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Radiobiologia e Fotobiologia Capitulo Vii

Radiobiologia e Fotobiologia Capitulo Vii

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CAPÍTULO VII
MECANISMOS CELULARES DE REPARAÇÃO
A PRESERVAÇÃO DA INFORMAÇÃO GENÉTICA
O papel biológico desempenhado pelas moléculas de DNA exige que elas possuam duas propriedadesfundamentais: autorreplicação e preservação da informação genética.Para que o conteúdo informacional do DNA seja preservado e corretamente transmitido, de geração emgeração, é indispensável que haja fidelidade na replicação semiconservativa e que existam mecanismos capazesde reparar modificações estruturais produzidas no material genético por agentes físicos ou químicos do meioambiente.Erros na replicação semiconservativa podem ocorrer espontaneamente, mas, ao final da replicação, sãobastante raros (1 em 10
9
-10
11
bases incorporadas) dada a existência de mecanismos capazes de impedí-los oucorrigí-los. Durante a formação das novas cadeias polinucleotídicas, além das diferenças de afinidade das basesnitrogenadas [formação preferencial de pares entre adenina e timina (A:T) ou entre citosina e guanina (C:G)](
Figura VII-1
), a atuação seletiva da DNA polimerase e sua capacidade exonucleolítica (“editorial”) que,agindo no sentido 3’
5’, elimina nucleotídeos incorretamente inseridos, evita grande parte dos erros deemparelhamento. Em
 E. coli,
a DNA polimerase III (Pol III), responsável pela replicação semiconservativa éuma enzima constituída de 10 proteínas (subunidades) diferentes e cada célula contém de 10 a 20 moléculas,que polimerizam de 500 a 1.000 nucleotídeos por segundo. Esta polimerase erra 1 em 10
4
-10
5
basesincorporadas. A atividade de “revisão editorial” (exonuclease 3'
5') encontra-se na subunidade epsilon (
ε
),codificada pelo gene
dnaQ
(
mutD)
(
Figura VII-2
) e após sua ação (
Figura VII-3
) o número de bases erradaspassa para cerca de 1 em 10
7
bases incorporadas.
(a) Emparelhamento correto(b) Emparelhamento incorreto1 em 10
4
bases
Figura VII-1 –Emparelhamento correto e incorreto das bases nitrogenadas do DNA
 
 
VII 2
 
Figura VII-2 -Estruturas da DNA polimerase durante a polimerização e da editoraçãoP = Polimerização; E = Editoração (exonucleolítica)
E = subunidade
εεεε
= Exo 3’ 5’ (
mutD
=
dnaQ
)
POLIMERIZAÇÃOEDITORAÇÃO
Adaptado de:
Fita moldeDNA neossintetizado
 
Figura VII-3 -Correção de erros de emparelhamento pela subunidade εda DNA polimeraseIncorporação deG no lugar de AA subunidadeεexcisa Gatravés da atividade3’→ 5’ exonucleaseA síntese prosseguecom a incorporaçãocorreta de A
 
Em células humanas a polimerização é mais lenta (em torno de 50 nucleotídeos por segundo) e ocomplexo de replicação é composto pelas DNA polimerases alfa (Pol
αααα
), delta (Pol
δδδδ
) e épsilon (Pol
εεεε
),sendo que a atividade de “revisão editorial” encontra-se nas duas últimas. Os erros das DNA polimeraseshumanas são semelhantes aos de
 E. coli
e, considerando o tamanho do genoma humano (cerca de 3x10
9
 pares de nucleotídeos), um erro em 10
7
pode gerar milhares de erros de emparelhamento durante aduplicação do DNA. 
Além dos erros normais das polimerases outros ocorrem por incorporação de nucleotídeos lesados [8-oxo-GTP (GO) pode parear com adenina] ou por nucleotídeos normais em oposição a bases lesadas [timinapode parear com O
6
-metilguanina (O
6
MeG)]. Em sequências repetitivas ocorre deslizamento das polimerases eaparecimento de deleções e inserções.Finalmente as células bacterianas assim como as eucarióticas possuem polimerases especializadas nasquais a fidelidade de replicação é baixa e, portanto, cometem muitos erros. As representantes destaspolimerases em
 E. coli
são as DNA polimerases II, IV e V e em eucariotos estão incluídas as polimerases da
 
VII 3
família X [polimerases beta (
β
) e lambda (
λ 
)] e as da família Y [polimerases eta (
η
), iota (
ι 
) e kappa (
κ 
)]. Estaspolimerases não têm a “função editorial” e erram muito (1 em 10
4
para as da família X e 1 em 10 para as da Y).
Correção de erros de emparelhamento em longos fragmentos (Mismatch Repair – MMR)
Após a replicação, os erros que escaparam da “edição” das DNA polimerases necessitan ser corrigidospor meio de enzimas capazes de remover bases nitrogenadas incorretamente incorporadas à cadeia ou dedegradar segmentos nos quais tenham ocorrido erros, ou ainda, eliminar bases alteradas ou lesadas; para tal, éindispensável a distinção entre as hélices neossintetizadas e as preexistentes, o que depende dos diferentesgraus de metilação existentes entre elas.Em
 E. coli
, na hélice neossintetizada a adenina das milhares de sequências 5’G
A
TC3’ não estámetilada. Na hélice parental a adenina está metilada na posição N
6
(N
6
MeA) pela DNA-adenina metilase (32kDa), produto do gene
dam
. Quando persistem erros de emparelhamento, após a replicação, algumas enzimasentram em ação; as proteínas MutS e MutL reconhecem os erros de emparelhamento e a proteína MutH corta oDNA no sitio 5’ de G de uma das sequências 5’G
A
TC3’ não metiladas adjacentes. Posteriormente a DNAhelicase II, produto do gene
uvrD
(
mutU 
,
recL
,
uvrE 
), em conjunto com proteínas que se ligam à hélice simples(SSB) abrem o fragmento e as exonucleases digerem o DNA. A PolIII sintetiza de novo, conforme mostrado na
Figura VII-4
.
Figura VII-4 –Correção de erros de emparelhamento em grandes fragmentos (MMR)
E. coli 
 Embora a eficiência do reparo de alguns erros dependa da sequência, em
 E. coli
o único erro para oqual a correção é muito difícil é o par C:C, e o par mais facilmente corrigido é o G:T. Além dos erros deemparelhamento o sistema também repara deleções ou inserções de até quatro nucleotídeos, originadas pelodeslizamento da DNA polimerase, normalmente em sequências repetitivas.A reparação é iniciada pela ligação do homodímero de MutS (95 kDa) ao erro, seguida da ligação deMutL (68 kDa), também na forma de homodímero, dependente da hidrólise de ATP. A ligação deste complexo,principalmente MutL, leva à ativação de uma endonuclease G
A
TC latente, associada à proteína MutH (25kDa), a qual incisa a ligação 5’ da guanina na sequência G
A
TC não metilada.O sítio GATC pode dirigir a correção de um erro distante de até 1 kb, mas o sinal é muito reduzidoquando a distância ultrapassa 2 kb.A combinação MutSLH parece “sentir” a presença do erro e da não-metilação, acreditando-se que paraisto se forme uma estrutura alfa (
α
), que talvez seja a ativadora de MutH.A reação é estritamente exonucleolítica, iniciando-se no corte em GATC e prosseguindo através do erroaté cerca de 100 bases após. A função exonucleolítica é bidirecional; no sentido 5’
3’ é feita pelaexonuclease RecJ ou pela exonuclease VII (produto do gene
 xseA
) e no sentido 3’
5’ é feita pela exonucleaseI (produto do gene
sbcB
), pela exonuclease VII ou pela exonuclease X.Como essas exonucleases só agem em hélice simples é necessário que a helicase II (produto do gene
uvrD
), seja utilizada para desenrolar o DNA e permitir a entrada das exonucleases.

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