ENZIMAS USADAS EN

CLONAJE MOLECULAR

1- Enzimas de Restricción
2.- Otras enzimas

B. Paz
2011-I ( Ing. Biotecnológica)
MAPA DE RESTRICCION DEL pBR
322
OTRAS ENZIMAS USADAS EN
CLONAJE MOLECULAR
 Recomendaciones para su uso:
 Nunca usar una de estas enzimas en una
reacción que contiene < 0.1 mg/ml de proteína.
En estos casos usar BSA
 Trabajan eficientemente sólo cuando la
concentración de sustrato es la adecuada. Tratar
siempre de trabajar a concentraciones cercanas a
la Km.
 Usar el pH, Temperatura y los requerimientos
iónicos que les corresponde
RELACION DE ENZIMAS(I)

 DNA POLIMERASAS:
 DNA POLIMERASA I (Holoenzima)
 FRAGMENTO KLENOW DE LA DNA POL I
 DNA POLIMERASA DE T4
 DNA POLIMERASA DE T7
 Taq DNA POLIMERASA
 TRANSCRIPTASA REVERSA
 DNA POLIMERASA TRANSFERASA TERMINAL
RELACION DE ENZIMAS (II)
 RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTES:

 LIGASAS

 QUINASAS

 FOSFATASAS
RELACION DE ENZIMAS (III)

 NUCLEASAS:
 Nucleasa Bal 31
 Nucleasa S1
 Ribonucleasa A
 Ribonucleasa T1
 Desoxirribonucleasa I
 Exonucleasa III
 CARACTERISTICAS DE
LAS DNA POLIMERASAS
Son usadas en varias etapas del clonaje molecular
en donde se sintetiza DNA
La mayoría requiere de un molde y sintetizan un
producto complementario
Pueden también copiar RNA pero lo hacen con muy
poca eficiencia
Las más usadas son : DNA pol I, fragmento Klenow,
DNA pol T4, DNA pol T7, Taq polimerasa,
Transcriptasa reversa y DNA pol transferasa terminal
COMPARACION DE LA ACCION DE LAS DNA
POLIMERASAS

DNA pol pol I F. K. Taq pol R.T.

-
Polimeriza
+ + + +
5’→3’
Exonucleasa
+ - + +
5’→ 3’

Exonucleasa
+ + - -
3’→ 5’
Actividad
RNAasa H
+ - - +
P.M.(Kd) 109 76 94 84 y 170
No Unid. 1 1 1 1y2
1.1 DNA POLIMERASA I
(Holoenzima)
Características:
1. Tiene una sóla cadena polipeptídica
2. P.M de 109,000
3. Actividad polimerizante 5’→ 3’
4. Actividad exonucleásica 5’→3’ y 3’→5’
5. Tiene actividad RNAasa H
DNA POLIMERASA I (Holoenzima)

USOS:
 Marcación de DNA mediante “nick
translation”
 Fue usada originalmente para copiar la
cadena complementaria del cDNA en el
clonaje del cDNA
 Marcar el extremo 3’ del DNA
1.2 FRAGMENTO KLENOW
(Fragmento largo de la DNA de la DNA polimerasa I)
 Características:
1. En 1970 Klenow y Henningsen mediante
tratamiento proteolítico limitado de la DNA pol I
obtuvieron un fragmento largo (PM 76000) que
mantenía la actividad polimerizante y
exonucleásica 3’→5’
2. Hoy día se le obtiene al tratarla con subtilisina o
mediante clonaje
3. Permite hacer algunos experimentos superando
los problemas de la acción exonucleásica 5’→3’
de la DNA pol I
FRAGMENTO KLENOW (USOS I)

 USOS:
1. Llenar los terminales 3’ creados por la
digestión del DNA con las enzimas de
restricción. Generalmente FK trabaja con el
mismo tampón que el usado para la RE.
2. Marcar el terminal de un fragmento de
DNA usando dNTPs marcados con P-32.
3. Marca terminal en la cola 3’ del DNA
FRAGMENTO KLENOW (Usos II)

 Usos:
4.- Sintetizar la hebra complementaria del
cDNA en experimentos de clonaje del
cDNA
5.- Secuenciación del DNA por el método de
Sanger (Método del dideoxi)
6.- En PCR
1.3 DNA POLIMERASA DEL
T4
CARACTERÍSTICAS:
1. A semejanza del FK la DNA polimerasa del
bacteriófago T4 tiene acción polimerizante
5’→3’ y acción exonucleásica 3’→5’, que es
más activa en el DNA de una hebra que el
de doble hebra.
2. La actividad exonucleásica de la DNA pol
del T4 es 200 veces más activa que la del
FK
DNA POLIMERASA DEL T4
 USOS ADEMAS DE LOS SEÑALADOS
PARA EL FK:
1. Marcación de fragmentos de DNA para
pruebas de hibridización, pudiendo los
fragmentos ser convertidos en pruebas
específicas mediante el uso de enzimas de
restricción.
2. Extensión de primers oligonucleotídicos
mutagénicos que se han unido a moldes de
DNA de una sola hebra.
1.4 DNA POLIMERASA DEL
BACTERIOFAGO T7
 CARACTERÍSTICAS
 Es la DNA polimerasa que se induce después de la
infección de E. coli por el bacteriófago T7
 Esta polimerasa se presenta como la unión de 2
proteínas, la proteína del gen 5 del T7 y la proteína
del hospedero tiorredoxina
 Tiene actividad polimerizante 5’→3’, carece de
actividad exonucleásica 5’→3’; pero tiene una
actividad exonucleásica 3’→5’ mil veces más activa
que la del fragmento Klenow.
1.5 Taq DNA POLIMERASA

CARACTERISTICAS(I):
 Es una DNA polimerasa (PM 94000)

termoestable purificada inicialmente del

Thermus aquaticus (Chien et al. 1976) y
posteriormente obtenida mediante ingeniería
genética (AmpliTaqTM Perkin Elmer Cetus)
 Estas enzimas tienen actividad
exonucleásica dependiente de la
polimerización 5’→3’.
Taq DNA POLIMERASA

CARACTERISTICAS (II):
 En la incorporación de nucleótidos la enzima
trabaja mejor entre 75 a 80o C.
 La actividad polimerizante se reduce a la
mitad a 60o C. y en 1/10 a 37o C.
 Requiere de iones Mg

 Los tampones fosfato inhiben a la Taq

polimerasa, debe usarse tampón Tris-HCl pH
8.3
AMIGOS
HERMANOS
Taq POLIMERASA
USOS
1. Para la secuenciación del DNA
2. Amplificación mediante PCR
A causa de la significativa amplificación
que determina, puede utilizar cantidades
muy pequeñas de DNA. Con sólo 100 ul de
sangre podemos retirar suficiente DNA para
PCR y para la detección de cualquier
mutación.
1.6 TRANSCRIPTASA REVERSA

CARACTERISTICAS (I):
 Se conocen dos formas comercialmente
disponibles de transcriptasa reversa (TR):
1. Una preparación obtenida del virus de la
mieloblastosis aviaria (AMV)
2. Una enzima aislada de una cepa de E. coli que
expresa una copia clonada del gen de la TR del
virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-
MLV)
TRANSCRIPTASA REVERSA

CARACTERÍSTICAS (II):
 Ambas enzimas carecen de actividad
exonucleásica 3’→5’
 La aviaria (AMV) tiene 2 polipéptidos que
tienen tanto la actividad polimerizante y una
poderosa actividad RNAasa H.
 La murina (Mo-MLV) es una simple cadena
polipeptídica (PM 84000), tiene actividad
polimerizante y su actividad RNAasa H es
más débil
TRANSCRIPTASA REVERSA

CARACTERISTICAS (III):
 La aviaria trabaja eficientemente a 42 o C., que es

una temperatura normal para las aves; en tanto que

la murina se inactiva rápidamente a esta
temperatura.
 Por lo anterior, los RNAs con una importante

estructura secundaria se copian mejor con la

enzima aviaria; sin embargo las preparaciones de
AMV pueden estar contaminadas con una
endonucleasa que corta el DNA
TRANSCRIPTASA REVERSA

CARACTERISTICAS (IV):
 La enzima aviaria trabaja más eficientemente a pH

8.3 que a pH 7.3 que es el más adecuado para la

murina
 Es tan crítico lo del pH que la longitud del cDNA

sintetizado por ambas enzimas se reduce cuando el

pH es diferente en tan sólo 0.2 unidades de pH del
recomendado. Como el pH del tampón Tris, varía
con la temperatura, se debe chequear el pH a la
temperatura usada para la incubación
TRANSCRIPTASA REVERSA

USOS:
1. Su principal empleo es en la transcripción del
mRNA en cDNA de doble cadena que puede ser
insertada en los vectores procarióticos; aunque
también puede ser usada tanto con DNA de una
hebra o RNA para pruebas usadas en
hibridización.
2. Para secuenciar DNA por el método del dideoxi
cuando las otras polimerasas están fallando.
- :
TRANSCRIPTASA REVERSA
 PARA LA FABRICACION DE “PRIMERS”
PARA LA T.R., SE PUEDE USAR:
 Oligo dT ( 12 a 18 nucleótidos)
 Oligonucleótidos de secuencia al azar
 Oligonucleótidos de secuencia definida

LA Km DE LA T.R. PARA LOS dNTP ES MUY

ALTA (rango milimolar); PARA PREVENIR LA
TERMINACION PREMATURA DEL DNA QUE SE
FORMA, SE DEBE USAR ALTAS
CONCENTRACIONES DE dNTP
2. RNA POLIMERASAS DNA
DEPENDIENTES
 RNA POLIMERASAS DE LOS FAGOS SP6, T7 y
T3.
CARACTERÍSTICAS
 Los fagos señalados sintetizan una RNA polimerasa
DNA dependiente que reconocen e inician la
síntesis de RNA sobre moldes de DNA de doble
hebra, que llevan el promotor apropiado específico
del fago
 Los genes de estas enzimas han sido clonados y se
expresan en E.coli y levadura
RNA POLIMERASAS DNA
DEPENDIENTES
 USOS
1. Síntesis de RNA de una hebra para ser usado
como prueba para hibridización
2. Síntesis de RNA para ser usado como mRNA
funcional para traducción “in vitro”
3. Síntesis de RNA para ser usado para estudiar
el “splicing” “ in vitro”
4. Para transcripción de genes clonados en
bacterias y levaduras
RNA POLIMERASAS DNA
DEPENDIENTES
ACCION DE LAS RNA POL. DE SP6,T3 y T7
Actividad : Polimeriza el RNA en sentido 5’→ 3’
Sustrato : DNA de doble hebra conteniendo el promotor
específico.
Ejemplo:

5’ SP6 GATCATCATCATCGAT C
PROMOTOR
3’ CTAGTAGTAGTAGCTAG
Mg2* RNA pol de SP6
rATP,rGTP,rUTP y rCTP ↓
5’ppp G A U C A U C A U C A U C G A U C
3. DNA LIGASAS
 Las DNA Ligasas son enzimas usadas para
unir dos piezas de DNA
 Las más usadas son:
 DNA ligasa del bacteriófago T4
 DNA ligasa de E. coli
DNA LIGASA
 3.1 DNA LIGASA DEL BACTERIOFAGO T4
 Polipéptido de 68 000 daltons de P.M. que cataliza la
formación de enlaces fosfodiéster entre el 3’ hidroxilo y el 5’
fosfato terminal en el DNA
 USOS:
 Unir moléculas de DNA con terminales cohesivos

-Esta acción es estimulada por PEG a bajas

concentraciones y requiere de ATP y iones Mg
 Unir moléculas de DNA con terminales romos

- Es más lenta que la acción anterior pero aumenta su

velocidad en presencia de NaCl 200 mM
DNA LIGASA

 3.2.- DNA LIGASA de E. coli

 Cataliza la formación de enlaces diéster fosfóricos en
los terminales cohesivos del DNA
 Los estudios iniciales indicaron que no unía terminales
romos, pero se ha mostrado que en presencia de PEG
puede hacerlo
 No une segmentos de RNA
 Es de menos uso que la DNA ligasa de T4
RNA LIGASA DE
BACTERIÓFAGO T4
 Características:
 La RNA ligasa del bacteriófago T4 cataliza la unión
covalente de fragmentso de RNA o de DNA de una hebra.
Usos:
- Como puede usar como sustratos mononucleótidos
(ejemplo pNp) se le puede usar para marcar el 3’ terminal
del RNA
- Síntesis de oligodesoxirribonucleótidos
4. POLINUCLEOTIDO QUINASA
DEL BACTERIOFAGO T4
 CARACTERISTICAS:
Cataliza la transferencia del fosfato γ del ATP al
extremo 5’ terminal del DNA y RNA
USOS:
-Marcación del extremo 5’ terminal del DNA para
la secuenciación de DNA por el método de
Maxam-Gilbert
-Forforilación de linkers sintéticos
5. FOSFATASAS ALCALINAS

 CARACTERISTICAS
 Se usa con mayor frecuencia la fosfatasa
alcalina bacteriana (BAP) y la fosfatasa
alcalina de intestino de ternero (CIP).
 Catalizan el retiro del residuo 5’ fosfato del
DNA tanto del RNA, DNA y de rNTPs y
dNTPs
FOSFATASAS ALCALINAS

 USOS:
 Retiro de los fosfato 5’ del DNA y

RNA antes de sustituirlo por fosfato

marcado con P-32
 Retiro de los 5’ fosfato del DNA

para prevenir su unión.

6. NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31

 CARACTERISTICAS:
 BAL 31 es predominantemente una exonucleasa
3’ que retira mononucleótidos de ambos extremos
3’ de las dos hebras del DNA.El DNA de una
hebra que va dejando es degradado por su
acción endonucleásica
 La reacción es estrictamente dependiente de
calcio y por lo tanto puede ser detenida en
cualquier momento por la adición de agentes
quelantes del Ca como el EGTA
NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31
 USOS:
 Remoción de nucleótidos del extremo terminal

del DNA en una manera controlada.

 Mapear sitios de restricción en el DNA

 Mapear estructura secundaria del DNA( lugares

de unión entre B-DNA y Z-DNAy sitios de

modificaciones covalentes y no covalentes en el
DNA e doble hebra)
 Remoción de nucleótidos de RNA de doble hebra
NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31
 DETERMINACION DE LA VELOCIDAD DE REMOCION DE LOS
NUCLEÓTIDOS:

 2Vmáx . Mn
 V = ---------------------------

( Km + (S))

 Donde : Vmax de la reacción

Mn el P.M, promedio de un
mononucleótido
(S) Moles/L de DNA en el tiempo O
NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31

 OBSERVACION IMPORTANTE:
Cuando los productos de la digestión de Bal 31 serán
ligados, se debe tener muy en cuenta que la actividad
exonucleásica 3’ de la enzima es 20 veces más
eficiente que la actividad endonucleásica.
Lo anterior determina que el tratamiento con DNA
polimerasa de T4 o el fragmento Klenow deben ser
usados para digerir las colas de una hebra que van
quedando.
Almacenar la enzima a cero grados, no congelada.
ACCION DE LA NUCLEASA BAL 31

 5’ ----------------------------- 3’
 3’ ----------------------------- 5’
 ↓
 ------------------
 ------------------
 ↓
 -------
 ------- (10 A 20% )
NUCLEASA S1
 CARACTERISTICAS:
 La nucleasa S1 degrada DNA y RNA de
hebra simple para dar nucleótidos 5 fosfato
( dN ó rN)
 Los DNA y RNA de doble hebra y los
híbridos DNA-RNA son relativamente
resistentes a la enzima; pero esto se supera
cuando se usan concentraciones grandes
de la enzima
PROTECCION DEL ADN CON NUCLEASA S1
RIBONUCLEASA A DE PANCREAS
DE BOVINO
 CARACTERISTICAS:
 RNAasa A es una endorribonucleasa que ataca
especificamente RNA de una hebra en el extremo 3’ de
sus nucleótidos pirimidínicos, rompiendo la unión del
fosfato al nucleótido adyacente
 Sus productos son nucleótidos pirimidínicos 3’ fosfato y
oligonucleótidos con terminal nucleotídico pirimidínico 3’
fosfato

 5’pApGpGpCpCpApGpUpAp3’ > 5’pApGpGp + Cp +

Cp
 + ApGpUp + Ap 3’
RIBONUCLEASA A DE PANCREAS

 La RNAasa A es DE BOVINO
activa en ausencia de cofactores y
cationes divalentes; pero es inhibida por el inhibidor
placentario de la RNAasa o por los complejos vanadil
ribonucleósidos.

 USOS
 Retiro de regiones no hibridizadas de RNA en los

híbridos DNA-RNA
RIBONUCLEASA T1 ( Aspergillus
oryzae)
 CARACTERISTICAS
 RNAasa T1 es una endorribonucleasa que ataca
especificamente ataca los grupos 3’ fosfato de los
nucleótidos de guanina y rompe el enlace 5’ fosfato al
nucleótido adyacente.
 Los productos finales son guanosina 3’ fosfato y
oligonucleótidos con terminal en guanosina3’ fosfato.

 5’pApGpGpCpUpGpApC 3’ > 5’pApGp + Gp + CpUpGp

 + ApC 3’
RIBONUCLEASA T1 ( Aspergillus
oryzae)
 USOS:

 Retiro de regiones de RNA de los híbridos DNA-RNA

 DESOXIRRIBONUCLEASA I
(DE PÁNCREAS DE BOVINO)
 CARACTERISTICAS:
 DNAasa I es una endonucleasa que hidroliza DNA de
doble hebra o de hebra simple preferencialmente en los
lugares adyacentes a nucleótidos pirimidínicos
 En presencia de iones Mg la DNAasa I ataca cada
cadena de DNA independientemente
 En presencia de iones manganeso la DNAasa I ataca
ambas cadenas de DNA a aproximadamente el mismo
lugar dando fragmentos de DNA que son romos o que
sobresalen solamente en uno o dos nucleótidos (Melgar
E.y Goldthwait D.A. J. Biol. Chem 243:4409, 1968 )
 DESOXIRRIBONUCLEASA I
(DE PÁNCREAS DE BOVINO)
 USOS:
 Introduciendo huecos al azar en el DNA de doble
hebra en preparaciones para “ nick translation”.
 Introduciendo un solo hueco en DNAs circulares en
preparaciones para mutaciones mediadas por
bisulfito
 Generando clones al azar para secuenciación en
vectores del bacteriófago M13
 Análisis de complejos proteína-DNA (DNAasa
footprinting)
EXONUCLEASA III
( E. coli )
 CARACTERISTICAS
 La exonucleasa III cataliza el retiro de mononucleótidos
5’ del extremo 3’ terminal del DNA de doble hebra, no
tiene actividad sobre DNAs de una hebra
 Tiene como otras actividades añadidas una actividad
endonucleasa específica para DNAs apurínicos y
RNAasa H

 5’ p----------------------------------OH 3’
 3’OH------------------------------P 5’
 ↓
 EXONUCLEASA III
(E. coli )
ACTIVIDAD:

 5’ p----------------------------------OH 3’
3’OH------------------------------P 5’
↓

5’P---------------------OH 3’

3’OH--------------------P 5’
+ 5’pN OH