Professional Documents
Culture Documents
PETA RESTRIKSI
Di dalam Bab VIII ini akan dibahas pengertian dan kegunaan peta restriksi serta
komponen-komponen yang diperlukan dan cara pembacaannya. Setelah mempelajari
pokok bahasan di dalam bab ini mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan
1. pengertian dan kegunaan peta restriksi,
2. komponen-komponen reaksi restriksi,
3. pembacaan peta restriksi
Pengetahuan awal yang diperlukan oleh mahasiswa agar dapat mempelajari pokok
bahasan ini dengan lebih baik adalah dasar-dasar teknologi DNA rekombinan dan
konstruksi perpustakaan genom, yang masing-masing telah dibicarakan pada Bab V dan
VI.
pada plasmid dalam MCS (Multiple Cloning Site) memudahkan para pengguna dalam
menentukan jenis enzim restriksi yang akan digunakan.
Contoh kasus. Suatu DNA asing yang sudah diketahui urutannya disisipkan
pada pUC19 pada situs SmaI. Untuk mengetahui orientasi DNA insert , dilakukan
pemotongan dengan enzim restriksi selain SmaI tetapi masih ada dalam MCS, misalnya
EcoRI serta BamHI yang diketahui dapat memotong insert.
Gambar 2. Penentuan orientasi insert 3 kb dalam plasmid pUC19 (ukuran pUC19 2,68
kb). Keterangan hasil elektroforesis: M adalah marker, 1 adalah plasmid yang dipotong
dengan EcoRI, 2 adalah plasmid dari koloni 1 yang dipotong dengan EcoRI-BamHI, 3
adalah plasmid dari koloni 2 yang dipotong dengan EcoRI-BamHI
Gambar 3. Marker DNA dari DNA λ strain X174RFDNA yang dipotong dengan HaeIII
Marker DNA dari DNA λ strain X174RFDNA yang dipotong dengan HaeIII
akan menghasilkan 5 pita dengan ukuran 1353 pb, 1078 pb, 872 pb, 603 pb, dan 310 pb
yang sudah bisa diketahui sebelumnya lewat hasil sekuensing. Seperti halnya fungsi
marker DNA lainnya, marker ini dapat digunakan untuk menduga ukuran DNA lain
seperti untuk mengetahui ukuran produk PCR dan sebagainya.
Fungsi lain peta restriksi adalah menduga kedekatan kekerabatan antarindividu.
Seperti diketahui bahwa makin dekat hubungan kekerabatan suatu individu dengan
individu lain, maka urutan DNAnya makin mirip. Oleh karenanya, pola-pola pita restriksi
yang dihasilkan pada pemotongan DNAnya juga menunjukkan kemiripan. Namun, tidak
ada suatu individu yang memiliki urutan DNA yang tepat sama dengan individu lainnya
sekalipun berasal dari satu induk, kecuali individu tersebut adalah kembar identik. Pada
individu kembar identik pola pita restriksi akan sama persis satu sama lain. Teknik untuk
menduga kedekatan kekerabatan antarindividu dengan menggunakan enzim restriksi
sering disebut dengan teknik RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
RFLP selain digunakan untuk menduga kedekatan kekerabatan juga dapat
digunakan untuk mendeteksi penyakit serta membantu memecahkan masalah kriminal.
Berikut salah satu penggunaan RFLP untuk mendeteksi penyakit anemia sickle cell.
122
Gambar 4. RFLP gen β globin yang dipotong dengan enzim restriksi MstII
Gen β globin manusia sepanjang 1,4 kb memiliki situs enzim restriksi MstII.
Orang yang menderita penyakit anemia sickle cell mengalami mutasi pada gen tersebut
Kodon keenam gen β globin manusia normal menyandi asam amino glutamat (GAG),
sedangkan pada penderita anemia sickle cell kodon tersebut mengalami mutasi menjadi
kodon penyandi asam amono valin (GTG) sehingga menyebabkan hilangnya situs
restriksi MstII. Saat gen β globin dipotong dengan MstII, pada manusia normal akan
diperoleh pita berukuran 1,2 kb dan 200 pb, sedangkan pada penderita penyakit anemia
sickle cell akan diperoleh pita berukuran 1,4 kb. Sementara itu, pada carrier akan
diperoleh tiga pita, masing-masing dengan ukuran 1,4 kb; 1,2 kb; dan 200 pb.
yang diperoleh tidak nampak semua saat dielektroforesis. Demikian pula, jika DNA yang
akan direstriksi jumlahnya terlalu banyak, maka saat dielektroforesis sisa DNA yang
belum terpotong akan terlihat.
Penggunaan enzim restriksi selain memperhatikan unit aktivitasnya juga harus
memperhatikan bufer yang digunakan. Umumnya produsen enzim restriksi selalu
memberikan petunjuk penggunaan bufer, terutama bila akan dikombinasikan dengan
enzim restriksi lainnya. Hal ini penting sekali karena dalam bufer biasanya ditambahkan
kofaktor seperti DMSO, MgSO4, albumin, ataupun urea. Namun, setiap enzim memiliki
kofaktor sendiri-sendiri yang kadang kala tidak sama dengan enzim restriksi lainnya.
Oleh karena itu, sangat disarankan bila ingin menggunakan kombinasi enzim restriksi
sebaiknya menggunakan enzim-enzim restriksi dari satu produsen saja.
Gambar 5. Gambar peta restriksi suatu DNA yang dipotong dengan enzim restriksi HhaI,
EcoRV, dan HaeIII.
3. Persamaan linier yang diperoleh digunakan untuk menduga ukuran pita DNA
lainnya yang dielektroforesis bersamaan dengan marker.
Contoh: jika diperoleh persamaan y= -0,317x + 4,464 (persamaan di atas)
dan jarak migrasi DNA lain yang dielektroforesis bersama dengan marker
adalah 5,06 cm, maka jarak sebenarnya adalah (anlog 2,8396 ) = 750 pb.
4. Bila seluruh pita sudah diketahui ukuran sebenarnya, maka buatlah skema
peta restriksi yang mencerminkan ukuran dan posisi pemotongan enzim
restriksi berikut nama enzimnya.
Contoh:
126
Gambar 8. Peta situs restriksi fragmen gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 (linier)