Aminoácidos y Proteínas

Temario:
- Curva de titulación de aa.
- Espectrofotometría.
- Cuantificación de proteínas.
- Electroforesis.
- Técnicas de purificación.
- Técnicas de secuenciación de proteínas.

1
 Cuantificación de proteínas

- Espectrofotometría directa (capacidad intrínseca de las proteínas de

absorber luz a 280 nm)

- Método de Lowry (reacción química)

- Método de Bradford (fijación de un colorante)

2
 Espectrofotometria
Ley de Lambert-Beer

A= ε lC

A = absorbancia del cromóforo a una longitud de onda de determinada.

ε = absortividad molar (coeficiente de extinción molar), absorbancia de una
solución 1M del compuesto (sv, T, λ ). Unidades: litro/mol x cm
l = longitud del camino óptico en la cubeta (en cm).
C= concentración del cromóforo en la solución, en moles/litro.

3
En el caso de las proteínas los cromóforos son los residuos de
aminoácidos aromáticos (Trp, Tyr, Phe) y las uniones peptídicas.

DO 280  máximo de absorción aa aromáticos y no absorbe el sv

(agua)
Cromóforo Long. de onda para la Absortividad molar
absorción máxima (nm) (l/mol.cm)
Triptofano 280 5.600
Tirosina 275 1.400
Fenilalanina 257 200
Unión peptídica 205 4-8.000
Puente disulfuro 250 300

Grupos aromáticos (280 nm) Unión peptídica (205 nm)

VENTAJAS Gran espectro de sensibilidad Proteínas sin grupos aromáticos

DESVENTAJAS Interferencia de ácidos nucleicos Detección de otros compuestos

u otros compuestos aromáticos químicos (solventes, etc.)

4
 Método de Lowry
Método colorimetrico para cuantificar proteínas.
Paso 1: formación de un complejo entre la proteína y el Cu+2 del
reactivo en medio alcalino.
Los iones Cu2+ , en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los
átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+ -proteína tienen un color
azul claro. La formación de estos complejos provoca el desdoblamiento de la estructura
tridimensional de la proteína, exponiéndo los residuos de Tyr que van a participar en la 2º
etapa de la reacción.

Paso 2: reducción del Rvo de Folin dando productos coloreados que

pueden leerse a 750 nm.
El principal constituyente del reactivo de Folin es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color
amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos de las Tyr da lugar a un complejo de
color azul intenso.
Solución I (1ml c/ 0.2 ml de muestra): Na2CO3 2% en NaOH 0.1M + tartrato de Na+ y K+
2% + CuSO4 1%.
Solución II (0.1 ml c/ 0.2 ml muestra): Rvo de Folin (ácido fosfotungstico-fosfomolibdico),
color amarillo.

Procedimiento

• 0.2 ml dilución muestra + 1 ml sc I  10 min

• 0.1 ml Rvo Folin  30 min  formación de complejos azules
5
• Leer DO 750 nm
Ejemplo de cuantificación de proteínas por el método
de Lowry
1) Curva de calibración: proteína patrón Albúmina 0.4 mg/ml

• Preparar distintas diluciones de la solución de albúmina patrón

Blanco T1 T1* T2 T2* T3 T3* T4 T4* T5 T5* T6 T6*

Albumina (µ l) 0 10 10 20 20 30 30 40 40 50 50 60 60

Agua (µ l) 200 190 190 180 180 170 170 160 160 150 150 140 140

Albumina (µ g)

Absorbancia

• Calcular el contenido de albúmina en cada uno de los tubos

Blanco T1 T1* T2 T2* T3 T3* T4 T4* T5 T5* T6 T6*

Albumina (µ l) 0 10 10 20 20 30 30 40 40 50 50 60 60

Agua (µ l) 200 190 190 180 180 170 170 160 160 150 150 140 140

Albumina (µ g) 0 4 4 8 8 12 12 16 16 20 20 24 24

Absorbancia

• Agregar los reactivos y medir la DO a 750 nm de cada uno de los tubos

Blanco T1 T1* T2 T2* T3 T3* T4 T4* T5 T5* T6 T6*

Albumina (µ l) 0 10 10 20 20 30 30 40 40 50 50 60 60

Agua (µ l) 200 190 190 180 180 170 170 160 160 150 150 140 140

Albumina (µ g) 0 4 4 8 8 12 12 16 16 20 20 24 24

Absorbancia 0 0,065 0,06 0,102 0,098 0,172 0,174 0,219 0,22 0,255 0,263 0,309 0,296
6
Ejemplo de cuantificación de proteínas por el método
de Lowry
• Graficar
Blanco T1 T1* T2 T2* T3 T3* T4 T4* T5 T5* T6 T6*

Albumina (µ l) 0 10 10 20 20 30 30 40 40 50 50 60 60

Agua (µ l) 200 190 190 180 180 170 170 160 160 150 150 140 140

Albumina (µ g) 0 4 4 8 8 12 12 16 20 20 24 24

Absorbancia 0 0,065 0,06 0,102 0,098 0,172 0,174 0,219 0,22 0,255 0,263 0,309 0,296

Pr (µ g)= 76.43xDO –
0.361

7
Ejemplo de cuantificación de proteínas por el método de
Lowry
1) Muestra problema:

• Preparar distintas diluciones de la muestra / tomar distintos volúmenes

muestra 1: homogenato de hígado muestra 2: mitocondrias de hígado muestra 3: mitocondrias de testículo
Dilución 1/50 Dilución 1/20 Dilución 1/20
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
muestra (µ l) 10 10 20 20 50 50 10 10 20 20 50 50 10 10 20 20 50 50
Agua (µ l) 190 190 180 180 150 150 190 190 180 180 150 150 190 190 180 180 150 150
Absorbancia
Proteína (mg/ml)

• Agregar los reactivos y medir la DO a 750 nm de cada uno de los tubos

muestra 1: homogenato de hígado muestra 2: mitocondrias de hígado muestra 3: mitocondrias de testículo
Dilución 1/50 Dilución 1/20 Dilución 1/20
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
muestra (µ l) 10 10 20 20 50 50 10 10 20 20 50 50 10 10 20 20 50 50
Agua (µ l) 190 190 180 180 150 150 190 190 180 180 150 150 190 190 180 180 150 150
Absorbancia 0,07 0,06 0,13 0,131 0,316 0,314 0,103 0,082 0,286 0,199 0,458 0,491 0,08 0,072 0,119 0,132 0,291 0,297
Proteína (mg/ml)

• Calcular usando la curva de calibración el contenido de proteína de cada muestra

muestra 1: homogenato de hígado muestra 2: mitocondrias de hígado muestra 3: mitocondrias de testículo

Dilución 1/50 Dilución 1/20 Dilución 1/20

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

muestra (µ l) 10 10 20 20 50 50 10 10 20 20 50 50 10 10 20 20 50 50

Agua (µ l) 190 190 180 180 150 150 190 190 180 180 150 150 190 190 180 180 150 150

Absorbancia 0,07 0,06 0,13 0,131 0,316 0,314 0,103 0,082 0,286 0,199 0,458 0,491 0,08 0,072 0,119 0,132 0,291 0,297

Proteína (mg/ml) 24,2 21,1 23,7 24,1 23,8 23,6 15,0 11,8 21,5 14,8 13,9 14,9 11,5 10,3 8,7 9,7 8,8 8,9

23,4 14.1 9,7

8
 Método de Bradford
Método colorimétrico para dosar proteínas.
Utiliza el colorante Azul brillante de Coomassie (Coomassie Brilliant
Blue G-250), el cual se une a las proteínas en medio ácido formando
complejos azules que presentan un máximo de absorción a 595nm.

Rvo de Bradford : Azul de coomasie G-250,etanol , Ac. fosfórico , agua.

Procedimiento

• 0.2 ml dilución muestra + 1 ml Rvo Bradford  10 min 

formación de complejos azules
• Leer DO 595 nm

9
 Electroforesis

Criterio de pureza (Qué pasa si corriendo con SDS aparecen dos

bandas?)
Determinación de PM (SDS-PAGE)
Determinación de PI (isoelectroenfoque)
Criterio de identificación (western blot)
10
Diagnóstico de Anemia falsiforme o Drepanocitica (Hemoglobinopatía
S)

Electroforesis sobre acetato de

celulosa a pH: 8.6

Revelado con Coomasie-Blue vs Revelado con Ag

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 Técnicas de purificación de proteínas

Por solubilidad:
• precipitación isoeléctrica
• precipitación por salado

Por tamaño:
• diálisis
• centrifugación en gradiente de densidad
• cromatografía de exclusión molecular

Por carga:
• cromatografía de intercambio iónico
• electroforesis bidimensional

Por afinidad:
• cromatografía de afinidad

12
Muestras:
Órganos o tejidos
Cultivos celulares
Proteínas recombinantes

13
 Diálisis Cromatografia de exclusión
molecular

Centrifugación en gradiente
de densidad

14
Cromatografia de intercambio iónico

Intercambiador Intercambiador
catiónico aniónico

15
Cromatografia de afinidad

16
1. ¿ Cómo determinamos que la proteína está pura?

2. ¿ Cómo determinamos que la proteína que

purificamos es la que nos interesa?

17
 1. ¿ Cómo determinamos que la proteína está pura?

La actividad específica es una medida de pureza: aumenta durante la

purificación de la proteína y llega a ser máxima y constante cuando la
proteína está pura.

18
1. ¿ Cómo determinamos que la proteína está pura?

19
2. ¿ Cómo determinamos que la proteína que
purificamos es la que nos interesa?

Medida de la actividad enzimática

Western blot

Ensayos biológicos

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Western Blot como criterio de identificación

SDS-PAGE las calles corresponden a:

1-marcador de PM
2-cultivo sin inducir
3-cultivo inducido con 0.4 mM de IPTG
4-sobrenadante ingreso a columna G50
5-pellet (descartado)
6-ACBP eluída 10 µ l
7-ACBP eluída 18 µ l
8-Homogenato de hígado

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1- s/i
2- c/i IPTG 0,05 mM
3- pellet del lisado
4- sobrenadante del lisado DO= 1,426
5- sobrenadante mtra+resina agito
O/N
6- descarte del primer lavado
7, 8- lavado para elusion de prot
inespecíficas hasta DO< 0,05
(> [imidazol])
9, 10, 11, 12- elusion T7 RNA
polimerasa DO= 1,770; 1,223; 0,439;
0,211

1- marcador PM 500 pb
2- transcripción con T7 comercial
3- transcripción con nuestra T7 0,5 ul
4- idem con 0,9 ul

1- marcador PM 250 pb
2- pcr como control de PM
3- transcripción del molde de pcr
4- idem pero con mas [NTP’s]

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 Métodos para determinar el PM
SDS-PAGE

Cromatografía de exclusión molecular (proteína nativa): graficar

log PM vs tiempo o volumen de elusión

Equilibrio de sedimentación (proteína nativa):

S = m(1- dmedio/dpartícula) S: coeficiente de sedimentación (seg)

f m: masa de la partícula
f: coeficiente de fricción
x: distancia desde el centro de rotación
S = dx/dt w: velocidad angular de rotación
w2x
23