktosa) atau berkurangnya substrat (fruktosa/ satuan
waktu). Metode Lowry didasarkan pada reaksi Biuret dan reduksi reagen arsenomolibdat menghasilkan
warna biru. Hasil optimum karakterisasi enzim invertase amobil diperoleh pada kadar Na-alginat 5 gr,
konsentrasi substrat (sukrosa) 0,5 M, pH 4,5, dan suhu 30 oC. Pengukuran aktifitas enzim invertase
dilakukan dengan metode spektrofotometri menggunakan reagen Nelson. Dari hasil pengukuran
diperoleh aktifitas enzim invertase terbesar pada fraksi I sebesar 1.2256 unit/menit, kadar protein
terbesar pada fraksi II sebesar 0,0255 mg/mL, fold enzim dan yield enzim berturut-turut adalah 931,49%
dan 90,14%. Sedangkan Nilai konstanta Michaelis, Vmaks = -1,0940 µmol/mL. menit dan Km = -1,8818
mM.

PENDAHULUAN dan kerangka karbon, sukrosa juga berperan dalam

Indonesia merupakan negara yang memiliki
sumber daya alam yang melimpah, baik hayati atau
non-hayati. Tetapi masih banyak sumber daya
alam yang belum dimanfaatkan secara maksimal
oleh masyarakat, padahal sumber daya alam
tersebut sangat berpotensi untuk dimanfaatkan
lebih optimal lagi. Mikroorganisme merupakan
salah satu sumber daya alam yang bisa dirasakan
manfaatnya dalam kehidupan. Beberapa macam
mikroorganisme dapat menghasilkan enzim adalah
khamir, fungi, dan bakteri. Diantaranya yang
paling lazim adalah khamir Saccharomyces
cerevisiae yang merupakan mikroorganisme paling
komersial saat ini. Penggunaan S. cerevisiae
sebagai pabrik etanol telah banyak dikembangkan
di beberapa negara, seperti Brasil, Afrika Selatan,
dan Amerika Serikat. Khamir lebih banyak
digunakan untuk memproduksi alkohol secara
komersial dibandingkan dengan bakteri (Narita
2005).
Invertase, dikenal sebagai β-
fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26)
merupakan sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa
yang menghasilkan fruktosa dan glukosa (gula
invert). Sukrosa merupakan produksi akhir
asimilasi karbon (C) pada proses fotosintesis yang
terjadi di daun (Kim et al. 2000) dan bentuk
karbohidrat yang mudah ditransporta-sikan ke
jaringan simpan atau sink tissues (Cheng et al.
1996). Selain berfungsi dalam penyediaan energi
pengaturan ekspresi gen lainnya (Koch, 1996;
Ohto et al., 2001), partisi karbon asimilate (Lunn
& Hatch 1997; Grof et al. 1998) serta
pertumbuhan dan perkembangan tanaman (Fung et
al, 2003).
Enzim invertase banyak ditemukan pada
ragi roti yang mengandung khamir Saccharomyces
ceriviseae. Invertase diproduksi oleh bakteri,
fungi, tumbuhan tingkat tinggi, dan beberapa sel
hewan (Lee Huang et al. 2000). Tetapi banyak
penelitian dilakukan pada produksi invertase yang
dihasilkan oleh khamir Saccharomyces cereviceae.
Khamir ini banyak terkandung pada ragi roti, dan
secara komersil banyak dijual dipasaran. Yeast
merupakan mikroorganisme uniseluler berbentuk
ellips, bulat atau silindris, yang ukurannya 5-10
kali lebih besar dari bakteri. Ragi ini banyak
digunakan dalam pembuatan bir dan roti serta
dikenal pula sebagai suplemen makanan karena
kaya akan vitamin.
Enzim invertase banyak digunakan dalam
industri fermentasi karena berfungsi sebagai
katalis dalam hidrolisis sukrosa menjadi glukosa
dan fruktosa (gula invert/gula pereduksi).
Kemampuan enzim dalam mengkatalisis reaksi
kimia dipengaruhi oleh kondisi lingkungan yang
meliputi pH, suhu, waktu inkubasi, dan konsentrasi
substrat. Enzim invertase yang dihasilkan oleh
Saccharomycees ceriviceae mempunyai aktivitas

paling tinggi pada pH 4,5 dan temperatur 30ºC
(Bergamasco et al. 2000).
Setiap enzim mempunyai nilai tetapan
Michaelis-Menten tertentu, dimana nilai K m dapat
digunakan untuk memperkirakan jumlah substrat
yang diperlukan agar reaksi enzimatis berjalan
efisien. Dengan mengetahui nilai Km dan Vm suatu
enzim, maka dapat dilakukan optimalisasi
penggunaan enzim tersebut sebagai biokatalisator
reaksi pemecahan substrat menjadi produk. Laju
reaksi meningkat saat suhu mencapai nilai
optimum dan berkurang saat suhunya maksimum.
Sedangkan aktivitas enzim akan meningkat dengan
meningkatnya kadar substrat (Lehinger 1982).
Pemanfaatan enzim secara komersial terus
dipelajari dan diterapkan yaitu pemanfaatan enzim
untuk proses enzimatik pada industri makanan,
minuman, farmasi, dan biokimia. Salah satu
contoh pemanfaatan tersebut adalah pematangan
buah-buahan hijau yang dipanen, pelayuan daging,
pengawetan keju, pencegahan kekeruhan bir, dan
pembentukan tekstur gula. Sedangkan
pemanfaatan enzim invertase banyak dilakukan
dalam industri makanan dan minuman khususnya
pada pengolahan selai, permen, produk gula-gula,
dan produksi asam laktat dari fermentasi sirup tebu
(Acosta et al. 2000).
Invertase juga digunakan untuk
memproduksi etanol dari sukrosa sebagai sumber
karbon (Lee Huang 2000). Adanya isu sosial dan
fakta akan terbatasnya sumber bahan bakar fosil
telah menstimulasi upaya penggunaan dan
pengembangan bahan bakar alternatif yang
renewable dan ramah lingkungan. Produksi etanol
melalui fermentasi mikroba dianggap sebagai
metode alternatif sumber energi bahan bakar fosil
dikarenakan keunggulannya, yaitu rendahnya
biaya produksi, persentase rendemen yang tinggi,
prosesnya relatif lebih cepat, penanganannya
sederhana, dan produk samping yang relatif lebih
sedikit serta aman bagi lingkungan (Narita 2005).
Secara umum enzim larut dalam air,
sehingga banyak enzim tidak ekonomis untuk
digunakan pada pengoperasian tipe batch dalam
skala besar di industri, karena hanya dapat
digunakan satu kali proses dengan biaya yang
cukup mahal. Tetapi dalam tahun-tahun
belakangan ini berbagai teknik telah ditemukan
untuk memperbaiki kerja enzim, yaitu dengan cara
mengikatkan enzim pada bahan-bahan yang tidak
larut dalam air, dimana bahanbahan tersebut dapat
dipisahkan dari produk dengan mudah. Hal itu
memungkinkan penggunaan kembali bahan-bahan
tak larut yang mengandung enzim tersebut. Teknik
ini disebut dengan amobilisasi enzim. Teknik
amobilisasi pada enzim merupakan suatu teknik
yang dapat meningkatkan kemampuan hidup
enzim sehingga dapat digunakan kembali. Teknik
2
tersebut merupakan metode terbaik untuk
mengurangi pengeluaran biaya dalam proses
enzimatik secara kontinu khususnya dalam industri
makanan dan minuman (Bucke 1987).
METODE PERCOBAAN
Waktu dan Tempat
Praktikum dilakukan selama 6 minggu yaitu
2 Maret - 27 April 2010. Tempat pelaksanaannya
di Laboratorium Pendidikan Departemen
Biokimia, FMIPA IPB.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum
ini antara lain mortar, sentrifus, refrigerator
Sorvall, rotor SS-34, pipet pasteur, bulb, tabung
sentrifus 50 mL, inkubator, gelas ukur, gelas piala
100 dan 600 mL magnetic stirer, tabung reaksi
bertutup, waterbath, vortex, spektrofotometer
UV/VIS, stopwatch, dan mikropipet, pipet kaca,
pipet stirer, magnetic stirer, seperangkat peralatan
SDS-PAGE.
Bahan-bahan yang digunakan yaitu ragi
(Saccharomyces cerevisiae), pasir/ glassbead,
toluen, akuades, asam asetat1N, parafilm,
amonium sulfat, 4mM glukosa, 4 mM fruktosa,
Reagen arsenomolibdat, bufer asetat 0.2 M pH 4.5,
bufer tris-HCl 0.05 M pH 7.3, reagen A (2%
Na2CO3 dalam NaOH 0.1 N), reagen B (2.7%
sodium potasium tartrat), reagen C (1% CuSO4
dalam H2O), reagen D (reagen folin Cioucalteou
yang telah diencerkan dengan air sampai 1 N
dalam asam, harus dibuat fres), fraksi enzim
invertase I, II, III, sukrosa 0.5M, H2O, reagen
Folin Wu, larutan monomer, 4x running gel bufer
(1.5 M Tris-Cl pH 8.8), 4x stacking gel bufer (0.5
M Tris-Cl pH 6.8), 10% SDS, 10% amonium
persulfat, 2x treatment bufer (0.125M Tris-Cl, 4%
SDS, 20% v/v gliserol, 0.2 M DDT, 0.02%
bromfenol blue, pH 6.8), tank bufer (0.025M Tris,
0.192M glisin, 0.1% SDS, pH 8.3), water saturated
n-butanol, TEMED, standar BM protein campuran
(marker), larutan fikasasi (25% isopropanol, 10%
asam asetat) dan larutan pewarna commassie blue
(0.06 commassie blue G-250, 10% asam asetat).
Prosedur Percobaan
Isolasi Invertase Ragi
Ekstraksi invertase ragi. Ragi ditimbang
10 gram dan sejumlah glass bead (2-3 gram)
dimasukkan ke dalam mortar. Setelah itu
ditambahkan 10 mL toluen ke dalam mortar
tersebut, gerus sedikit demi sedikit hingga
membentuk pasta yang halus, lalu ditambahkan 20
mL akuadessecara bertahap selama 30 menit,
dilanjutkan dengan penggerusan setiap
penambahan. Seluruh isi mortar dipindahkan ke

dalam tabung sentrifus 50 mL laulu sentrifugasi
selama 15 menit, 12000 rpm. Setelah itu, lapisan
air dipindahkan dan ekstrak protein dikumpulakan,
dicatat volumenya. Fraksi satu didapat dari aliquot
sebagai sampel dari ekstrak kasar, lalu diukur
aktivitas dan kadar proteinnya.
Pemanasan ekstrak invertase ragi.
Ekstrak diinkubasi pada suhu 50oC selama 30
menit lalu ekstrak didinginkan, disentrifugasi 15
menit, 15000rpm. Volume supernatan diukur, lalu
diambil 2 mL aliquot untuk uji aktivitas dan kadar
protein ekstrak kasar pemanasan.
Fraksinasi ekstrak invertase ragi.
Fraksinasi pengendapan dibuat dengan amonium
sulfat 20, 40, 60, dan 80% dengan menambahkan
garam amonium sulfat selama satu jam. Lalu
disentrifugasi selama 30 menit, 30000 rpm.
Supernatan yang didapat ditambahakan amonium
sulfat lagi untuk fraksi pengendapan berikutnya.
Hasilnya disimpan dalam suhu -20oC. Setelah itu,
endapan dilarutkan dengan buffer tris-HCl dengan
pH 7.3 lalu diukur volume total masing-masing
fraksi, diambil 1-2 mL untuk uji kadar aktivitas.
Uji Aktivitas Invertase Ragi dengan Assay
Nelson’s
Pembutan kurva standar. Sepuluh tabung
disiapkan lalu diisi dengan komposisi glukosa 4
mM pada tabung dua sampai delapan berturut-turut
adalah 0.02, 0.05, 0.1, 0.15, 0.20, 0.25, 0.3 mL;
fruktosa 4 mM hanya pada tabung sembilan yaitu
0.2 mL; sukrosa 4 mM pada tabung sepuluh yaitu
0.2 mL; dan H2O pada tabung satu sampai sepuluh
berturut-turut adalah 1, 0.98, 0.95, 0.90, 0.85, 0.80,
0.75, 0.70, 0.80, 0.80 mL. Setelah itu, masing-
masing tabung ditambahkan 1 mL reagen
Nelson’s, ditutup dengan alumunium foil lalu
didihkan selama 20 menit. Setelah 20 menit,
tabung didinginkan dan ditambahkan 1 mL reagen
arsenomolibdat, dikocok dengan vorteks, dibiarkan
5 menit, lalu ditambahkan 7 mL H 2O, dikocok lagi
dengan vorteks. Terakhir, baca serapannya pada
panjang gelombang 510 nm dan dibuat kurva
standard.
Uji aktivitas enzim invertase. Sembilan
tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi
buffer asetat 0.2 M pH 4.5 pada tabung 1 sampai 7
adalah 0.2 mL; H2O dari tabung 1 sampai 9
berturut-turut adalah 0.6, 0.55, 0.10, 0.55, 0.10,
0.55, 0.10, 1.0, 0.8 mL; Fraksi 1 pada tabung 2 dan
3 adalah 0.05 dan 0.50 mL; fraksi 2 pada tabung 4
dan 5 adalah 0.05 dan 0.50 mL; fraksi 3 pada
tabung 6 dan 7 adalah 0.05 dan 0.50 m; glukosa 4
mM pada tabung 9 adalah 0.20 mL; sukrosa 0.5 M
pada tabung 1 sampai 7 adalah 0.2 mL. Setelah itu,
semua tabung diinkubasi 10 menit pada suhu
ruang, ditambahkan 1 mL reagen Folin Wu, tabung
ditutup, dan dididihkan selama 20 menit. Setelah
3
20 menit, tabung didinginkan, ditambahkan reagen
arsenomolibdat 1 mL, dikocok dengan vorteks,
lalu biarkan selama 5 menit. Setelah 5 menit,
tambahkan semua tabung dengan H2O 7 mL,
dikocok lagi dengan vorteks, dan dibaca
serapannya pada panjang gelombang 510 nm.
Setelah itu, ditentukan aktivitas spesifiknya.
Penentuan Kadar Protein dengan Metode
Lowry
Pembuatan kurva standard. Sepuluh
tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi
standard BSA pada tabung 2 sampai 10 berturut-
turut adalah 0.05, 0.1, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35,
0.40, dan 0.45 mL; H2O dari tabung 1 sampai 10
berturut-turut adalah 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30,
0.25, 0.20, 0.15, 0.10, 0.05 mL; reagen ABC pada
semua tabung sebanyak 5 mL. Setelah itu, semua
tabung dikocok dengan vorteks, diinkubasi 10
menit pada suhu ruang. Penambahan reagen harus
diatur dengan baik. Pada saat sepuluh menit
terakhir ditambahkan 0.5 mL reagen D ke tabung
pertama dan seterusnya. Kemudian dicampur
dengan vorteks, diinkubasi selama 30 menit pada
suhu ruang lalu dibaca serapannya pada panjang
gelombang 700 nm.
Pengukuran kadar protein enzim
invertase. Sampel fraksi 1 dan 2 diencerkan
dengan air dalam perbandingan 1:4 dengan
komposisi assay tabung 1 sebagai blanko berisi 0.5
mL H2O; Tabung 2, 3, dan 4 berisi fraksi 1 dengan
jumlah 0.05, 0.20, 0.5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0
mL; tabung 5, 6, dan 7 berisi fraksi 2 dengan
jumlah 0.05, 0.20, 0.5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0
mL. Selanjutnya prosedur mengikuti metode
Lowry seperti pembuatan kurva standard protein.
Perlakuan untuk fraksi 3 adalah fraksi 3
disuspensikan pada buffer tris. Preparasi Buffer
tris dan Fraksi 3 adalah dengan pengenceran air
1:1. Enam buah tabung disiapkan, tabung 1, 2, dan
3 sebagai blanko berisi buffer tris 0.05 M berturut-
turut adalah 0.05, 0.2, 0,5 mL dan H 2O 0.45, 0.3, 0
mL, sedangkan tabung 4, 5, dan 6 adalah sampel
yang berisi fraksi 3 berturut-turut adalah 0.05, 0.2,
0,5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0 mL. Selanjutnya
prosedur mengikuti metode Lowry seperti
pembuatan kurva standard protein.
Study Kinetika Enzim Invertase.
Pengaruh konsentrasi substrat pada
aktivitas invertase. Kurva Michaelis-Menten
dapat diperoleh dari data dengan proses
eksperimen yaitu penyiapan duabelas tabung
reaksi yang kemudian diisi dengan komposisi
buffer asetat 0.2 M pH 4.5 pada tabung 1 sampai
10 sebanyak 0.20 mL; sukrosa 0.5 mM pada
tabung dua sampai sepuluh berturut-turut sebanyak
0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.10, 0.20, 0.40, 0.20, 0.40

mL, kemudian ditambahkan H2O sampai
volumenya 0.9 mL kecuali tabung 11 dan 12
sebanyak 1.0 mL dan 0.8 mL; ditambahkan reagen
Nelson’s pada tabung 9 dan 10 sebanyak 1.0 mL;
enzim fraksi 3 sebanyak 0.1 mL pada tabung satu
sampai sepuluh dan glukosa 4 mL sebanyak 0.2
mL pada tabung 12. Assay dimulai dengan
penambahan enzim lalu diinkubasi selama 10
menit pada suhu ruang. Reaksi dihentikan dengan
penambahan reagen folin Wu sebanyak 1.0 mL,
tutup dengan alumunium foil dan dididihkan
selama 20 menit. Setelah itu, baca serapannya pada
panjang gelombang 510 nm.
Prediksi Bobot Molekul Enzim Invertase
Pembuatan gel. Semua komponen untuk
running gel dicampur kecuali ammonium persulfat
dan TEMED yaitu jenis larutan 10%, 14 mL
akrilamid+6 mL air, 5 mL tris HCl 3 M pH 8.9, 0.4
mL 10% SDS, 14.4 mL air akuades kemudian
diaduk dengan magnetik stirer, aerasi dengan
vakum. Setelah itu, ditambahkan 0.4 mL amonium
persulfat, dan 0.02 mL TEMED campur dan tuang
dalam plat kaca kurang lebih 4 cm. N-butanol
dimasukkan. Setelah gel membeku selama 1-2 jam,
n-butanol dibuang dan dicuci dengan running gel
overlay. Kemudian ditambahkan 1 mL running gel
overlay dan dibiarkan hingga stacking gel siap.
Setelah siap, dua sumur diset dalam gel, masing-
masing dengan standard BM protein campuran dan
yang kedua dengan invertase fraksi 3.
Prosedur elektroforesis SDS-page.
Sampel protein dididihkan selama 90 detik,
kemudian sampel disimpan pada 0oC hingga siap
digunakan. Sampel protein dan standar diambil
sekitar 5µL dan diletakkan ke dalam sumur gel.
Setelah itu, sistem elektroforesis dirakit dan
dihubungkan ke dengan power supply (50-100
volt).
Prosedur pewarnaan standar. Gel disimpan
dalam larutan fiksasi pewarnaan cepat, lalu
digoyang perlahan-lahan. Larutan fiksasi diganti
dengan larutan pewarnaan coomasive blue
kemudian digoyang selama 2-24 jam hingga
protein terlihat. Setelah itu larutan pewarnaan
diganti dengan larutan destaining II hingga
baground gell jernih kemudian disimpan dalam
asam asetat 7% atau ddH2O.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Ekstrak Kasar Enzim Invertase
Ragi roti digunakan sebagai sumber enzim
invertase pada isolasi ekstrak kasar enzim
invertase karena ragi banyak mengandung khamir
Saccharomyces cereviseae. Isolasi diawali dengan
mencampurkan ragi roti sebanyak 10 gram dan
pelarut toluen sebanyak 10 mL lalu diaduk.
4
Selanjutnya, campuran tersebut dihomogenasikan
dengan menggunakan homogenizer supaya lebih
merata. Pemecahan sel dilakukan setelah proses
inkubasi. Hal ini dikarenakan enzim invertase
termasuk enzim yang berada di dalam sel
(intraseluler), maka perlu dilakukan proses
pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan enzim
di dalam sel supaya dihasilkan enzim yang lebih
banyak. Proses pemecahan sel ini dilakukan
dengan cara keras, yaitu dengan glassbed dan
digerus selama 30 menit. Inkubasi ragi dilakukan
selama 30 menit dengan suhu inkubasi sebesar
50oC. Suhu diatur sebesar 50oC karena jika suhu
terlalu panas maka mikroorganisme penghasil
enzim invertase akan mati, sehingga enzim tidak
akan diperoleh.
Selanjutnya, pemisahan enzim dilakukan
dengan cara disentrifuge dengan kecepatan 12000
rpm selama 15 menit. Hal ini berguna untuk
memisahankan pecahan dinding dinding sel dari
supernatannya. Prinsip dari metode sentrifuge ini,
yaitu proses pemisahan ekstrak enzim yang
didasarkan pada berat molekul dengan
menggunakan gaya sentrifugal. Sehingga nantinya
berat molekul yang ringan akan berada diatas dan
yang berat berada dibawah (Koolman, 2000).
Setelah disentrifuge, supernatan didekantasi dari
residu/pecahan dinding-dinding sel, maka hasil
yang diperoleh berupa ektrak kasar enzim
invertase yang berwarna cokelat. Berdasarkan
komposisi tersebut maka jumlah ekstrak kasar
enzim invertase yang diperoleh sebanyak 18.02
gram.
Ekstrak kasar enzim invertase hasil
optimasi ditentukan aktivitasnya dengan
menggunakan assay Nelson’s dan kandungan
proteinnya menggunakan metode Lowry, diukur
aktifitas secara spektroskopi. Assay Nelson
berprinsip pada pengukuran jumlah gula pereduksi.
Pada metode ini aktivitas enzim invertase
ditunjukkan oleh bertambahnya produk reaksi
(glukosa dan fruktosa) atau berkurangnya substrat
(fruktosa/ satuan waktu). Metode Lowry
didasarkan pada reaksi Biuret dan reduksi reagen
arsenomolibdat menghasilkan warna biru (Hasanah
Putra 2010).
Uji Aktivitas Invertase Ragi dengan Assay
Nelson’s
Pembuatan Kurva Standar Gula Invert.
Sepuluh tabung disiapkan lalu diisi dengan
komposisi glukosa 4 mM pada tabung dua sampai
delapan berturut-turut; fruktosa 4 mM hanya pada
tabung sembilan; sukrosa 4 mM pada tabung
sepuluh; dan H2O pada tabung satu sampai
sepuluh. Setelah itu, masing-masing tabung
ditambahkan 1 mL reagen Nelson’s, ditutup
dengan alumunium foil lalu didihkan selama 20
 5

menit untuk memperjelas warna yang terjadi.
Setelah 20 menit, tabung didinginkan dengan hasil
diperoleh berupa padatan berwarana biru sampai
biru kehijauan. Semakin tinggi konsentrasi gula
invert, maka warna hijau semakin dominan. Untuk
melarutkan padatan tersebut maka reagen
arsenomolibdat ditambahkan sebanyak 1 mL,
dikocok dengan vorteks, dibiarkan 5 menit. Warna
larutan yang diperoleh, yaitu semakin tinggi
konsentrasi gula invert maka warna larutan
semakin biru pekat. Supaya campuran lebih encer
dan bisa diukur absorbansinya,lalu ditambahkan 7
mL H2O, dikocok lagi dengan vorteks. Pengukuran
absorbansi dilakukan secara spektroskopi pada
panjang gelombang (λ) sebesar 540 nm.
Kurva standar gula invert seperti pada
gambar 1 dibuat dengan mengalurkan absorbansi
(A) terhadap konsentrasi larutan gula invert (M).
Nilai absorbansi mengalami kenaikan dengan
semakin besarnya konsentrasi larutan gula invert
sehingga diperoleh persamaan garis antara
konsentrasi dan absorbansi yaitu y = 0,515x+
0,00372 dengan r2 = 0,985. Persamaan tersebut
akan digunakan untuk menghitung konsentrasi
gula invert yang terbentuk.
0.7
0.6
f(x) = 0.51 x + 0
0.5 R² = 0.98
Absorban
baik karena hampir mendekati +1, yang mana titik-
titik pada kurva standar melewati garis lerengnya.
Perbedaan pH berpengaruh terhadap 2 jenis,
yaitu struktur enzim dan gugus fungsional enzim.
Suatu enzim dapat menghasilkan produk yang
maksimal pada pH optimumnya. Aktivitas
maksimum invertase yaitu pada pH 4,5 dengan
aktivitas sebesar 1.2256 unit pada fraksi 1, 0.9568
unit pada fraksi 2, dan 1.1232 unit pada fraksi 3.
Unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah
yang menyebabkan pembentukan 2 µmol gula
pereduksi per menitnya. Hasil pH optimum ini
sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh
Bergamasco et al. (2003), yang melaporkan bahwa
aktifitas enzim terjadi pada range pH 3,0 - 5,0
dengan aktivitas maksimum terjadi disekitar pH
4,5. Diatas skala tersebut aktivitas enzim
mengalami penurunan. Semakin basa kondisi
hidrolisis menyebabkan semakin rendahnya harga
aktivitas enzim invertase.
Perubahan pH dapat menyebabkan
turunnya aktivitas enzim akibat perubahan ionisasi
gugus-gugus fungsionilnya karena gugus ionik
berperan penting dalam menjaga konformasi sisi
aktif enzim untuk mengikat dan mengubah substrat
menjadi produk. Perubahan pH juga dapat
menyebabkan enzim terdenaturasi sehingga
menyebabkan penurunan katalitik enzim.
Denaturasi enzim dakibatkan karena terjadinya

0.4
pemutusan ikatan penstabil struktur (seperti ikatan
0.3
ionik, hidrogen, hidrofobik) yang menghubungkan
0.2
antar polimer protein. Pemutusan tersebut dapat
0.1 terjadi pada protein kwartener, tersier ataupun
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 sekunder. Pada protein kwartener terjadi
[glukosa] µmol pemutusan ikatan penstabil struktur karena
bentuknya yang merupakan gabungan antara
Gambar 1. Kurva standar aktivitas invertase ragi globular satu dengan globular lainyya sehingga
dengan assay Nelson’s dapat terjadi pemutus an ikatan tersebut pada
protein tersier satu dengan protein tersier lainnya
Nilai R2 dari kurva diatas adalah 0.985, hal ini dan terjadi seterusnya, pada protein tersier
menunjukkan bahwa kelinearan kurva standar membentuk protein sekunder (Awwalurrizki
&Putra 2009).
Tabel 1 Data unit enzim invertase dan unit aktivitas dalam fraksi (Total unit).
[glukosa] unit enzim Rata- Total
Larutan Tabung A FP rata-rata
µmol invertase rata unit
B lanko 1 0 - - - - - -
2 0,114 2,1567 2,1561 1,2256 12 67,284 37,006
Fraksi 1
3 1,523 2,95 0,295 1,2 6,7284
103,334
4 0,851 1,645 1,645 0,9568 24 56,834
Fraksi 2 4
5 1,387 2,686 0,2686 2,4 10,3334
6 1,013 1,959 1,959 1,1232 24 60,6528 33,359
Fraksi 3
7 1,484 2,874 0,2874 2,4 6,0653
Standar 8 -0,063 -0,129 - - - - -
 6

glukosa 9 0,268 0,513 - - - - -

Pada percobaan ini menunjukkan bahwa
unit aktivitas tertinggi ada pada fraksi dua sebesar
56.824, sedangkan unit enzim invertase tertinggi
0.5
adalah pada fraksi 1 dimana fraksi satu merupakan
ekstrak kasar enzim invertase dan fraksi 3 0.4 f(x) = 0 x + 0.05
merupakan fraksi yang dimurnikan pada enzin R² = 0.87

invertase.
Penentuan Kadar Protein dengan Metode
Lowry
Pembuatan kurva standard. Sepuluh
tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi
standard BSA pada tabung 2 sampai 10; H 2O dari
tabung 1 sampai 10; reagen C (campuran dari
reagen A dan B) pada semua tabung. Fungsi dari
reagen ini adalah unuk membentuk kompleks
Biuret. Setelah itu, semua tabung dikocok dengan
vorteks, diinkubasi 10 menit pada suhu ruang.
Penambahan reagen harus diatur dengan baik.
Pada saat sepuluh menit terakhir ditambahkan 0.5
mL reagen D ke tabung pertama dan seterusnya.
Kemudian dicampur dengan vorteks, diinkubasi
selama 30 menit pada suhu ruang lalu dibaca
serapannya pada panjang gelombang 700 nm.
Kurva standar pada gambar 2 dibuat dengan
mengalurkan absorbansi sebagai ordinat (sumbu-
Y) dan konsentrasi larutan BSA sebagai absis
(sumbu-X). Nilai absorbansi mengalami kenaikan
dengan semakin bertambahnya konsentrasi larutan
BSA sehingga diperoleh persamaan garis, yaitu
y=0,0323x + 2,2497x10-3 dan faktor korelasi
sebesar 0,9416. Persamaan yang diperoleh
digunakan untuk menentukan kandungan protein.
Kandungan protein yang diukur dalam
penelitian ini adalah protein terlarut dan protein
total. Protein terlarut merupakan oligopeptida dan
mudah diserap oleh sistem pencernaan. Protein
total merupakan pengukuran kandungan nitrogen
(N) dalam sampel. Oleh karena itu, terdapat
senyawa non-protein yang ikut terdeteksi dan
terkalkulasi. Namun, interferensi ini relatif kecil
dan dapat diabaikan.
Absorban
0.3
0.2
0.1
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
µgram protein
Gambar 2 Kurva standar BSA.
Metode Lowry-Folin hanya dapat
mengukur molekul peptida pendek dan tidak dapat
mengukur molekul peptida panjang (Alexander &
Griffiths 1992). Prinsip kerja metode Lowry
adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+
oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat
dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan
fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E)
membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap
cahaya. Protein merupakan polimer heterogen
molekul-molekul asam amino. Protein yang
terkandung dalam kedelai merupakan protein
globuler. Dalam protein globuler, rantairantai
samping hidrofil dan polar berada di bagian luar
dan rantai samping hidrofob dan nonpolar berada
di bagian dalam.
Pada percobaan ini didapat kadar protein
paling tinggi adalah pada fraksi II yaitu sebesar
0,0225 mg/mL sedangkan paling kecil adalah pada
fraksi III sebesar 0,0015 mg/mL. Hal ini
dikarenakan pada fraksi III sudah dilakukan
perlakuan terus-menerus atau paling banyak
sehingga kadar proteinnya paling kecil. Sementara
itu kandungan protein Total pada fraksi II juga
tertinggi (1,0328) dan fraksi III paling rendah
(0,0608).

Tabel 2 Data jumlah protein, total protein, dan aktivitas spesifik enzim invertase.
Laruta protein [protein] Rata- Total Rata- Aktivitas
Tabung A
n (µg) (mg/mL) rata protein rata Spesifik
Blanko 1 0 - -
2 -0,007 -0,286 -0,0057 0,6975
Fraksi
3 0,12 3,646 0,0182 0,0155 0,1744 0,3139 80,387
1
4 0,208 6,369 0,0127 0,0698
5 0,037 1,076 0,0215 2,295
Fraksi
6 0,048 1,416 0,0071 0,0255 0,574 1,0328 37,522
2
7 0,775 23,924 0,0478 0,2295
Fraksi 8 -0,011 -0,41 -0,0082 0,0015 0,135 0,0608 748,8
 7

9 -0,004 -0,1935 -0,00096 0,0338

3
10 0,027 0,766 0,0015 0,0135
Dari hasil keseluruhan aktivitas spesifik lagi. Hal ini terjadi karena suatu reaksi enzimatis
fraksi III paling besar (748,8) dibandingkan fraksi akan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi
yang lain. Dari konsentrasi tersebut didapat yield substrat [S], akan tetapi setelah [S] meningkat
enzim sebesar 90,14%, sedangkan fold enzimnya lebih lanjut akan sampai pada kecepatan yang
sebesar 931,49%. Yield enzim merupakan tetap. Pada kondisi dimana kecepatan reaksi
perbandingan antara total unit dalam fraksi yang enzimatis tidak dapat bertambah lagi dengan
dimurnikan dengan total unit dalam ekstrak kasar, bertambahnya [S] disebut kecepatan maksimum
sedangkan fold enzim merupakan perbandingan (Vmaks) (Wiesman, 1989).
antara aktivitas spesifik dari fraksi yang
dimurnikan dengan aktivitas spesifik ekstrak kasar.
0.18
0.16
Penentuan kinetika enzim f(x) = 0.58 x + 0
0.14 R² = 0.98
Penentuan kinetika enzim invertase (Vmaks 0.12
dan Km) didasarkan atas plot grafik hubungan 0.1
V 0.08
antara konsentrasi substrat [S] dan aktivitas enzim
0.06
(V) (Fayyaz et al. 1995; Dinu 2001). Larutan 0.04
substrat sukrosa dibuat dengan konsentrasi antara 0.02
0.02-0.4 dengan interval 0.02 dan 0.1 dalam 0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
larutan buffer asetat 0,2 M pH 4.5 lalu dilakukan
S
pengujian aktivitas enzim sesuai prosedurnya.
Setelah itu ditentukan aktivitas enzim (µmol gula Gambar 3 Kurva hubungan antara kecepatan dan
pereduksi/ menit) pada masing-masing konsentrasi konsentrasi substrat (Michaelis Menten)
substrat.
140
Selanjutnya dibuat tabel V dan [S] dan
120
dikonversi menjadi 1/V dan 1/[S] serta dibuat plot f(x) = 1.72 x − 0.91
100
grafik hubungan antara 1/V dan 1/[S]. Lalu R² = 0.98
80
ditentukan nilai Vmaks dan Km yang didasarkan
1/V 60
atas persamaan kurva Lineweaver-Burk (Whitaker,
1996), dengan cara: 40
- Bahwa dari persamaan: 1/V = 1/Vmaks + Km/ 20
Vmaks.(1/[S]) 0
- Bila 1/V = Y dan 1/[S] = X, maka rumusnya 0 10 20 30 40 50 60 70 80
1/S
dapat ditulis menjadi: Y = a + bX, sehingga:
Gambar 4 Kurva hubungan antara 1/V dan 1/S
a = 1/Vmaks dan b = Km/Vmaks
(Lineweaver burk)
- Dengan demikian, bila harga 1/Vmaks diketahui
maka nilai Vmaks didapat, begitu pula nilai Km
Penentuan Vmaks akan menghasilkan
akan juga didapat dari persamaan b = Km/Vmaks.
gambaran tentang sifat-sifat kinetika enzim lain, ½
Aktivitas enzim invertase pada beberapa
Vmaks, yaitu suatu konsentrasi substrat yang
konsentrasi substrat (Tabel 3) menunjukkan bahwa
separuh lokasi aktifnya telah terisi atau bila
konsentrasinya mula-mula meningkat secara
kecepatan reaksi enzimatis telah mencapai
signifikan sejalan dengan meningkatnya
setengah dari kecepatan maksimum, yang dikenal
konsentrasi substrat. Penentuan Vmaks dan Km
dengan Km (tetapan Michaelis-Menten). Nilai Km
didasarkan atas persamaan garis regresi grafik
digunakan selain sebagai ukuran afinitas E-S juga
hubungan antara 1/[S] dan 1/V (Tabel 3),
berhubungan dengan tetapan keseimbangan
seperti disajikan pada Gambar 4. Selanjutnya disosiasi kompleks E-S menjasi E dan S. Fayyaz
dari persamaan regresi y=1,720x – 0,914, (1995) menambahkan bila nilai Km kecil berarti
maka diperoleh Vmaks = -1,0940 µgram/ menit dan kompleks E-S mantap dan afinitas enzim terhadap
Km = -1,8818 mM substrat tinggi, sedangkan bila nilai Km besa
Aktivitas enzim invertase yang mula-mula afinitasnya menjadi rendah. Harga Km enzim
meningkat secara signifikan sejalan dengan sangat bervariasi tergantung dari jenis substrat,
meningkatnya konsentrasi substrat, tetapi tidak keadaan lingkungan dan kekuatan ion. Pada
signifikan setelah konsentrasi substrat ditingkatkan percobaan kali ini didapat Vm negatif artinya

reaksi berjalan sangat lamabat atau mungkin tidak penambahan enzim ke tabung kurang tepat dengan
berjalan sama sekali. Hal ini karena kurva yang interval waktunya.
dihasilkan tidak hiperbolik yang disebabkan saat
Tabel 3 Data kecepatan da konsentrasi substrat sukrosa
Tabun
A [sukrosa] µmol V 1/V
g
1 0 0 0
2 0,046 0,082 0,0082
3 0,107 0,201 0,0201
4 0,111 0,208 0,0208
5 0,191 0,364 0,0364
6 0,241 0,461 0,0461
7 0,501 0,996 0,0996
8 0,826 1,596 0,1596
Prediksi bobot molekul enzim invertase
Prinsip dasar SDS-PAGE adalah
makromolekul bermuatan akan bermigrasi dalam
medan listrik dengan laju yang ditentukan oleh
ukuran dan muatannya. Sebelum protein
dijalankan dalam medan listrik, protein terlebih
dahulu akan didenaturasi dengan perubahan
kondisi yang tajam misalnya panas, adanya agen
pereduksi, penambahan deterjen dan lain-lain,
kemudian akan dibungkus dengan deterjen anionik
yaitu SDS. Muatan asli molekul protein akan
ditimpa oleh molekul SDS yang bermuatan
negatif. Adanya 2-merkaptoetanol dapat
membantu denaturasi protein dengan cara
mereduksi semua ikatan disulfide.
SDS dilakukukan pada pH netral. Pada
metode ini digunakan SDS dan β-merkaptoetanol.
SDS bersama β-merkaptoetanol dan pemanasan
menyebabkan rusaknya struktur tiga dimensi
protein menjadi konfigurasi random coil. Hal ini
disebabkan oleh pecahnya ikatan disulfida yang
selanjutnya tereduksi menjadi gugus-gugus
sulfhidril. Denaturasi protein adalah suatu keadaan
dimana terjadi perubahan konformsi protein.
Perubahan ini meliputi proses destruksi ikatan
pada struktur sekunder sehingga konformasi
protein asli berubah tetapi ikatan kovalen pada
polipeptida tidak mengalami kerusakan. SDS
merupakan deterjen anionik, memiliki gugus ion
sulfat dan rantai alkil lipfoilik yang menyebabkan
peptida dan protein tidak saling berikatan yang
dinamakan denaturasi. SDS mengelilingi peptida
atau protein sehingga bermuatan negatif, kemudain
semua peptida dan protein dalam campuran akan
bermigrasi menuju anoda yang pergerakannya
tidak dipengaruhi oleh bentuk. Hal ini disebabkan
karena adanya denaturasi yang mengakibatkan
bentuk molekul seragam yaitu berbentuk rantai
lurus yang kemudian diselimuti oleh SDS sehingga
bermuatan negatif. Pergerakan protein merupakan
8
[S] 1/[S]
0 0 0
121,95 0,0143 69,93
49,75 0,0386 34,97
48,08 0,0429 23,31
27,47 0,0571 17,51
21,69 0,0714 14,01
10,35 0,1429 6,99
6,27 0,2857 3,50
fungsi dari berat molekulnya, dimana kompleks
SDS-protein yang lebih besar mempunyai
mobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan
kompleks yang lebih kecil.
Stacking gel mempunyai fungsi untuk
mengumpulkan sampel yang akan dipisahkan
sehingga memungkinkan cuplikan untuk bergerak
bersama-sama dan membentuk suatu pita cuplikan
yang pekat. Resolving gel mempunyai fungsi
untuk terjadinya pemisahan yang lebih baik
sehingga memungkinkan terjadi perbedaan gerak
yang jelas terlihat antara spesies dengan molekul
besar dan spesies dengan molekul yang lebih kecil.
Fungsi buffer elektroforesis untuk
mempertahankan pH di dalam reservoir dan gel
serta sebagai elektrolit pembawa aliran listrik.
Oleh karena itu pemilihan buffer harus memenuhi
kriteria antara lain: pemilihan buffer didasarkan
pada tidak adanya interkasi yang terjadi antara
buffer dengan makromolekul yang dipisahkan, pH
yang digunakan tidak mengakibatkan denaturasi
protein (kisaran yang digunakan untuk protein
biasanya 4.5-9.0, kekuatan ionik dan konsentrasi
buffer harus diperhitungkan dengan tepat
(kekuatan ionik biasanya berkisar 0.05-0.15).
Sistem buffer kontinyu adalah gel yang
digunakan dalam satu slab terdiri dari dua gel yaitu
stacking gel dan separating gel. Buffer dan
konsentrasi akrilamid yang digunakan pada kedua
gel tersebut berbeda. Pada stacking gel digunakan
buffer dengan pH 6.8 dan konsentrasi akrilamid
rendah. Sedangkan pada separating gel digunakan
buffer dengan pH 8.8 dan konsentrasi akrilamid
tinggi. Sehingga protein akan terkonsentrasi pada
stacking gel dan akan mengalami resolusi yang
tinggi pada separating gel. Hal ini menghasilkan
pemisahan yang baik dan pita tajam.
Pewarnaan berfungsi untuk memperjelas
pita protein hasil pemisahan dengan elektroforesis.

Pewarna yang digunakan harus dapat bereaksi
dengan molekul sampel yang dipisahkan, tetapi
tidak bereaksi dengan gel elektroforesis. Ikatan
antara pewarna dan gel bukan ikatan kovalen
sehingga mudah dilepaskan oleh pencucian yang
intensif dan penyinaran.
Gambar 5 Hasil elektroforesis SDS PAGE
Adapun pengamatan yang sudah diujikan,
tampak jelas terlihat laju migrasi dan berbedaan
gerak yang jelas terlihat antara spesies dengan
molekul besar dan spesies dengan molekul yang
lebih kecil, dan dengan menggunakan pewarnaan
tampak terlihat jelas proses pemisahan pita protein
hasil elektroforesis.
Sampel yang dimasukan ke dalam sumur
pada stacking gel akan terkonsentrasi atau
tertumpuk dan tidak mengalami pemisahan
meskipun dibawah pengaruh medan listrik, hal ini
disebabkan karena pori gel berukuran besar (4%
akrilamid). Mobilitas ion pada stacikng gel secara
berurutan adalah ion klorida, protein kemudian ion
glisin. Ketika pergerakan mencapai separating gel,
konsentrasi glisin meningkat akibat peningkatan
pH sehingga mobilitasnya menurun akibat adanya
ukuran pori yang semakin kecil. Dengan demikian
pergerakan ion pada separating gel secara
berurutan adalah ion klorida, ion glisin, dan
protein.
Hasil running dari masing-masing
sampelnya diekstrak dari sel-sel mikroorganisme.
Dua macam konsentrasi ini dipilih untuk
membedakan antara populasi mikroorganisme
yang resisten dengan yang tidak resisten. Pola Pita
protein hasil running dengan menggunakan gel
polyakrilamid seperti terlihat pada Gambar 2.
Protein marker digunakan untuk mengidentifikasi
berat molekul dari campuran polypeptida (Hames
& Rickwood 1990). Marker protein yang
digunakan memiliki rentang berat molekul 212
kDa- 11,3 kDa. Dari hasil elektroforesis terdapat
sejumlah pita protein yang memiliki ketebalan
berbeda-beda. Protein yang memiliki ketebalan
dan intensitas warna yang lebih besar
dibandingkan protein lain dan selalu ada di setiap
variaetas disebut protein mayor. Pada hasil
elektroforesis di atas terdapat beberapa buah
9
protein mayor pada. Berat molekul dari protein
mayor ini berkisar 148,7 kDa, 121,6 kDa, dan 105
kDa.
Alasan elektroforesis digunakan dalam
penelitian ini karena memiliki peran sangat penting
dalam proses pemisahan molekul-molekul biologi,
khususnya protein. Karena disamping metode
tersebut tidak mempengaruhi struktur biopolimer,
tetapi juga sangat sensitif terhadap perbedaan
muatan dan berat molekul yang cukup kecil
(Bachrudin, 1999). Protein yang dialirkan dalam
medium yang menagndung medan listrik maka
senyawa-senyawa yang bermuatan akan bergerak
dalam larutan sebagai akibat dari sifat polaritas
yang berlawanan, maka mobilitas suatu molekul
meupakan fungsi dari bentuk, ukuran molekul, dan
besar tipe muatan.
Penggunaan SDS dan merkaptoetanol
disertai dengan pemanasan akan memecah struktur
tiga dimensi dari protein, terutama ikatan disulfida
menjadi subunit-subunit polipeptida secara
individual. SDS juga membungkus rantai protein
yang tidak terikat dengan muatan negatif yang
sama membentuk kompleks SDS-protein.
Kompleks SDS protein mempunyai densitas
muatan yang identik dan bergerak pada gel hanya
berdasarkan ukuran protein. Jadi kompleks SDS-
protein yang lebih besar mempunyai mobilitas
yang lebih rendah dibandingkan dengan kompleks
SDS-protein yang lebih kecil.
SIMPULAN
Berdasarkan hasil percobaan diperoleh
kesimpulan bahwa aktivitas optimum invertase
dalam mendegradasi sukrosa menjadi gula invert
adalah pada kondisi pH 4,5. Berbagai pengujian
seperti aktivitas, kadar, kinetika dan bobot
molekulnya, dari aktivitasnya ternyata fraksi I
memiliki konsentrasi dan aktivitasnya lebih besar
dari yang lain (1.2256 unit/menit), hal ini
disebabkan pada fraksi I masih fresh. Sedangkan
pengamatan kadar protein memiliki konsentrasi
larutan sampel yang dihitung dengan bantuan
kurva standar yang tertinggi ialah dari fraksi II
sebesar 0,0255 mg/mL. Dengan data mengenai
aktvitas dan kadar pada fraksi II memperkuat
literatur yang menyatakan bahwa konsentrasi
enzim dapat mempengaruhi aktivitas enzim,
ditandai dengan semakin banyaknya substrat yang
berubah menjadi produk melalui proses enzimatis.
Besarnya fold enzim dan yield enzim berturut-turut
adalah 931,49% dan 90,14%, sedangkan Vmaks =
-1,0940 µmol/mL.menit dan Km = -1,8818 mM.
Dan untuk mengetahui bobot molekulnya
menggunakan elektroforesis dengan metode SDS-
PAGE dimana protein akan bermigrasi dengan
dialiri arus listrik, dan yang memiliki molekul
besar akan tetap diam.

DAFTAR PUSTAKA
Acosta N, Beldarrain A, Alonso Y. 2000.
Characterization of recombinant invertase
expressed in methylotropic yeasts
Biotechnology and Applied Biochemistry 32:
179-187
Alexander RR, Griffiths JM. 1992. Basic
Biochemical Methods. New York: Wiley-
Liss.
Awwalurrizki N, Putra SR. 2009. Hidrolisis
Sukrosa dengan enzim invertase untuk
produksi etanol menggunakan Zymomonas
mobilis [skripsi]. Surabaya: Fakultas
matematika dan Ilmu pengetahuan Alam,
Institut Teknologi Sepuluh Nopember
Bachrudin. Z. 1999. Petunjuk Laboratorium:
Isolasi, Identifikasi, dan Pewarnaan Protein.
PAU Bioteknologi: UGM Yogyakarta
Bergamasco R., Bassetti FJ, Moraes FF, Zanin
GM. 2000. Characterization of free and
immobilized invertase regarding activity and
energy of activation. Brazilian Journal of
Chemical Engineering 17: 873-880
Bergamasco R, Akgol S, Bulut A, Denizli A,
Yakub A.M. 2003. Covalent immobilization
of inverase onto a reactive film composed of
2- hydroxyethyl methacrylate and glycidyl
methacrylate. Biochemical Engineering
Journal 14:117- 126
Bucke C. 1987. Cell immobilization in calcium
Alginate. Methods in Enzymology 135: 175-
189
Cheng, WH, Im KH, Chourey PS. 1996. Sucrose
phosphate synthase expression at the cell and
tissue leve1 is coordinated with sucrose sink-
tosource transitions in maize leaf. Plant
Physiol 111 : 1021-1029.
Dinu D. 2001. Enzymatic hydrolysis of pectic acid
and pectins by polygalacturonase from
Aspergillus niger. Roum Biotechnol 6 (5) :
397-402.
Fayyaz A, Asbi BA, Ghazali HM, Che-Man YB,
Jinap S. 1995. Kinetics of papaya
pectinesterase. Jurnal of Food Chemistry 53 :
129-135.
Fung RW, Kamper GL, Gardner RC, MacRae E.
2003. Differential expression within an SPS
gene family. Plant Sci 164:450-470
10
Grof CP, Huber JL, McNeil SD, Lunn LE,
Campbell JA. 1998. A modified assay
method show leaf sucrose phosphate synthase
activity is correlated with leaf sucrose
content across a range of sugarcane varieties.
Aust. J. PlantPhysiol 25 : 499-502.
Hames, B.D & Rickwood.1990. A Practical
Approach: Gel elektrophoresis protein.
Huntington: Robert E Krieger Publishing
Company
Hasanah EN, Putra SR. 2009. Karakterisasi
ekdtrak kasar enzim invertase yang
dimobilisasi dengan Na-Alginat [skripsi].
Surabaya: Fakultas matematika dan Ilmu
pengetahuan Alam, Institut Teknologi
Sepuluh Nopember.
Kim J.Y., Mahe A, Brangeon J, Prioul JL. 2000.
Amaize vacuolar invertase , IVR2, is induced
by water stress. Organ/tissue specificity and
diurnal modulation of expression. Plant
Physiol 124:71-84.
Koch, K. E. (1996) Carbohydrate modulated gene
expression in plants. Annu. Rev. Plant
Physiol.Plant Mol. Bio. 47:509-540.
Koolman J, Rohm KH. 1994. Atlas Berwarna Dan
Teks Biokimia. Wanandi SI; penerjemah.
Terjemahan dari: Color Atlas Of
Biochemistry. Jakarta: Hipokrates.
Lee WC, Huang CT. 2000. Modelling of mobilis
ATTC 10988 grown on the media containing
glucose and fructose. Biochemical
Engineering Journal 4: 217-227
Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid
ke-1. Maggy Thenawidjaja; penerjemah.
Terjemahan dari: Principles Of Biochemistry.
Erlangga: Jakarta
Lunn JE, Hatch MD. 1997. The role of sucrose
phosphate synthase in the control
photosynthate partitioning in Zea mays
leaves. Aust. J. Plant Physiol 24 : 1-8.
Narita V. 2005. Saccharomyces cerevisiae
Superjamur yang Memiliki Sejarah Luar
Biasa. Jakarta: Pustaka Utama.
Ohto M, Onai K, Furkawa Y, Aoki E, Araki T,
Nakamura A. 2001. Effect of sugar on
vegetative development and floral transition
in Arabidopsis Plant Physiol. 127 : 252-261.
 11

Wiseman A. 1989. Handbook of Enzyme Howard.

Biotechnology. 2nd. Edition. New York: Ellis