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A LA
BIOLOGÍA MOLECULAR
Y CELULAR
2011
(en su 28º año consecutivo)
http://www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/ibmc
GUÍA DE SEMINARIOS
INCLUYE:
- Listado de docentes
- Programa teórico
- Bibliografía
- Cine
- Calendario de seminarios y parciales
- Régimen de promoción
IBMC 2011
Listado de docentes:
Profesor colaborador:
Profesores invitados:
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PROGRAMA TEÓRICO:
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11) El núcleo celular. La organización del DNA en cromosomas. Histonas y proteínas no-
histónicas. El nucléolo. La membrana nuclear. Organización de las secuencias del DNA:
repetitivas y únicas. El ciclo celular. Mitosis. Control de la división celular. Meiosis. Reseña de
la genética mendeliana: genotipo, fenotipo, homocigosis, heterocigosis, dominancia, co-
dominancia, alelos múltiples. Leyes de Mendel y sus bases citológicas. Transferencia de
material genético.
14) Neuronas. Los canales activados por voltaje y el potencial de acción. Transmisión
sináptica. Neurotransmisores. Desarrollo y conservación de la estructura neuronal. El
desarrollo de las conexiones neuromusculares. Concepto de barrera hematoencefálica.
Proteínas de transporte. Las bombas protónicas. Transporte de moléculas pequeñas.
Transporte activo. Gradientes iónicos. ATPasas. Bombas aspirantes e impelentes. Canales
iónicos. Ionóforos.
15) Cómo se comunican las células entre sí: las señales claves. Mediadores químicos locales,
hormonas y neurotransmisores. Receptores: de membrana e intracelulares. Concepto de
unión (binding) de ligando a receptor. Segundos mensajeros: el AMP cíclico y el calcio.
Modo de acción de los segundos mensajeros. Genes cuyos productos regulan la respuesta
celular a señales externas: oncogenes.
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BIBLIOGRAFÍA
1) Alberts et al. Molecular Biology of the Cell (5 a edición, incluye CD interactivo). Garland
Publishing, New York & London (2007).
http://www.taylorandfrancis.com/books/details/9780815341116/
3) Alberts, B., Bray, D., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. y Walter, P. Essentials in Cell
Biology. An Introduction to the Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, New York &
London (2003).
4) Alberts, B., Bray, D., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. y Walter, P. Introducción a la
Biología Celular. Traducción al español de la cita 3. Omega, Barcelona.
6) Lodish, H., Berk, A., Lawrence Zipurski, S., Matsudaira, P., Baltimore, D. y Darnell, J. E.
Biología Celular y Molecular. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, 2005 (traducción
de la 5a edición en inglés)
7) Lewin, B. Genes VIII. John Wiley & Sons (2002). Relacionado con este importante texto y
con experimentos claves en la biología molecular consultar el sitio www.ergito.com
9) Freeland Judson, H. The Eighth Day of Creation. Makers of the Revolution in Biology.
Penguin Books, London (1995).
10) Purroy, J. La era del genoma. Salvat ciencia. Barcelona (2001). Se consigue en librerías
Distal, Corrientes 913, Cap. Fed.
13) Sulston, J, Ferry, G. El hilo común de la humanidad. Siglo XXI de España (2003).
BÚSQUEDAS BIBLIOGRÁFICAS
Para buscar citas de trabajos originales publicados en revistas científicas en inglés mediante
el uso de palabras presentes en sus títulos o resúmenes (abstracts) o el apellido de sus
autores, se puede consultar la base de publicaciones más importante en ciencias
biomédicas y biotecnología, llamada PubMed, a la siguiente dirección de internet:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/
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TRABAJOS PRÁCTICOS: Asistencia obligatoria. El alumno queda libre si tiene más del 20% de
inasistencias.
SEMINARIOS: Asistencia obligatoria. El alumno queda libre si tiene más del 20% de
inasistencias.
FIRMA DE LOS TRABAJOS PRÁCTICOS: Aprobarán los Trabajos Prácticos aquellos alumnos que
hayan: 1) Aprobado los dos parciales teóricos o sus respectivos recuperatorios. 2) Aprobado
el parcial práctico o su recuperatorio. 3) Asistido al 80% de los TTPP. 4) Asistido al 80% de los
Seminarios. 5) Presentado TODOS los informes requeridos por el JTP.
PROMOCIÓN SIN EXAMEN FINAL: Aprobarán la materia sin rendir examen final los alumnos
que: 1) Estén en condiciones de firmar los TTPP, incluso aquellos que hayan rendido y
aprobado el recuperatorio del parcial práctico. 2) No hayan recuperado ninguno de los 2
parciales teóricos. 3) Sumen al menos 135 puntos entre los dos parciales teóricos. 4) Hayan
llenado la encuesta obligatoria a través de la web.
La nota final de promoción se calcula como 0,8 x nota promedio parciales teóricos + 0,2 x
nota parcial práctico, y eso se redondea sin decimales: por ej., un 84,5 es un 85 y por lo
tanto es un 9, pero un 84,4 es un 8.
EXAMEN FINAL: Todos aquéllos que hayan firmado los TTPP y que no reúnan las condiciones
para promocionar sin examen final, podrán rendir examen final en las fechas estipuladas
por la Facultad siempre que hayan llenado la encuesta obligatoria a través de la web.
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FIRMA DE LOS TRABAJOS PRÁCTICOS: Aprobarán los Trabajos Prácticos aquellos alumnos que
hayan: 1) Aprobado el parcial teórico o su recuperatorio. 2) Aprobado el parcial práctico o
su recuperatorio. 3) Asistido al 80% de los TTPP. 4) Asistido al 80% de los Seminarios. 5)
Presentado TODOS los informes requeridos por el JTP.
PROMOCIÓN SIN EXAMEN FINAL: Aprobarán la materia sin rendir examen final los alumnos
que: 1) Estén en condiciones de firmar los TTPP, incluso aquellos que hayan rendido y
aprobado el recuperatorio del parcial práctico. 2) No hayan recuperado el parcial teórico.
3) Hayan obtenido al menos 68 puntos en el parcial teórico. 4) Hayan llenado la encuesta
obligatoria a través de la web.
La nota final de promoción se calcula como 0,8 x nota parcial teórico + 0,2 x nota parcial
práctico, y eso se redondea sin decimales: por ej. , un 84,5 es un 85 y por lo tanto es un 9,
pero un 84,4 es un 8.
EXAMEN FINAL: Todos aquéllos que hayan firmado los TTPP y que no reúnan las condiciones
para promocionar sin examen final, podrán rendir examen final en las fechas estipuladas
por la Facultad siempre que hayan llenado la encuesta obligatoria a través de la web.
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Películas cuyo contenido está relacionado con temas que se discuten en la materia:
1) Heredarás el Viento (Inherit the Wind) (EEUU, 1960) 127 min. Dirigida por Stanley Kramer,
con Spencer Tracy, Fredric March y Gene Kelly. Basada en un caso real.
2) Heredarás el Viento (Inherit the Wind) (EEUU, 1988) Telefilm "remake" del anterior con Jason
Robards y Kirk Douglas.
3) Los Niños del Brasil (The Boys from Brazil) (EEUU, 1978) 123 min. Dirigida por Franklin J.
Shaffner, con Gregory Peck, Laurence Olivier, James Mason y Lilli Palmer. Basada en la
novela de Ira Levin.
4) Parque Jurásico (Jurassic Park) (EEUU, 1993) 126 min. Dirigida por Steven Spielberg, con
Sam Neill, Laura Dern, Jeff Goldblum y Richard Attenborough. Basada en la novela de
Michael Crichton.
5) Un milagro para Lorenzo (Lorenzo's Oil) (EEUU, 1992) 135 min. Dirigida por George Miller,
con Nick Nolte, Susan Sarandon y Peter Ustinov. Basada en un caso real.
6) La bala mágica del Dr. Erlich (Dr. Erlich's Magic Bullet) (EEUU, 1940) 103 min. Dirigida por
William Dieterle, con Edward G. Robinson. Guión de John Huston. Basada en la vida del
científico alemán Paul Erlich.
7) La Vida de Luis Pasteur (The Story of Louis Pasteur) (EEUU, 1936) 85 min. Dirigida por William
Dieterle, con Paul Muni.
8) Y la Banda Siguió Tocando (And the Band Played on) (EEUU, 1993) 155 min. Dirigida por
Roger Spottiswoode, con Mathew Modine, Alan Alda, Richard Gere, Lily Tomlin, Steve Martin,
Anjelica Huston, Phil Collins.
9) Gattaca (EEUU, 1997) 112 min. Dirigida por Andrew Niccol, con Ethan Hawke, Uma
Thurman, Alan Arkin, Ernest Borgnine.
10) Avatar (EEUU, GB, 2009) 162 min. Dirigida por James Cameron, con Sam Worthington,
Zoe Saldana, Sigourney Weaver.
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ÁCIDOS NUCLEICOS I
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN
A) GUÍA DE ESTUDIO
7) Explique por qué a mayor concentración salina en el medio, la hibridación entre dos
hebras de DNA es menos rigurosa, y viceversa.
8) ¿En la molécula de DNA, qué uniones relacionan: a) dos desoxirribosas entre sí; b) dos
bases enfrentadas; c) dos bases apiladas?
9) ¿Qué secuencias del DNA son propicias para la formación de estructura Z? ¿Existe dicho Z
DNA in vivo?
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B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
a) En la figura señale, englobando con un trazo continuo, lo siguiente:
1- un nucleótido
2- un nucleósido
3- una base púrica
4- una base pirimídica
5- un puente de hidrógeno
6- una unión fosfodiéster
7- un extremo 3’
8- un extremo 5’
9- una desoxirribosa
b) ¿Qué peso molecular promedio tiene un DNA de cadena doble de 150 pares de bases
de longitud?
Dato: PM de un par de nucleótidos apareados = 650 Da
PROBLEMA 2
A diferencia de los bacteriófagos de la familia T (T2 o T4), el fago M13 no infecta a E. coli
mediante la inyección de su DNA al citoplasma, sino que penetra entero con su cápside
proteica de la cual es desnudado dentro de la bacteria. ¿Le parece a Ud. que Hershey y
Chase (experimento del fago T2 marcando proteínas con 35S y DNA con 32P, licuadora, etc.)
habrían llegado a las mismas conclusiones que llegaron si hubieran usado el fago M13 en
lugar del T2? ¿Por qué?
PROBLEMA 3
Un segmento de DNA de cadena simple tiene la siguiente composición de bases: A 31,5% C
23,7% T 17,1% G 27,7%.
¿Cuál sería la composición de bases de la cadena complementaria? ¿Cuál sería la
composición de bases de la forma de doble cadena de dicho segmento?
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PROBLEMA 4
Dadas las siguientes moléculas de ácidos nucleicos de cadena doble:
a) Ninguna de las tres moléculas puede ser degradada por una RNasa.
b) Las tres moléculas tienen igual temperatura de fusión (Tm) porque tienen la misma
longitud.
c) Las 3 tienen igual Tm porque [T]/[A] = 1 y [G]/[C] = 1 (Reglas de Chargaff)
d) Las dos hebras de cada una de ellas son antiparalelas.
e) Tm a > Tm b > Tm c
f) Tm b > Tm a > Tm c
g) Tm c > Tm b > Tm a
h) Tm a > Tm c > Tm b
PROBLEMA 5
Explique el siguiente gráfico, obtenido midiendo la absorbancia (A) de luz UV de dos
muestras de DNA sometidas cada una a calentamiento gradual:
PROBLEMA 6
¿Qué consecuencias tendría para una bacteria la pérdida, por mutación, de la actividad
nucleasa de 3' a 5' de la DNA polimerasa III? Justifique.
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PROBLEMA 7
En un tubo de ensayo se agregan los siguientes componentes para la síntesis de DNA in
vitro:
PROBLEMA 8
En un experimento, se usaron bacterias E. coli a las cuales se les introdujo el gen de una
proteína de medusas que emite fluorescencia verde, llamada “green fluorescent protein”
(GFP). Este gen había sido previamente modificado in vitro de la siguiente manera: su DNA
estaba formado por una hebra con secuencia normal (wild-type) acompañada de su
hebra complementaria que tenía una mutación, de modo de crear un apareamiento
erróneo o mismatch en uno de sus pares de bases, es decir que no cumple las reglas de
Watson-Crick. (Tal mismatch en la doble hélice resultó estable en estas bacterias porque
éstas tenían mutaciones en algunos de sus genes, que les impedían hacer la habitual
reparación de mismatches).
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PROBLEMA 9
Se quiere determinar la presencia de secuencias correspondientes al genoma del virus del
SIDA insertado en el DNA de linfocitos T de un paciente. Los linfocitos son un tipo de células
de la sangre pertenecientes al conjunto de los glóbulos blancos. En un tubo de ensayo se
agregaron los siguientes componentes para una reacción de amplificación de DNA por
PCR (reacción en cadena de la polimerasa):
- DNA molde: DNA total obtenido de linfocitos de un paciente que tiene anticuerpos anti-
retrovirus HIV circulantes en sangre.
- "primer" a, de 20 nucleótidos, cuya secuencia es complementaria a la hebra de abajo del
molde en la región a.
- "primer" b, de 22 nucleótidos, cuya secuencia es complementaria a la hebra de arriba del
molde en la región b.
- dNTPs (los cuatro desoxinucleósidos trifosfato).
- Buffer conteniendo magnesio.
- Taq polimerasa (DNA polimerasa de Thermus aquaticus).
Preguntas:
a) ¿Cuál es la longitud (en pares de bases) del producto de la PCR?
b) ¿Cuál es el peso molecular del producto de la PCR?
c) ¿Cuál es la masa aproximada de producto obtenida al cabo de 30 ciclos, si se partió de
un material conteniendo 10 moléculas de molde (genoma viral)? Considere que el nº de
moléculas de producto puede calcularse aproximadamente como x.2n, donde x = nº de
moléculas de molde y n = nº de ciclos.
d) ¿Cuál sería el producto de PCR si se omitiera…
i) uno de los "primers"?
ii) los dos "primers"?
iii) el DNA molde?
e) ¿Cuál sería el producto de PCR si se reemplazara…
i) el DNA molde por DNA obtenido a partir de células de raíz capilar del mismo
individuo?
ii) el DNA molde por ácido nucleico del virus HIV purificado?
iii) el "primer" a por otro de 20 nucleótidos, pero de secuencia complementaria a la hebra
de arriba de la región a?
iv) la Taq polimerasa por la DNA polimerasa I de E. coli ?
f) Dado que la PCR es extremadamente sensible, que controles realizaría para descartar
una eventual contaminación.
Dato: PM de un par de nucleótidos apareados = 650 Da
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PROBLEMA 10
Se desea amplificar por PCR un determinado segmento de DNA genómico como el
señalado en la parte de arriba de la Figura 1. La mezcla de reacción contiene la muestra
de DNA genómico, desoxirribonucleósidos trifosfato, buffer de pH 7 conteniendo magnesio,
los dos oligodesoxirribonucleótidos “primers” (I y II) y la Taq polimerasa. Al cabo de 30 ciclos
de PCR, se obtiene una gran cantidad de producto de PCR.
Preguntas:
a) ¿Cuál de los esquemas de la Figura 1 (A, B, C o D) corresponde al producto de PCR?
Justifique.
b) ¿Qué paso de la PCR evita la necesidad de agregar helicasa a la mezcla de reacción?
Justifique.
c) La Taq polimerasa no tiene actividad 3’-5’ exonucleasa. ¿Qué consecuencias tiene este
hecho para el producto de PCR?
d) Si los “primers” fueran parcialmente complementarios a las secuencias del DNA molde,
¿en cuáles de las siguientes condiciones experimentales sería conveniente trabajar para
que se apareen a las mismas y la reacción de PCR pueda ocurrir?
i) ¿alta o baja concentración salina?
ii) ¿alta o baja temperatura en la etapa del apareamiento?
iii) ¿alta o baja concentración de un agente desnaturalizante (por ej., dimetilsulfóxido) en
la mezcla de reacción?
Elija una opción en cada caso y justifique.
e) La secuencia a amplificar tiene un 50% de T y A. Con el objeto de obtener un producto
de PCR radiactivo, un investigador agregó a la mezcla de reacción, al comienzo del primer
ciclo, exceso de desoxiATP marcado con fósforo 32 (radiactivo) en su fosfato gamma (γ)
(ver Figura 2). Para su sorpresa, el producto de PCR no resultó radiactivo. ¿Por qué? ¿Qué
error cometió el investigador? Justifique.
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PROTEÍNAS
1) ¿Cuáles son los aminoácidos que forman parte de las proteínas? ¿Cuáles son polares y
cuáles no polares? ¿Qué aminoácidos están cargados positivamente y cuáles
negativamente a pH neutro?
7) ¿Cuáles son las diferencias entre una proteína globular y una fibrosa? Dé ejemplos de
ambas.
9) ¿Cuál es el efecto de los siguientes tratamientos sobre una proteína nativa en solución
acuosa: urea, mercaptoetanol, SDS (dodecilsulfato de sodio), hidrólisis ácida fuerte,
calentamiento a 90ºC.
10) Mencione las características de las enzimas. Defina: sustrato, producto, energía de
activación, sitio activo, cofactor.
12) ¿Qué es una enzima alostérica? ¿El fenómeno de alosterismo está solamente restringido
a las enzimas? ¿Qué es el efecto cooperativo?
13) Señale cuáles de las siguientes sustancias son proteínas y cuáles no:
anticuerpos hemoglobina
miosina (músculo) enzimas
actina (músculo, citoesqueleto) clorofila
interleuquinas aspirina
celulosa (vegetales) bilirrubina
caseína (leche) quitina (hongos, insectos)
receptores hormonales queratina (piel, pelo)
insulina albúmina (plasma sanguíneo)
plastoquinona caroteno
adrenalina represor del operón lac
sacarosa genes
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14) Se suele estimar la concentración de proteínas por absorción de luz ultravioleta (UV).
¿Cuáles son los aminoácidos responsables de dicha absorción?
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B) PROBLEMAS DE PROTEÍNAS I
PROBLEMA 1
¿Provoca la sustitución de un aminoácido por otro necesariamente una disminución en la
actividad biológica de una proteína? Discuta en qué casos sí.
PROBLEMA 2
Dibuje los siguientes tipos de proteínas:
a) Con una subunidad y 3 dominios estructurales.
b) Con 3 subunidades y 3 dominios estructurales.
c) Con 2 subunidades y un dominio estructural.
PROBLEMA 3
Aproximadamente, ¿cuántos aminoácidos están contenidos en una proteína de PM =
32.000 Da, sabiendo que el peso molecular promedio de un aminoácido en la cadena
polipeptídica es de 110 Da? ¿De dónde proviene este valor de 110 Da?
PROBLEMA 4
Un péptido de 12 aminoácidos es sometido a 3 tratamientos por separado:
i) corte con tripsina, produciéndose los péptidos Val-Ala-Phe-Leu-Lys, Pro-Trp-Pro-Arg y
Val-Met-Gly (la tripsina corta el enlace peptídico hacia el C-terminal de lisinas o
argininas).
ii) corte con carboxipeptidasa, observándose liberación inicial de Gly (la enzima
carboxipeptidasa remueve el aminoácido C-terminal de cualquier proteína, cortando
el enlace peptídico formado entre el aminoácido terminal y el anteúltimo).
iii) corte con una proteasa capaz de cortar sólo hacia el N-terminal de las alaninas,
generando en este caso un pentapéptido y un heptapéptido.
¿Cuál es la secuencia aminoacídica del péptido original?
PROBLEMA 5
Ud. está buscando afanosamente una sustancia presente en el espárrago violeta de la
Antártida, que cura (según dicen) el resfrío de los guanacos. En sus estudios termina
purificando 2 proteínas que no le curan el resfrío a nadie, pero que dan cristales violetas
muy bonitos. Ambas proteínas son muy distintas pero tienen el mismo peso molecular en
condiciones nativas (40.000 Daltons). Tanto la proteína A como la B tienen 2 cisteínas. El
análisis de la proteína A pura indica que tiene un solo tipo de aminoácido N-terminal
(treonina), pero el análisis de la proteína B reveló la existencia de 2 tipos de extremos N-
terminales (alanina y serina).
a) ¿Qué le sugiere que las proteínas corridas en un gel PAGE-SDS, no teñido con azul de
Coomassie, den bandas de color violeta?
b) ¿Qué le indica la presencia de un solo tipo N-terminal en la proteína A y de dos tipos N-
terminales en la proteína B?
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PROBLEMA 6
La toxina diftérica es una proteína tóxica para células animales, debido a que posee una
actividad enzimática capaz de inhibir la biosíntesis de proteínas. Consta de una sola
cadena polipeptídica de 58.000 Daltons. La tripsina, en pequeñas cantidades, fragmenta
esta cadena en dos partes, una de 37.000 Daltons y otra de 21.000 Daltons, pero sólo en
ciertas condiciones, como se muestra en la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
de la figura. Explique por qué.
PROBLEMA 7
a) En base a las fórmulas mostradas, ¿por qué el represor del operón lac, proteína que
normalmente se une a la lactosa, puede también unirse al IPTG?
b) ¿Qué significa que el IPTG tiene mayor afinidad por el represor que la lactosa?
Walter Gilbert, premio Nobel de Química 1980, en 1966 hizo el siguiente experimento que lo
hizo famoso:
Incubó bacterias E. coli, wild-type o mutantes, junto con IPTG marcado radiactivamente
(14C). Luego rompió las células y puso los extractos resultantes en bolsitas de diálisis (cuyos
poros dejan pasar moléculas pequeñas como el IPTG pero no proteínas) sumergidas en
buffer salino. Luego de 5 horas, midió la radiactividad adentro y afuera de las bolsitas. Los
resultados que obtuvo fueron (en unidades arbitrarias de concentración):
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PROBLEMA 8
Ud. tiene que eliminar de la muestra de DNA de un paciente una gran cantidad de RNA
que la contamina. Para ello, debe tratar a la solución que contiene a ambos con una
enzima RNasa (ribonucleasa). Como las RNasas altamente purificadas son muy caras y Ud.
no dispone de muchos fondos, decide comprar una RNasa que viene contaminada con
trazas de DNasa (desoxirribonucleasa). Basándose en el conocimiento de que las RNasas
son consideradas “termorresistentes” mientras que las DNasas no, decide pre-tratar la
solución de RNasa comprada, calentándola por 10 minutos a 90ºC y transfiriéndola
inmediatamente a un balde con hielo. Desafortunadamente cuando prueba su
preparación así pre-tratada sobre su muestra, Ud. comprueba que ni el DNA, ni el RNA
fueron degradados. ¿Qué error cometió Ud.?
PROBLEMA 9
El 15% del peso de una célula de E. coli corresponde a proteínas. Si una célula de E. coli
contiene 3.000 tipos diferentes de proteínas, y suponiendo un peso molecular promedio de
50 kDa para cada proteína,
a) Estime el número total de moléculas de proteína en una sola célula.
b) ¿Es posible calcular la cantidad de moléculas proteicas de cada clase?
Datos:
Suponga que la densidad del protoplasma es igual a la del agua.
Suponga que la célula de E. coli es cilíndrica con una longitud de 2 micrones y un diámetro
de la base de 1 micrón.
Número de Avogadro = 6,02 x 1023 moléculas/mol
Vol. cilindro: π.r2.h
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C) PROBLEMAS DE PROTEÍNAS II
PROBLEMA 1
La parte proteica de una glicoproteína tiene, en su estado nativo, un peso molecular de
105.000 Daltons (105 kDa).
a) Deduzca su estructura cuaternaria (número de subunidades, PM de cada una de ellas,
uniones que las estabilizan y glicosilación de subunidades) a partir de los resultados de los
siguientes geles de poliacrilamida en los que se sembró la proteína pura, la cual fue
previamente sometida a tres tratamientos (por separado) que se indican abajo. Al final de
la corrida electroforética, los geles fueron teñidos con Coomassie Blue, que es un colorante
azul que tiene afinidad por las estructuras peptídicas.
b) ¿Qué tratamiento previo sugiere Ud. para determinar sin ambigüedad a qué polipéptido
están unidas las moléculas de azúcar?
c) La sensibilidad del Coomassie Blue es tal que es capaz de detectar a partir de aprox. 0,2
µg de proteína/banda. ¿Cree Ud. que es correcto afirmar que una proteína está pura si se
observa una sola banda en un gel teñido con ese colorante?
d) En el tratamiento 3, ¿cree Ud. que la enzima Endo-H se agregó antes o después de tratar
con SDS y β-mercaptoetanol?
PROBLEMA 2
La aldolasa es una proteína homo-oligomérica, soluble, de localización citoplasmática, con
función bioquímica de enzima, presente en casi todos los organismos. Cumple un papel
biológico muy importante en la glucólisis porque convierte la fructosa-bis-fosfato (molécula
de azúcar de seis carbonos) en dos moléculas de tres carbonos cada una. Mutaciones en el
gen que la codifica existen en muchas personas que sufren de intolerancia a la ingestión de
dulces. La mutación puntual más frecuente en la población mundial es un cambio en el
codón 149 que hace cambiar Alanina por Prolina.
Un grupo de investigadores (Malay et al., J. Molecular Biology, marzo 2005) purificó la
aldolasa nativa, de 160 kDa, y la mutada, de 40 kDa.
La aldolasa salvaje fue cristalizada y examinada por difracción de rayos-X. De este análisis,
se elaboró el modelo de estructura espacial para el monómero que se muestra en la Figura
1, del cual surgieron las siguientes observaciones:
i) la Ala 149 interacciona con la Val 24 (por interacciones hidrófobicas)
ii) la Arg 148 interacciona con el Glu 189 (por interacciones iónicas) y juntos se unen al
sustrato
iii) de las nueve Cys que tiene la proteína, la Cys 361 es la única bien expuesta como para
situarse próxima a otra Cys en la misma posición de una subunidad vecina.
iv) muchos aminoácidos hidrofóbicos están ocluidos en el interior de la molécula,
interaccionando entre sí.
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Además, con ambas proteínas se realizaron los siguientes experimentos por separado
(Figura 2):
A) fueron tratadas con urea y luego analizadas por métodos físico-químicos para evaluar el
grado de plegamiento.
B) fueron sometidas a electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) con SDS y urea, con o
sin β-mercaptoetanol (MSH)
C) fueron incubadas a distintas temperaturas y luego en presencia de fructosa-bis-fosfato
para medir su actividad enzimática.
Preguntas:
a) ¿Cuántas subunidades tienen las moléculas de proteína salvaje nativa? ¿Y las de mutada
nativa?
b) ¿Por qué la urea provocó los resultados obtenidos en la figura 2A?
c) Proponga un modelo de estructura tridimensional posible, al estilo del de la Figura 1 pero
para la proteína mutada, que muestre las posiciones aminoácidicas resaltadas en la Figura 1
y que sea compatible con los resultados de los experimentos.
Datos:
Aminoácidos hidrofílicos:
- polares: Ser, Thr, Asn, Gln
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IBMC 2011
PROBLEMA 3
Un investigador letón tiene serios problemas para caracterizar una enzima que ha purificado
y la acción que tiene sobre ella el compuesto X, un aparente activador. En la Figura 1 se ve
una migración en un gel nativo de poliacrilamida, teñido con azul de Coomassie. En la calle
1, la proteína se incubó previamente con el compuesto X mientras que en la 2, no.
Con el material proteico eluido a partir de cada una de las tres bandas del gel nativo (A, B y
C), él hizo un ensayo de actividad, en presencia o ausencia del compuesto X (ver Tabla).
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Preguntas:
a) ¿Cómo es la estructura de la proteína y cómo la afecta el compuesto X?
b) ¿Por qué en el gel nativo la muestra se siembra en el medio del gel?
c) ¿Cómo explica que la banda A haya migrado más rápido que la B en el gel nativo?
d) ¿Cómo haría para determinar si la enzima se une al compuesto X, y si lo hace, a qué
subunidad?
PROBLEMA 4
En los ’90, nuestro país fue sacudido por la noticia de la aparición de casos de cólera que
fueron en aumento debido a malas condiciones sanitarias. Vibrio cholerae es la bacteria
responsable de la diarrea aguda observada en esta enfermedad. El aislamiento y
caracterización de la misma data del siglo antepasado. Sin embargo, su biología molecular
y celular comenzó a conocerse recién en los años 80 del siglo pasado, debido
principalmente a las investigaciones de John Mekalanos, de la Harvard Medical School.
El proceso infeccioso implica la supervivencia de V. cholerae al pH ácido del estómago, su
motilidad a través del intestino y la secreción por parte del vibrión de una toxina proteica de
87 kDa compuesta por los productos de 2 genes, llamados ctx A y ctx B. El producto de ctx
A es un polipéptido de 27 kDa y el de ctx B, uno de 12 kDa. El polipéptido A sufre una
modificación post-traduccional.
Preguntas:
a) Haga un dibujo de la molécula de toxina que muestre el n° de subunidades de cada
clase, el tipo de unión entre las mismas y la característica saliente del producto del gen ctx
A.
b) ¿Cuántos aminoácidos tiene la toxina aproximadamente?
Dato: PM de cada aminoácido = 110 Da.
c) ¿De qué signo es la carga eléctrica neta de la toxina a pH = 7? ¿Cómo se modificaría su
carga neta y actividad biológica a pH = 12?
d) ¿Qué modificación post-traduccional sufre "in vivo" el producto de ctx A para explicar el
resultado del gel con SDS y β-mercaptoetanol?
PROBLEMA 5
Una proteína imaginaria, llamada heterodimerina, está formada por 2 subunidades unidas
por puentes disulfuro según se indica en la figura. Se muestra también parte de la secuencia
aminoacídica de la subunidad B, correspondiente a su porción carboxi-terminal, y un
esquema del mRNA que la codifica con una porción de su secuencia nucleotídica.
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IBMC 2011
a) ¿Cuántas bandas y de qué tamaño observaría en dos electroforesis (una con y otra sin
tratamiento previo de la muestra con β-mercaptoetanol) en un gel de poliacrilamida con
SDS de la heterodimerina pura? Justifique.
PROBLEMA 6
En las neuronas de algunos mamíferos que presentan síntomas neurológicos severos, se ha
encontrado una proteína de 30 kDa llamada PrS, que tiende a formar agregados insolubles.
A esta proteína se le atribuyen:
- la causa de la enfermedad.
- propiedades infecciosas, ya que una pequeña cantidad (teóricamente una sola
molécula) en una neurona puede desencadenar un daño importante como resultado de
una propagación de la entidad molecular infectiva, y además, porque la enfermedad
puede ser contagiosa.
Curiosamente, en neuronas no infectadas existe una proteína de función desconocida y
con idéntica secuencia de aminoácidos y las mismas modificaciones covalentes co- y post-
traduccionales, llamada PrC, pero que ni se insolubiliza ni es infectiva. Un dato interesante es
que la ausencia total de la proteína normal PrC (por ausencia del gen) no provoca
enfermedad y hasta protege contra el riesgo de contraerla vía infección por PrS.
Por otra parte, personas con ciertas mutaciones puntuales en el gen PrC (como por ejemplo
las que causan el cambio de Glu en la posición 200 por Lys, o el cambio de Pro en la
posición 102 por Leu) tienen tendencia a desarrollar espontáneamente los síntomas
neurológicos sin estar infectados.
Estudios in vitro con las proteínas purificadas demostraron que, además de la insolubilidad e
infectividad, PrS y PrC difieren en su comportamiento frente a proteasas. Además, si se
mezclan 1 µg de PrS (infectiva y resistente a proteasas) con 5 µg de PrC, la mezcla se vuelve
tan infectiva y resistente a proteasas como 6 µg de PrS!!
A partir de las evidencias mencionadas, deduzca:
a) ¿A qué características estructurales de estas proteínas se deben las diferentes
propiedades observadas entre PrC y PrS en cuanto a su solubilidad y resistencia a
proteasas?
b) ¿Qué características deben tener en común las PrC mutadas y PrS para explicar la
existencia de la enfermedad neurológica de origen genético?
c) ¿Qué propiedad adicional debe tener PrS para explicar la propagación del daño que
causa in vivo y la transformación de PrC en los experimentos in vitro? ¿Cree Ud. que PrS y
PrC son capaces de interaccionar entre sí in vitro e in vivo?
d) ¿Por qué las neuronas sin PrC son resistentes a la infección?
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PROBLEMA 7
Los climas extremos imponen límites a las diversas formas de vida. Sin embargo, a lo largo de
la evolución se han seleccionado organismos que han logrado adaptarse a regiones
inhóspitas. Un modelo eucariota de estudio de tal adaptación es el pez bacalao del
Atlántico Norte (Gadus morhua), de gran tamaño (Fig. 1), que vive en las frías aguas
costeras de Islandia y Noruega y que sirve de sabroso y codiciado alimento a sus
habitantes.
Las enzimas proteicas de estos organismos exhiben cierta flexibilidad, incluso en su sitio
activo, de manera que son capaces de catalizar las reacciones con gran rapidez aun a
bajas temperaturas, a diferencia de lo que sucede con los organismos que viven en
regiones de climas más cálidos, llamados “mesófilos”.
Una enzima muy estudiada de este pez es la fosfatasa, que está codificada por 1 solo gen.
Este gen codifica un polipéptido de 477 aminoácidos de los cuales 8 son cisteína. Esta
enzima contiene 1 solo sitio activo, no sufre proteólisis post-traduccional, y ninguna de sus 8
cisteínas se encuentra formando puentes disulfuro. Las Figuras 2 y 3 muestran las curvas de
actividad enzimática en función de la temperatura y de concentraciones crecientes de
urea (medida a 15ºC) respectivamente.
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Preguntas:
a) ¿Cuál es la estructura cuaternaria de la fosfatasa de bacalao? ¿Qué tipos de unión la
estabilizan? Justifique.
b) En base a los resultados de la Tabla 1 y de la Figura 4, ¿cuál es la causa molecular de que
la fosfatasa de bacalao pierda su actividad a 4 M de urea? ¿En qué parte de la molécula
de fosfatasa se encontrará el sitio activo de la enzima?
c) ¿Qué eventos moleculares son responsables respectivamente de las partes ascendente y
descendente de la curva de la Figura 2? Dibuje la curva esperable para la fosfatasa de
salmón, un pez mesófilo.
d) Una mutación puntual en el gen de fosfatasa de bacalao provoca el cambio de uno de
sus codones AGC por TGC. La enzima mutada muestra el mismo comportamiento que la
salvaje en el experimento de la Tabla 1. Sin embargo, el grado de desplegamiento en
función de la concentración de urea es diferente para la fostafasa mutada comparando
con la salvaje (Figura 5). Notablemente, si el grado de plegamiento se mide en presencia
de mercaptoetanol, la curva de la fosfatasa mutada da igual que la de la normal.
¿Provocó la mutación la aparición de una nueva unión inter-o intrasubunidad? ¿Cuál es la
causa molecular del diferente comportamiento de la enzima mutada frente a la urea?
Justifique.
Dato:
PM promedio de 1 aminoácido = 110 Da.
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A) GUÍA DE ESTUDIO
1) ¿Con qué polaridad son sintetizadas las proteínas en los ribosomas? ¿Con qué polaridad
es leído el mRNA?
3) ¿Qué quiere decir que el código genético es universal y degenerado? ¿Es estrictamente
universal?
4) ¿Qué entiende por hipótesis del “wobbling”? ¿Qué son los tRNAs isoaceptores?
8) ¿Cuál es la forma de las moléculas de tRNA? Señale los lugares donde se encuentra el
anticodón y el sitio de unión a los aminoácidos.
9) ¿Qué entiende por tRNA supresor, y cómo se origina ese tipo de molécula?
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B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
De arriba hacia abajo, la figura muestra 3 etapas consecutivas de la elongación de la
traducción en los ribosomas.
a) Identifique en los dibujos lo siguiente: extremos 5' y 3' del mRNA, extremo NH2-terminal del
polipéptido naciente, extremos 5' y 3' de cada anticodón, sitios "A", "P" y "E" del ribosoma,
uniones peptídicas, uniones covalentes no peptídicas, puentes de hidrógeno.
b) Sabiendo que los círculos representan a los aminoácidos metionina (M), triptofano (W),
fenilalanina (F) y ácido aspártico (D), asigne las bases que pueda al mRNA y a los
anticodones.
c) ¿En qué etapa actúa la peptidil transferasa?
PROBLEMA 2
Una mutación puntual (C que cambia a G) en un gen bacteriano produce la aparición de
un codón stop UAG en la mitad de su mensajero, lo cual provoca la pérdida de la
capacidad de usar ácidos grasos como fuente de alimento.
a) ¿Cuál es el aa codificado por el codón alterado? (utilice el código genético)
Una segunda mutación (independiente de la primera) en un gen que codifica para un RNA
de transferencia provoca la alteración de su anticodón de manera tal que se aparea con
el codón stop UAG, incorporando el aminoácido tirosina en esa posición. Tal mutación
suprime los efectos de la primera, restaurando a las bacterias su capacidad de alimentarse
de ácidos grasos.
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IBMC 2011
PROBLEMA 3
La región codificante del gen de la Taq polimerasa (DNA polimerasa de la bacteria Thermus
aquaticus) comienza con la siguiente secuencia de nucleótidos como se muestra en el
esquema:
Preguntas:
a) La Taq polimerasa tiene en total .............. aminoácidos, de los cuales los 300 primeros del
extremo NH2 son responsables de la actividad exonucleasa de 5’a 3’; mientras que en el
extremo COOH reside la actividad de polimerasa.
Se sabe que además de la proteína completa de .............. kDa, T. aquaticus sintetiza a partir
del mismo mRNA una proteína de 65,5 kDa, con plena actividad de DNA polimerasa y sin
actividad 5’ a 3’ exonucleasa, como consecuencia de la iniciación en un codón interno
para metionina.
Dato: PM promedio para un aminoácido = 110 Da.
b) ¿Cuál sería el efecto (sobre la síntesis de la proteína completa y sobre la corta) de la
inserción de una A a la derecha de la T indicada en la figura? En su respuesta debe indicar
cuáles actividades (exonucleasa, polimerasa o ambas) esperaría encontrar.
c) Comparando las secuencias aminoacídicas de las DNA polimerasas de T. aquaticus y E.
coli, se observa que hay un 38% de identidad de secuencia. Sin embargo, las secuencias
nucleotídicas de los genes correspondientes no guardan identidad entre sí. Dé una
explicación para este hecho en base al código genético.
d) Thermus aquaticus tiene en sus ácidos nucleicos un contenido de G+C más elevado que
E. coli. ¿Cuál puede ser la ventaja de este hecho para T. aquaticus?
e) El gen de la Taq polimerasa tiene 76 codones para arginina distribuidos así:
CGT 0 CGA 0
CGC 24 AGG 25
CGG 27 AGA 0
¿Por qué piensa Ud. que estos organismos evolucionaron de manera de poseer esta
particular distribución de codones sinónimos?
PROBLEMA 4
Se aisló un antibiótico llamado edeína a partir de un cultivo bacteriano. La edeína inhibe la
síntesis de proteínas, pero no tiene efecto sobre la síntesis de DNA (duplicación), ni sobre la
de RNA (transcripción). Cuando se agrega a un sistema de síntesis de proteínas in vitro
(lisado de reticulocitos), la edeína detiene la síntesis luego de un corto período de retardo
(lag) (ver figura), a diferencia de la cicloheximida, que detiene la síntesis proteica
inmediatamente. Un análisis de la mezcla de traducción in vitro muestra que luego de 5
minutos de tratamiento con edeína no quedan prácticamente polirribosomas y todo el
mRNA aparece unido a subunidades ribosomales pequeñas (40S).
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PROBLEMA 5
La ciclosporina A, producida por un hongo, es un polipéptido de poderosa acción
inmunosupresora. De hecho, es utilizado para prevenir el rechazo de injertos de riñón o
hígado. La incubación de linfocitos T con ciclosporina A marcada radiactivamente resulta
en la inmediata acumulación de la droga en el citosol (citoplasma).
Nunca se detecta la droga marcada asociada a la membrana plasmática. La ciclosporina
A marcada del citosol se encuentra unida a un receptor de 17.000 Daltons de peso
molecular. Una vez unida a su receptor, la ciclosporina A inhibe la aparición de la proteína
interleuquina 2 (IL-2) en cultivos de linfocitos T. Este efecto podría deberse a uno o más de
los siguientes fenómenos in vivo:
1) Inhibición de la transcripción del gen de la IL-2.
2) Estimulación de la degradación del mRNA de la IL-2.
3) Inhibición de la traducción del mRNA de la IL-2.
4) Destrucción de la IL-2 secretada.
5) Aumento de la rapidez de utilización de IL-2 secretada.
Para determinar cuáles de estas hipótesis podrían ser correctas, se hizo una preparación de
todos los RNAs poliadenilados de dos cultivos de linfocitos T, uno tratado y otro no tratado
previamente con ciclosporina A. Cada una de las dos preparaciones de RNA poliadenilado
fue ensayada en un sistema de traducción in vitro y se midió (por medio de anticuerpos
específicos y electroforesis en geles) la cantidad de IL-2 fabricada (ver tabla).
Nota: La actina es una proteína presente en todas las células eucariotas que es
imprescindible para su estructura, forma y función.
Preguntas:
a) ¿A cuáles de los cinco niveles mencionados más arriba podría actuar la ciclosporina?
b) ¿Qué objeto tiene medir en paralelo la cantidad de actina sintetizada?
c) Vuelva a este problema luego de resolver Nucleicos II y proponga otros experimentos
para confirmar la respuesta a la pregunta a).
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PROBLEMA 6
En eucariotas, la subunidad pequeña (40S) se une al extremo 5'CAP de los mRNAs. Luego se
desliza en dirección 3' y sólo se detiene al encontrar un AUG que se encuentre situado
dentro de la secuencia adecuada, necesaria para que sea reconocido como iniciador.
Se realizó un ensayo de traducción in vitro en un lisado de reticulocitos (libre de mRNA
endógenos), al que se le agregaron distintas variantes (artificiales) de mensajero de una
dada proteína, los cuales sólo diferían en las bases que aparecen en la figura.
Se midió luego la cantidad de proteína correctamente sintetizada:
a) Determine cuáles de los cambios impiden el reconocimiento del iniciador y cuáles no.
b) Escriba una secuencia consenso para el contexto del AUG iniciador.
c) ¿Habrá genes eucariotas que no posean esta secuencia consenso?
d) La figura de abajo muestra dos mRNAs que tienen dos AUG cerca del 5'CAP. Determine,
en cada caso, en cuál se iniciará la traducción y cuál será la secuencia de los primeros
aminoácidos:
PROBLEMA 7
En el año 1961, un investigador llamado Dintzis (Proc. Natl. Acad. Sci. 47, 247,1961) hizo un
experimento usando reticulocitos (células precursoras de los glóbulos rojos) enteros
incubados a 15ºC en presencia de aminoácidos y otros nutrientes esenciales. Luego de 1
hora de incubación, agregó aminoácidos marcados todos radiactivamente y sacó
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PROBLEMA 8
Streptococcus pneumoniae, o neumococo, es una bacteria que infecta las vías respiratorias
de los humanos y es difícil de atacar con los antibióticos tradicionales porque suelen
aparecer cepas bacterianas resistentes a ellos. Por eso se están usando nuevos antibióticos
más efectivos, como la evernimicina. El neumococo es normalmente sensible a este
antibiótico, aunque también, pero muy esporádicamente, aparecen cepas resistentes. Para
aislar el gen de la resistencia se hicieron los siguientes experimentos:
Se sembraron ordenadamente y por duplicado bacterias provenientes de pacientes no
tratados con evernimicina en dos placas de Petri, una conteniendo evernimicina y la otra
no. Ambas placas se incubaron a 37ºC para que crezcan las colonias. La figura muestra lo
observado al día siguiente:
Preguntas:
a) ¿Cuál pudo ser la causa de la aparición de las bacterias resistentes de la figura? ¿Qué
maquinaria enzimática “se equivocó”?
b) El cambio C a T en el gen de RNA de 23S de la única colonia de la placa 2, ¿surgió como
consecuencia de la presencia de la evernimicina o era pre-existente? ¿Con qué
mecanismo evolutivo es consistente este resultado? ¿Con qué par de primers (I o II) se
obtendría producto de PCR a partir de DNA de las siguientes colonias?:
Placa 1: posiciones B3 y A5
Placa 2: única colonia (posición A5)
c) ¿A qué macromolécula se uniría la evernimicina y qué actividad enzimática inhibiría en
las bacterias sensibles?
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ÁCIDOS NUCLEICOS II
A) GUÍA DE ESTUDIO
1) Haga un esquema de un gen eucariótico típico. Señale qué porciones del gen se verán
representadas en el mRNA maduro y qué porciones se verán representadas en la proteína
que codifica.
2) ¿Qué significa que la TATA box (TATA) es una secuencia consenso? Escriba todas las
secuencias posibles que caigan dentro del consenso de la TATA box. ¿Qué función
cumpliría la TATA box?
6) ¿A partir de qué sustratos se sintetiza RNA mensajero? ¿Sobre qué molde? ¿Se requiere
cebador o “primer”? Describa las enzimas que realizan la transcripción en procariotas y
eucariotas.
7) ¿La sustitución de una base por otra en una zona del DNA que codifica para proteínas
(mutación puntual) da lugar necesariamente a un cambio de aminoácido?
10) Además del splicing del RNA, ¿existe el "splicing" de proteínas? ¿Qué son las inteínas y las
exteínas? ¿Para qué codifican las inteínas?
11) ¿Qué es una enzima de restricción? ¿De dónde se obtienen? ¿Para qué se usan? ¿Qué
tipos de extremos pueden dejar en el DNA de cadena doble?
12) Complete las siguientes secuencias para que correspondan a posibles palíndromos
reconocibles por una enzima de restricción:
a) AGT
b) CAA
c) CCC
d) ATC
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B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
¿Cuáles de las siguientes preparaciones llevan secuencias de intrones?
PROBLEMA 2
Existe un solo gen para la fibronectina (FN) en cada célula de mamífero (en realidad dos
copias, dos alelos, cuyas secuencias son idénticas). El gen tiene 70 kb de longitud. Sin
embargo, se han encontrado en el citoplasma de fibroblastos dos RNA mensajeros de 7,7 y
8,0 kb de longitud, respectivamente.
El de 7,7 kb es idéntico en secuencia al de 8,0 kb, excepto por el hecho de que carece de
un segmento interno de 0,3 kb.
a) ¿Cómo explica la gran diferencia de tamaño entre el gen (70 kb) y sus mensajeros
(aproximadamente 8,0 kb)?
b) ¿Cómo explica la existencia de dos tipos de RNA mensajeros de FN diferentes? Discuta
los posibles mecanismos que pudieron originar los dos mRNAs. ¿Qué implicancias biológicas
podría tener la presencia de los dos mRNAs?
Ud. supone que algunos tejidos expresan el mensajero de 7,7 kb, mientras que otros sólo
expresan el de 8,0 kb, y decide investigarlo usando hibridación de sondas de cDNA
radiactivo a preparaciones de mensajero total de distintos tejidos.
c) ¿Cuál de las dos especies de mensajero detecta en un Northern con cada una de las
siguientes tres sondas? Justifique.
i) un cDNA del mRNA de FN de 7,7 kb.
ii) un cDNA del mRNA de FN de 8,0 kb.
iii) un cDNA del mRNA del segmento diferencial de 0,3 kb.
PROBLEMA 3
El splicing es una reacción enzimática por la cual se eliminan los intrones del RNA transcripto
primario y los exones son unidos entre sí para formar el RNA maduro. Se ha descripto splicing
en transcriptos primarios tanto de RNAs mensajeros (el más común) como de RNAs
ribosomales y de transferencia (menos frecuentes). Las reacciones de splicing pueden ser
reproducidas "in vitro", es decir, en un tubo de ensayo si se colocan en el mismo los sustratos
adecuados y las enzimas o complejos enzimáticos correspondientes. Se estudiaron "in vitro"
dos tipos distintos de reacciones de splicing:
I) Splicing de un transcripto primario de RNA mensajero.
II) Splicing de un transcripto primario de RNA ribosomal.
Cada uno de los transcriptos primarios marcados radiactivamente fue incubado en
presencia o en ausencia de una preparación nuclear enriquecida en spliceosomas. A
distintos tiempos (de 0 a 2 hs de incubación) se tomaron muestras y se las sembró en calles
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IBMC 2011
Preguntas:
a) Identifique sustrato, producto/s y molécula/s intermediaria/s de la reacción e interprete la
variación con el paso del tiempo de las intensidades de cada banda en el panel de la
izquierda.
b) ¿Por qué el patrón de bandas del panel de la derecha es diferente?
c) ¿Qué patrón de bandas habría obtenido en los siguientes experimentos en los que la
preparación de spliceosomas hubiera sido pretratada de las siguientes maneras:
i) Calentamiento a 100ºC por 10 minutos y enfriamiento rápido en hielo.
ii) Digestión con una lipasa (enzima que degrada lípidos, es decir, grasas).
iii) Digestión con una proteasa (enzima que degrada proteínas).
iv) Digestión con una DNasa (enzima que degrada DNA).
v) Digestión con una RNasa (enzima que degrada RNA).
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PROBLEMA 4
Un cultivo de células de embrión de pollo (cultivo normal) produce grandes cantidades de
la proteína X. Cuando estas células en cultivo son infectadas con el virus de sarcoma
(cultivo infectado) las células no mueren, pero en ellas ya no se detecta actividad biológica
de la proteína X. Por otra parte, existe un tipo de células de embrión de pollo que no
presenta actividad biológica de la proteína X en ninguna condición (cultivo mutante). Se
dispone de un clon de cDNA de la proteína X y de anticuerpos anti-proteína X (que
reconocen a la proteína X tanto nativa como desnaturalizada). Estos reactivos son utilizados
como “sondas” en los siguientes experimentos de Southern, Northern y Western:
Complete los lugares donde haya puntos suspensivos y responda cada pregunta:
a) Sabiendo que el clon de cDNA usado como sonda no posee sitios para la enzima PvuII y
que existe un solo gen para la proteína (2 alelos) por genoma, ¿qué indica la presencia de 3
bandas de hibridación en los carriles a y b del experimento de Southern?
b) ¿A qué nivel está afectada la actividad de la proteína X en el cultivo infectado?
c) ¿Y en el cultivo mutante?
d) ¿Qué conclusiones le sugiere la existencia de 2 bandas de hibridación en los carriles A y B
del experimento de Northern?
e) El mRNA más largo de la proteína X es de 6 kb. Este mRNA daría una proteína de a lo
sumo .............. aminoácidos. El peso promedio de cada residuo aminoacídico es 110
Daltons, por lo tanto el polipéptido más grande de la proteína X debería pesar .............
Daltons. ¿Cómo se explica que la banda más grande en el Western presente un PM
aparente mayor (300.000 Daltons)?
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PROBLEMA 5
El gen Bdf codifica para la proteína BDF, un factor de transcripción que controla la
transcripción de diversos genes involucrados en la diferenciación del tejido óseo en los
vertebrados. La Figura 1 muestra que la transcripción del gen Bdf es "despertada" por la
unión de otro factor de transcripción, la proteína BAF, a un enhancer que está presente en
la región promotora del gen Bdf. El transcripto primario del gen Bdf puede ser procesado por
"splicing" alternativo generando 2 mRNAs distintos, uno con y otro sin el exón 3. Nunca los
dos tipos de mRNAs se dan simultáneamente en el mismo tipo celular o tejido. Uno de los
dos mRNAs da polipéptidos de BDF activos y el otro no. La inclusión del exón 3 en el mRNA
es provocada por la unión específica de la proteína SF2 (factor de splicing alternativo) a
una secuencia de 9 bases presente en el exón 3 del transcripto primario.
Preguntas:
a) Ubique la señal y el sitio de corte y poliadenilación, y la TATA box en las regiones que
corresponda en los esquemas del gen, del transcripto primario y de los mRNAs de la Figura 1.
b) Defina secuencia palindrómica. ¿Cuáles de los elementos nombrados en el gen Bdf en la
Figura 1 generalmente corresponden a secuencias palindrómicas?
c) ¿Cuántas bandas de hibridación y de qué tamaño en pares de bases (pb) se observaría
en un Southern de DNA genómico humano digerido simultáneamente con las enzimas de
restricción BamHI y HindIII, en dos experimentos distintos: uno hibridado con una sonda
correspondiente al exón 2 y otro hibridado con una sonda correspondiente al exón 4? Si lo
considera necesario ayúdese con esquemas.
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IBMC 2011
Se analizó la expresión del gen Bdf en 3 tejidos humanos (sangre, hueso e hígado) mediante
las técnicas de Northern y Western (Figura 2). En el Northern, se corrieron RNAs de los 3
tejidos mencionados en 3 calles separadas en geles de agarosa, transferidos e hibridados
con una sonda correspondiente al exón 2. En el Western, se corrieron proteínas de los 3
tejidos mencionados en geles de poliacrilamida con SDS, sin y con pre-tratamiento con
β-mercaptoetanol (β-MSH), transferidas y reveladas por un anticuerpo contra la porción de
la proteína BDF codificada por el exón 2.
k) Dos mutaciones distintas en el medio del exón 3 provocan el mismo fenotipo: la ausencia
de actividad de la proteína BDF. ¿Por qué mecanismo actúa cada una de ellas?
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PROBLEMA 6
Se utilizó la construcción de la Figura 1 para obtener ratones transgénicos. En dicha
construcción se clonaron el gen de la alternatina (proteína de nombre imaginario) de ratón,
bajo las órdenes del promotor y región regulatoria del gen de la antitripsina y el cDNA de la
proteína SF2 de ratón, bajo las órdenes del promotor y región regulatoria del gen de la
metalotioneína. Ambas unidades transcripcionales fueron separadas por un segmento de
DNA "nexo" que no codifica para nada ni tiene actividad regulatoria de la transcripción.
Preguntas:
a) ¿Qué longitud (en nucleótidos) tienen el transcripto primario y los 2 mRNAs maduros de
"alternatina" que se producen por "splicing" alternativo del exón 2?
b) ¿Qué peso molecular tienen los 2 polipéptidos de "alternatina", sabiendo que las regiones
5' y 3' no codificantes de su gen son de 100 y 70 pb respectivamente? PM 1 aa = 110 Da.
c) ¿Qué peso molecular tiene la proteína SF2 sabiendo que las regiones 5' y 3' no
codificantes de su gen son de 50 y 110 pb respectivamente?
d) Para identificar cuáles de las crías eran transgénicas se preparó DNA genómico de las
colas de los ratoncitos, se lo digirió con la enzima de restricción Eco RI, y se lo sometió a la
técnica de Southern, usando como sondas de hibridación o bien al intrón 1, o bien al intrón
2 del gen de "alternatina".
i) ¿Qué resultados habría esperado (número de bandas y tamaño) sabiendo que río
abajo del gen endógeno de "alternatina" las secuencias del cromosoma de ratón no
tienen nada que ver con lo que se encuentra río abajo de dicho gen en la
construcción de la figura?
ii) ¿Cuál de las 2 sondas es informativa para saber qué ratones son transgénicos y cuáles
no? Justifique.
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PROBLEMA 7
En un filtro de nitrocelulosa como el de la Figura 1 se depositaron 24 clones genómicos
distintos conocidos (es decir, se sabe exactamente a qué gen corresponde cada uno) en
forma de manchas circulares ordenadas en una matriz A1, A2,...; B1, B2,....; etc. Todos los
clones habían sido obtenidos con el mismo vector plasmídico y los 24 insertos corresponden
a 24 genes humanos diferentes.
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El DNA depositado en las manchas fue inmovilizado y desnaturalizado por tratamiento del
filtro con NaOH 0,5 N. Luego el filtro fue hibridado en condiciones rigurosas con una sonda
radiactiva correspondiente al DNA del vector plasmídico solo, lavado en condiciones
rigurosas y expuesto a una película radiográfica, obteniéndose el resultado de la Figura 2.
Esta técnica se llama "dot blot".
Una vez obtenido el resultado, el filtro fue tratado con agua destilada a 100ºC durante 10
minutos, tratamiento (llamado "strip off") que despega y lava la sonda radiactiva hibridada
pero no despega a los DNAs de los clones que habían sido inmovilizados en el filtro. Luego el
filtro fue hibridado en condiciones rigurosas con una preparación de RNA mensajeros de
hígado humano marcados radiactivamente, y luego del lavado y autorradiografía se
obtuvo el resultado de la Figura 3.
Por último, se realizó un nuevo "strip off" y el filtro fue hibridado en condiciones rigurosas con
una preparación de RNA mensajeros de páncreas humano marcados radiactivamente y,
luego del lavado y autorradiografía, se obtuvo el resultado de la Figura 4.
Preguntas:
a) ¿Cuál es la causa de que en la Figura 2 todas las manchas den hibridación positiva?
b) ¿Cuáles de los 24 genes:
i) se expresan solamente en hígado?
ii) se expresan solamente en páncreas?
iii) se expresan en ambos órganos?
iv) no se expresan en ninguno de los dos órganos?
c) Si unos de los clones llevara por inserto al gen de la insulina humana, ¿qué señal esperaría
obtener en la coordenada correspondiente a ese clon en las Figuras 3 y 4? ¿Y para otro
clon que llevara por inserto el gen de actina humana?
d) ¿Por qué se usa agua destilada para el "strip off" y no agua de la canilla (grifo)?
e) Los experimentos mostrados en este problema reflejan los principios de la moderna
tecnología de los "chips" de DNA. La diferencia es que en lugar de un filtro de nitrocelulosa
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IBMC 2011
Busque información periodística, de divulgación científica o en la web sobre los "DNA chips",
también llamados "DNA microarrays" y discuta su importancia.
PROBLEMA 8
La pérdida de extremidades ha ocurrido en diversas líneas evolutivas de los animales. En los
reptiles, por ejemplo, se sabe que las serpientes evolucionaron a partir de ancestros con
cuatro patas. Lo mismo ocurrió en los mamíferos, donde los cetáceos (ballenas, delfines y
orcas) provienen de ancestros cuadrúpedos. En este contexto resulta importante saber si la
pérdida o reducción de extremidades fue un proceso gradual o abrupto y cuáles fueron los
genes responsables de la misma. Un modelo muy valioso para estudiar este problema lo
constituyen los "espinosos", que son peces de la especie Gasterosteus aculeatus. En los
peces en general, los dos pares de aletas (anteriores y posteriores) son los equivalentes de
las patas de los otros vertebrados. En los espinosos marinos, el par de aletas posteriores
(llamadas también aletas pélvicas) se presenta como dos espinas punzantes (Figura 1,
arriba). Sin embargo, los espinosos de agua dulce carecen de las dos espinas pélvicas o las
tienen muy reducidas (Figura 1, abajo).
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IBMC 2011
Preguntas:
a) ¿Cuál es la longitud en nucleótidos del mRNA maduro del gen Pitx1? Justifique.
b) ¿Qué fenómenos ocurren en cada una de las dos posiciones numeradas como +1 y
+3362? Justifique.
c) ¿Entre el +1 y qué posición como máximo podría estar situado el ATG iniciador de la
traducción del gen Pitx1? Justifique.
d) Indique si se obtiene producto de PCR y en caso afirmativo de qué tamaño (longitud en
pares de bases en los siguientes experimentos:
i) Primers 1 y 2 usando como molde DNA genómico de espinoso
ii) Primers 1 y 3 usando como molde DNA genómico de espinoso
iii) Primers 2 y 3 usando como molde DNA genómico de espinoso
iv) Primers 1 y 2 usando como molde cDNA de espinoso marino
v) Primers 1 y 3 usando como molde cDNA de espinoso marino
vi) Primers 2 y 3 usando como molde cDNA de espinoso marino
e) ¿Qué función cumplirá la proteína codificada por el gen Pitx1. Justifique.
f) En ratones existe un homólogo del gen Pitx1 de peces. El gen se expresa en diversas partes
del cuerpo incluyendo la pelvis. El knockout homocigota de este gen produce severas
alteraciones en diversas partes del cuerpo de las crías que les provocan una muerte
prematura. Entre las alteraciones mencionadas figura una reducción del tamaño de sus
extremidades posteriores. Teniendo en cuenta lo que pasa en ratones, el hecho de que las
secuencias de los cDNAs de Pitx1 de espinosos marinos y de agua dulce son idénticas y los
resultados de la Figura 3, ¿qué mutación del gen Pitx1 podría haber causado la pérdida de
espinas en los espinosos de agua dulce y cómo alteraría su expresión? Justifique.
45
IBMC 2011
g) Si se comprobara que ninguna región del gen Pitx1 se encontrara mutada en los
espinosos de agua dulce, ¿qué otro gen podría estar mutado y así causar la pérdida de
espinas? Justifique.
h) ¿Por qué la diferencia genética en los espinosos de agua dulce no causa otras
alteraciones corporales y su muerte prematura, a diferencia de lo que ocurre con el
knockout de Pitx1 en ratones? Justifique.
i) Los lagos post-glaciales en los que se generaron los espinosos sin espinas son muy recientes
en términos geológicos. ¿Es este hecho consistente o contradictorio con los datos del paper
de Nature? Justifique.
j) La presencia de espinas pélvicas en los espinosos marinos parece ser una adaptación
defensiva contra peces predadores de estructuras bucales blandas. La ausencia de espinas
pélvicas en espinosos de agua dulce parece ser una adaptación defensiva contra
invertebrados predadores que atrapan más eficientemente a los espinosos con espinas
pélvicas agarrándose de las mismas.
PROBLEMA 9
En las plantas la luz controla la expresión de muchos genes involucrados en procesos
importantes como el crecimiento, y la formación de flores y frutos. La molécula encargada
de transferir la señal luminosa a estos efectos biológicos es una holoproteína llamada
fitocromo. El fitocromo está constituido por una porción proteica (apofitocromo, de 240.000
Daltons de peso molecular nativo) unido a un grupo prostético no proteico (tetrapirrol) de
bajo peso molecular. Existen dos formas del fitocromo, una llamada Pfr y otra llamada Pr. La
conformación del apofitocromo es idéntica en las dos formas. Lo que las distingue es una
distinta conformación del grupo prostético. La secuencia aminoacídica del apofitocromo
no presenta motivos tipo cierre de leucinas, dedos de zinc o hélice-vuelta-hélice.
En la oscuridad, las moléculas de fitocromo se encuentran como Pr. Si se iluminan las plantas
con luz roja, ésta es absorbida por el grupo prostético, el cual cambia de conformación y el
fitocromo se vuelve Pfr.
Preguntas:
a) Conociendo el PM nativo del apofitocromo (ver enunciado) y sabiendo que el mRNA del
apofitocromo es de 4000 bases, que su región 5’ no codificante es de 50 bases y que su
región 3’ no codificante es de 350 bases (incluyendo al codón “stop”), ¿cuál es la estructura
cuaternaria del apofitocromo? Para facilitar los cálculos considere el PM de 1 aminoácido =
100 Daltons.
Con el fin de averiguar cuál es el mecanismo por el cual el fitocromo controla la expresión
de los genes vegetales se realizaron los siguientes experimentos:
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IBMC 2011
Se comprobó que la proteína PIF es capaz de unirse al enhancer (DNA doble cadena)
5’CACGTG3’. Buscando genes que tuvieran este enhancer en su región promotora se
encontró al gen que codifica para una proteína llamada MYB. MYB es una proteína
dimérica cuyos polipéptidos tienen un motivo estructural tipo hélice-vuelta-hélice. La figura
muestra un esquema del gen que codifica para MYB.
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Se realizaron Northerns de RNA de una planta normal (I) y 3 plantas mutantes (II, III y IV),
previamente sometidas a oscuridad o a luz roja. En la hibridación se usó una mezcla de
sondas para los mRNAs de MYB y de la proteína de expresión constitutiva actina. La
mutante II es homocigota para un codón “stop” prematuro en el gen de PIF. La información
para las mutantes III y IV se traspapeló, pero se sabe que una es una mutante homocigota
que sólo fabrica la conformación Pfr del fitocromo (no puede cambiar a Pr), mientras la otra
es una mutante homocigota para una deleción de la TATA box del gen MYB.
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PROBLEMAS INTEGRATORIOS
DE EJERCITACIÓN PARA EL PRIMER PARCIAL
PROBLEMA 1
En la retina del ojo de los humanos existen dos tipos de células: los bastones y los conos. Los
bastones expresan específicamente una proteína llamada rodopsina, la cual posibilita la
visión en general. En cuanto a los conos, existen tres tipos celulares diferentes: los conos
“azules”, los “rojos” y los “verdes”, expresando específica y exclusivamente cada uno de
estos las proteínas conocidas como pigmentos visuales “azul”, “rojo” y “verde”
respectivamente. Estos pigmentos son capaces de captar luz de los colores indicados por
su nombre y el funcionamiento conjunto de los tres tipos de conos da por resultado la visión
policromática.
El gen del pigmento azul (gen A) se encuentra localizado en el cromosoma humano N° 7.
En cambio, los genes de los pigmentos rojo (gen R) y verde (gen V) se encuentran uno al
lado del otro (o sea, en tandem) en el cromosoma sexual X, no habiendo contraparte en el
cromosoma Y.
Cada uno de estos dos genes tiene su propio promotor y región regulatoria de la
transcripción, y se transcriben de manera específica, es decir, el gen R sólo en los conos
“rojos” y el gen V sólo en los conos “verdes”.
Los genes R y V tienen secuencias nucleotídicas muy similares (98% de similitud), a tal punto
que muchos sitios para enzimas de restricción se encuentran conservados en ambos genes.
La Figura 2 muestra una estructura más detallada de ellos.
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IBMC 2011
Se utilizó como sonda a un clon de cDNA que contiene sólo los exones 1 y 2 del gen
“verde”, marcado con 32P por “nick translation”. Esta sonda reconoce a ambos genes, aún
en condiciones de alta rigurosidad de hibridación (baja sal).
b) ¿Es el experimento anterior útil para determinar los genotipos de las cuatro personas?
Justifique.
c) Dibuje las bandas de Southern que hubiera obtenido de los mismos pacientes si en lugar
de usar la sonda indicada se hubiera usado como sonda sólo al exón 5. ¿Hubiera sido este
análisis tan informativo como el de la pregunta a)? Justifique.
d) Una manera más rápida de efectuar el análisis de los cuatro individuos es realizando una
PCR con “primers” específicos para el gen “verde” que se aparean a zonas de sus exones 4
y 5, según se ve en la Figura 3. Estos primers no se aparean con las secuencias de los exones
4 y 5 del gen “rojo”:
Diga si detecta o no productos de PCR y de qué tamaño para cada uno de los cuatro
individuos, habiendo usado como molde DNA genómico de sangre.
e) ¿Qué productos de PCR y de qué tamaño habría obtenido en cada uno de los individuos
si hubiera usado como molde cDNA total obtenido de retina?
f) ¿Con cuál de las dos hebras (codificante o no codificante) se aparea el primer izquierdo?
¿Y el derecho?
g) La deleción de la región del cromosoma X marcada como LCR en la figura 1 provoca
una fuerte disminución de la transcripción de ambos genes R y V. ¿Qué función le atribuiría
Ud. a la región LCR? ¿Qué motivos de secuencia aminoacídica esperaría Ud. encontrar en
las proteínas que se unan a la región LCR? Justifique.
h) ¿Qué fenotipo esperaría Ud. encontrar en un animal (cuyo mecanismo de visión
policromática normal fuera similar al de los humanos) en el cual se haya introducido un
transgén que llevara la región promotora del gen “rojo” incluyendo el LCR, colocada “río
arriba” del gen de la toxina diftérica, una proteína que mata sólo a las células donde se
fabrica.
i) ¿Qué colores percibirán los humanos R-V- y los humanos que tienen delecionado el LCR?
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PROBLEMA 2
Primera parte
El factor de transcripción trimerina, que se fabrica sólo en células de la glándula mamaria,
es producto de un gen maestro que determina la diferenciación de la glándula y activa la
transcripción de los genes que producen p roteínas de la leche. La Figura 1 muestra la
estructura del gen de la trimerina de ratón. El mRNA de este gen presenta splicing
alternativo de su exón 3, que codifica para el dominio de transactivación de este factor de
transcripción. En condiciones normales, en cada célula de la glándula mamaria se
producen cantidades suficientes de los 2 mRNAs: el que incluye al exón 3 y el que lo
excluye.
Preguntas:
a) ¿El sitio marcado con un signo de interrogación en la Figura 1 es donde termina la
transcripción? Justifique brevemente.
b) i) Dibuje las bandas y asigne la longitud de los mRNAs en nucleótidos en un experimento
de Northern donde RNA total de glándula mamaria de ratón es hibridado con una sonda
correspondiente al exón 1 del gen de trimerina, sabiendo que la subunidad α es 10.000
Daltons más pesada que la β.
ii) Dibuje las bandas que observaría si hubiera usado como sonda al exón 3.
c) ¿Cuál será la longitud del transcripto primario del gen de trimerina? ¿La especie
molecular llamada “transcripto primario” existe realmente? Justifique.
d) ¿Está bien llamar exón al exón 1 si bien éste no codifica ninguna porción de la proteína
trimerina? Justifique.
e) Dibuje las bandas y asigne el PM en kilodaltons en un experimento de Western (gel de
poliacrilamida con SDS, una calle con y otra sin mercaptoetanol) donde proteínas de
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glándula mamaria de ratón son reveladas con un anticuerpo que reconoce la secuencia
aminoacídica codificada por el exón 4 de la trimerina.
f) Existe una cepa de ratón mutante en que el gen (maestro) de la trimerina se transcribe
muy poco (prácticamente a niveles basales) y su fenotipo es ausencia de glándula
mamaria. En lugar de estar mutado el promotor del gen de trimerina, se descubrió que lo
que se encuentra fallado por una mutación es el splicing alternativo de su exón 3 de modo
que éste no se incluye nunca en el mRNA maduro. Explique cómo la mutación mencionada
afecta la expresión de trimerina y la aparición de glándula mamaria.
Segunda parte
En un intento por disminuir el consumo de bebidas alcohólicas por parte de los jóvenes en
los boliches, el gobierno de Vacalandia quiere promover el consumo de leche. Para ello, ha
contratado a la empresa biotecnológica “Greenmuuuu” para que genere vacas
transgénicas que fabriquen una leche que se vea verde fluorescente cuando es iluminada
por luz negra (luz de 400 nm de longitud de onda, cercana al ultravioleta), justamente el
tipo de iluminación que se usa para bailar en los boliches, suponiendo que la leche verde
fluorescente resultará tan atractiva y divertida para los jóvenes que la preferirán en lugar del
alcohol.
Para lograr su cometido, la empresa obtuvo vacas transgénicas usando un plásmido en el
cual el cDNA del gen GFP fue colocado río abajo del promotor y enhancer del gen de la
quesina de vaca, un gen que sólo se expresa en glándula mamaria (Figura 3).
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PROBLEMA 3
Transmitido por el mosquito Aedes aegypti, el virus del dengue es el agente causal de la
llamada “fiebre dengue”, enfermedad que ha reaparecido recientemente en forma
preocupante en diversas regiones tropicales del mundo y también en nuestro país, sobre
todo en la provincia del Chaco. Un síntoma que suele producir en los casos severos es
hemorragia debido a una exagerada respuesta de las células del sistema inmune
infectadas, lo cual provoca muerte de células de los vasos sanguíneos.
El virus, de la misma familia del de la fiebre amarilla, tiene como genoma una única
molécula de RNA de cadena simple, de 10,7 kilobases (kb) y no contiene ni codifica
transcriptasa reversa. Este genoma codifica para 10 polipéptidos virales, todos de diferente
estructura primaria. Tres de estos polipéptidos, llamados estructurales, forman parte, junto al
RNA, de la partícula viral o virión. Los 7 polipéptidos restantes (llamados NS1, NS2a, NS2b,
NS3, NS4a, NS4b y NS5) no forman parte de los viriones, pero tienen diversas actividades
enzimáticas, algunas importantes para la replicación del virus en la célula infectada. NS5 es
la polimerasa encargada de replicar al genoma viral y fabricar mRNA a partir del mismo.
Preguntas:
a) Marque en las siguientes opciones qué tipo de polimerasa será NS5 y justifique su opción:
i) DNA polimerasa DNA dependiente
ii) RNA polimerasa DNA dependiente
iii) RNA polimerasa RNA dependiente
iv) DNA polimerasa RNA dependiente
b) ¿Necesitará la polimerasa viral NS5 un “primer” para funcionar? Justifique.
c) ¿Tendrá esta polimerasa actividad de "proofreading" o lectura de pruebas (3’-5’
exonucleasa)?
Analizando la secuencia del mRNA de una de las variedades argentinas se observó que a
partir del primer codón AUG en adelante, no hay ningún codón stop de la traducción (UAA,
UAG o UGA) hasta el codón número 3.393 (UAA), localizado muy cerca del extremo 3’ del
mRNA. Este mRNA da origen a los 10 tipos de proteínas diferentes codificadas por el virus
arriba mencionados.
d) Sabiendo que el genoma de dengue no tiene intrones y que tiene un solo marco de
lectura abierto, ¿qué mecanismo puede explicar la aparición de 10 polipéptidos diferentes?
e) Uno solo de los 10 polipéptidos tiene metionina como primer aminoácido, ¿cuál es?
f) NS3 tiene actividad de helicasa de RNA de cadena doble y también de proteasa. ¿En
qué ayudarán estas dos actividades de NS3 al proceso de replicación del virus?
g) No habiendo vacuna disponible por el momento, los investigadores están tratando de
desarrollar drogas que inhiban específicamente a la polimerasa viral. Se piensa que este
tipo de drogas no afectaría a las células no infectadas del paciente, con lo cual no tendría
efectos secundarios perjudiciales. ¿Por qué tales drogas no afectarían:
i) la duplicación del DNA?
ii) la transcripción de los genes celulares?
iii) el alargamiento de los telómeros de los cromosomas celulares?
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1) El inglés
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RECOMENDACIONES:
- No lea una traducción hecha por otro. Se desvirtuaría el objetivo del T.P.
- Dé una primera leída al paper. Ubique las palabras o frases que no entiende. Trate de
ayudarse con el glosario de esta guía y con el diccionario.
- En un principio pase por alto todo aquello que le parezca incomprensible y tome ventaja
reafirmando todo aquello que le resulte fácil entender. En lecturas sucesivas se aclararán las
porciones originalmente incomprensibles.
- No se detenga en los detalles técnicos de la sección de Procedimientos Experimentales.
Para nuestros fines es mucho más importante la interpretación de los resultados.
5) Cuestionario.
6) Glosario:
Phage: fago
λ PL promoter: promotor de la transcripción del fago lambda (left).
To target: apuntar, dirigir a.
Translation: traducción.
Template: molde.
To anneal: en este caso, re-hibridar.
Temperature sensitive represor: Proteína represora (represor) del promotor que funciona
(reprime) a 30ºC, pero deja de funcionar (no reprime) a 42ºC.
Media: medios de cultivo. Singular: medium.
To transfect: transfectar; en este caso, sinónimo de transformar.
To sonicate: sonicar, romper las bacterias con ultrasonido.
To prevent: prevenir, impedir.
To titrate: titular, como en la titulación de una solución.
To encompass: abarcar.
Feasible: factible.
56
Proc. Nati. Acad. Sci. USA
Vol. 81, pp. 7525-7528, December 1984
Genetics
SIDNEY PESTKA, BRUCE L. DAUGHERTY, VINCENT JUNG, KUNIMOTO HOTTA, AND ROBERT K. PESTKA
Roche Institute of Molecular Biology, Roche Research Center, Nutley, NJ 07110
Communicated by Herbert Weissbach, August 9, 1984
ABSTRACT A plasmid was constructed to generate RNA the mRNA transcribed upon induction of this operon is poly-
complementary to the /8-galactosidase mRNA under control of cistronic, it would be possible to determine the extent of po-
the phage X PL promoter. When this anti-mRNA was pro- larity of the inhibition of translation if RNA complementary
duced, synthesis of 13-galactosidase was dramatically inhibited only to the lacZ (,3-galactosidase) coding sequence was used
(98%). Syntheses of galactoside permease and transacetylase, as the anti-mRNA.
whose coding sequences are downstream of the .-galactosidase An 831-base-pair DNA fragment of the lactose operon,
coding region, are inhibited to a lesser degree, 80% and 55%, cloned in phage M13mp7 (6), was the source of a DNA frag-
respectively. The generation of anti-mRNA that can be target- ment containing the sequence coding for the NH2 terminus
ed to inhibit a single species of mRNA molecule within cells of B-galactosidase. This fragment was isolated and placed in
provides a potent mechanism by which specific transcripts can reverse orientation under control of the phage X PL promot-
be translationally inactivated. This can be used to determine er. The gene coding for a temperature-sensitive repressor of
the function of proteins as well as to select cloned genes in a PL, cIts, is carried on a compatible plasmid pRK248cIts (7-
single rapid and convenient step. 9). Thus, at 30°C, no anti-mRNA would be made, but at 42°C
anti-mRNA would be synthesized extensively. On hybridiz-
Inhibition of translation has been efficiently carried out by ing with the mRNA, the anti-mRNA would block translation
antibiotics and other inhibitors of protein synthesis (1). In of the message for ,-galactosidase highly specifically, acting
specific instances, physiological mechanisms have been ma- as a precisely directed anti-mRNA "missile."
nipulated to turn on or off genes such as the lac operon of
Escherichia coli grown in the presence or absence, respec- EXPERIMENTAL PROCEDURES
tively, of a 0-galactoside (see ref. 2). However, no general Media, Enzymes, and Electrophoresis. M9 medium consist-
method has been described to block the translation of a spe- ed of 50 mM Na2HPO4, 28 mM KH2PO4, 8.5 mM NaCl, 19
cific mRNA molecule. mM NH4Cl, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 0.4% Casamino
It has been known that RNA with substantial structure, acids, 1% glycerol, and thiamin at 2 ,ug/ml. Restriction endo-
such as double-stranded RNA, serves as a poor template for nucleases were obtained from Bethesda Research Labora-
protein synthesis (1, 3). Knowledge of this has been used tories. T4 DNA ligase was obtained from Amersham. Aga-
effectively to block translation in cell-free extracts. In vitro, rose gel electrophoresis was performed according to the pro-
hybrid-arrested translation has been reported to prevent the cedures of Sharp et al. (10). Fragments were isolated from
synthesis of specific proteins (4, 5) and has been used to de- the gels by the method of Schmitt and Cohen (11).
tect recombinant DNA molecules containing sequences Construction of Plasmids. Phage M13mp7 was used to iso-
complementary to a given mRNA. The procedures of hy- late a BamHI/Cla I fragment containing some of the se-
brid-arrested translation involve DNARNA hybridization, quence coding for the NH2-terminal region of,-galacto-
wherein the double-stranded DNA is denatured by heating sidase, beginning at amino acid 6 (Fig. 1). The plasmid
and annealed with a population of mRNA molecules. Hy- pRC23, which contains the phage X PL promoter, was cut
bridization of DNA to the mRNA effectively blocked trans- with restriction endonucleases Cla I and BamHI. The large
lation of these mRNA molecules that formed hybrids. Cla I/BamHI fragment from the plasmid was isolated and
To develop a method to block the translation of specific ligated to the small BamHI/Cla I fragment containing part of
mRNA molecules in intact cells, we postulated that RNA the lacZ as described above (Fig. 1). Ligations were per-
complementary to mRNA would also effectively block formed in 66 mM Tris HCI, pH 7.5/5 mM MgCl2/5 mM di-
translation if RNA-RNA hybridization would occur readily thiothreitol/1 mM ATP for 16 hr at 15°C. DNA concentra-
under physiological conditions within the cell. Because sin- tion was between 1 and 10 nM and phage T4 DNA ligase was
gle-stranded complementary RNA molecules can be readily used at 300 units/ml. The result was a plasmid, pBD4/lacZ'-
generated within cells by appropriate vectors, the hypothesis (rev), containing a lacZ gene fragment in reverse orientation
could be tested conveniently. The objective was to generate with respect to the PL promoter. This plasmid was transfect-
anti-mRNA intracellularly to block translation of specific ed into E. coli 294 harboring the compatible plasmid
proteins. The present communication describes the con- pRK248cIts containing the temperature-sensitive X repres-
struction and use of complementary RNA generated in vivo sor clts (7-9). Little or no anti-mRNA would be synthesized
to block translation of only a single species of mRNA mole- at 30°C. At 42°C, anti-lacZ mRNA would be synthesized at
cules to which it can specifically hybridize. high levels.
Growth of Bacteria. E. coli 294(pRK248cIts) harboring
PRINCIPLE OF THE PROCEDURE pRC23 or pBD4/lacZ'(rev) was grown in 10 ml of M9 medi-
Because the lac operon of E. coli is well understood, it was um containing 1% glycerol overnight at 30°C. To start the
chosen as the focus of these initial studies. In addition, since experiment, two flasks containing 150 ml of fresh M9 medi-
um (1% glycerol) were inoculated with the E. coli containing
The publication costs of this article were defrayed in part by page charge
pRC23 and another two flasks containing the same medium
payment. This article must therefore be hereby marked "advertisement"
in accordance with 18 U.S.C. §1734 solely to indicate this fact. Abbreviation: IPTG, isopropyl A-D-thiogalactoside.
7525
7526 Genetics: Pestka et aL Proc. NatL. Acad. Sci. USA 81 (1984)
agqI EoORI
c/oI
BomHI
PstI
0 pRC23
BimHI
BomHI
CloI
CIaI ,--~""-~
BomHI
CloI BomHI I
m HI
FIG. 1. Construction of pBD4/lacZ'(rev) from pRC23 and M13mp7. Details are given in the text. The portion of the lacZ gene contained in
the BamHI/Cla I fragment from M13mp7 represents nucleotides 19-440 of lacZ, with the initiator AUG of the lacZ gene taken as position 1.
This fragment is designated lacZ'. Amp, ampicillin, Tet, tetracycline.
were inoculated with the E. coli containing pBD4/lacZ'- mM MgSO4 and resuspended in 0.2 ml of the same buffer. In
(rev). These were grown at 30'C until the optical density at each of four tubes, 50 ,ul of the bacterial suspension was add-
600 nm reached about 0.5. At this point, isopropyl ,/-D-thio- ed, after which they were incubated at 26°C for 5 min. With a
galactoside (IPTG) was added to one flask of each of the Hamilton syringe, 2 ,l of 10 mM [14C]methyl 3-D-thiogalac-
cultures to a final concentration of 1 mM. Aliquots of each of topyranoside (New England Nuclear; 22.5 mCi/ml; specific
the four cultures were removed and placed at 00C at the activity 25.6 Ci/mmol; 1 Ci = 37 GBq) was added to each of
starting time of induction (0 min). The cultures were then the four tubes for 0, 15, 30, and 60 sec. The reaction was
placed in a 420C water bath and shaken vigorously. Aliquots stopped by the addition of 3.5 ml of 0.1 M potassium phos-
from each of the four cultures were taken at 15, 30, 60, 90, phate buffer, pH 5.5, containing 100 mM LiCl. The solution
and 120 min and placed at 0C until assayed a short time was filtered on a 25-mm 0.45-gm Amicon filter (no. 041255)
later. and washed with 3.5 ml of the same solution. The radioactiv-
Enzyme Assays. Assays for B-galactosidase, lactose per- ity on the filter was then measured in 10 ml of Bray's solu-
mease, transacetylase, and alkaline phosphatase were per- tion in a scintillation spectrometer.
formed as described (12-15). Enzyme concentrations were Assay of thiogalactoside transacetylase. Aliquots of bac-
determined from the linear portions of the curves in all cas- terial suspension were centrifuged at 10,000 x g for 5 min.
es. The specific procedures are given below. The pellets, resuspended in 250 ,ul of 50 MM Tris HC1, pH
Assay of p-galactosidase. 8-Galactosidase was measured 7.8, were assayed for thiogalactoside transacetylase as re-
as described (12) with minor modifications. Samples of bac- ported (14). The suspensiohs were sonicated twice for 15 sec
terial cultures were diluted with Z buffer (50 mM sodium on ice. The extracts were heated at 70°C for 5 min and centri-
phosphate, pH 7.0/10 mM KCl/1 mM MgSO4/50 mM 2-mer- fuged in a Microfuge for 15 min. Each supernatant was trans-
captoethanol) into a total volume of 1.1 ml. Two drops of ferred to a fresh tube. The reaction was started by mixing 0.5
chloroform and one drop of 0.1% sodium dodecyl sulfate ml of a solution consisting of 50 mM Tris HCl at pH 7.8, 2
were added, after which tubes were swirled on a Vortex mix- mM EDTA, 1 mM 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), 0.1
er for 10 sec. The tubes were then placed in a water bath for mM acetyl-CoA, and 50 mM IPTG with 200 ,l of the bacteri-
5 min at 30°C. A 1-ml sample was then added to a cuvette. al extracts. The solution was transferred to a cuvette, which
The reaction was started by adding 0.2 ml of o-nitrophenyl ,3- was placed in a Beckman DU-8 spectrophotometer that was
D-galactoside (4 mg/ml) and lnixed for a few seconds. The programmed to calculate changes in absorbance at 412 nm as
cuvette was then placed in a Beckman DU-8 spectrophotom- a function of time.
eter which was programmed to determine changes in absorb- Assay of alkaline phosphatase. Aliquots of bacterial sus-
ance at 420 nm per min. pensions were centrifuged at 10,000 x g for 5 min. The pel-
Assay of lac carrier protein. Lactose permease was as- lets were washed in 2 ml of 0.1 M Tris-HCl, pH 7.4. After
sayed as described (12, 13) with modifications as noted be- centrifugation, the pellets were resuspended in 2 ml of the
low. Aliquots of bacterial suspensions were centrifuged at same buffer. The assay consisted of mixing 0.5 ml of the
10,000 x g for 5 min. The pellets were washed with 2 ml of bacterial suspension with 1 ml of 1 M Tris HCl, pH 8.8, and
0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.5, containing 10 incubating at 37°C for 5 min. The reaction was started by the
Genetics: Pestka et aL Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 7527
pRC23 + ePTu
C 0.02
0
N
~~~~~~Rev
Z + I PTG
<
0.01
< 4
RevZ
pRC23
0 30 60 90 120
MINUTES AT 420C 0 30 60 90 120
MINUTES AT 420C
FIG. 2. B-Galactosidase as a function of time after cells were
transferred to 420C in the presence or absence of IPTG. 83-Galacto- FIG. 4. Thiogalactoside transacetylase as a function of time after
sidase levels in cells containing plasmid pRC23 or pBD4/lacZ'(rev) cells were transferred to 42°C in the presence or absence of IPTG.
are designated by curves labeled pRC23 and RevZ, respectively. Curves are labeled as in Fig. 2.
addition of 0.5 ml of 0.04 M p-nitrophenyl phosphate and the thesis of lactose permease and thiogalactoside transacety-
mixture was incubated at 37°C. At 30, 60, and 120 min, 0.7 lase encoded by the same polycistronic message, these en-
ml was centrifuged in a Microfuge for 5 min and the superna- zymes were also assayed in the same series of cultures with
tant was transferred to a fresh tube. The absorbance at 420 and without induction with IPTG (Figs. 3 and 4). The per-
nm was measured in a spectrophotometer and the change per mease and transacetylase were induced concomitantly with
min was determined from the readings at different times. pB-galactosidase; however, their synthesis was not inhibited
as much as that ofl-galactosidase by anti-lacZ mRNA (Figs.
RESULTS 3 and 4; Table 1). Nevertheless, the same pattern of inhibi-
When E. coli 294 containing the parental plasmid pRC23 was tion was seen as with j-galactosidase. The synthesis of an
induced at 42°C with IPTG, there was a rapid rise in synthe- enzyme, alkaline phosphatase, encoded by another mRNA
sis of p-galactosidase (Fig. 2). When E. cOli 294 with the was not affected either by IPTG or by the anti-lacZ mRNA
plasmid containing the reverse orientation was induced, the (Fig. 5). Thus, in all cases, the presence of the plasmid con-
rise inB-galactosidase synthesis on induction with IPTG was taining lacZ in the reverse orientation was sufficient to in-
essentially prevented. The higher uninduced level ofi-galac- hibit the synthesis of 8-galactosidase, permease, and trans-
tosidase in the presence of the plasmid carrying the lacZ acetylase.
fragment was due to titration Qf the lac repressor by the lacZ When induction of E. coli 294 containing plasmid pRC23
segment containing the secondary repressor binding site or pBD4/lacZ'(rev) was performed with IPTG at 30°C, 13-
(refs. 16 and 17; also see discussion below). In the absence of galactosidase in both cultures increased to about the same
IPTG, induction of the PL promoter at 42°C decreased the levels (data not shown). Under these conditions, there was
endogenous level of B-galactosidase in E. coli 294/pBD4/ no inhibition of,-galactosidase synthesis in E. coli 294 con-
lacZ'(rev). taining the plasmid pBD4/lacZ'(rev), as expected, since no
To determine if the anti-lacZ segment also prevented syn- reverse transcript is synthesized at 30°C, where the PL pro-
moter remains repressed.
A) GUÍA DE ESTUDIO
5) ¿Qué utilidad tiene para la bacteria que la lactosa sea un inductor de su operón y, en
cambio, el triptofano un co-represor del suyo?
7) ¿Qué papel juega el AMP cíclico (cAMP) en la transcripción de los genes del operón
lactosa?
10) Aceptando el hecho de que todas las células de un organismo pluricelular poseen los
mismos genes, ¿qué ocurriría en ese organismo si no existiera el fenómeno de regulación de
la expresión genética?
11) ¿Qué elementos del sistema del operón lactosa actúan en cis y cuáles en trans?
13) ¿Qué son los factores de transcripción? ¿Cómo funcionan? ¿Qué relaciones tienen con
los productos de los oncogenes?
14) ¿Qué son las estructuras "cierre relámpago" de leucinas, "dedos" de zinc y hélice vuelta
hélice?
61
IBMC 2011
B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
a) Describa el fenotipo correspondiente a los siguientes genotipos:
FENOTIPO
NO INDUCIDO INDUCIDO
reconocimiento reconocimiento
GENOTIPO actividad β-gal actividad β-gal
por Ac. anti β-gal por Ac. anti β-gal
i+p-ocz+
i+p+oczcrm
i+p+ocz+ / i+p-oczcrm
i-p+o+z+
i+p+oczcrm / i-p+o+z+
PROBLEMA 2
Dos horas después de agregar el compuesto X a un cultivo de bacterias, en presencia o
ausencia del antibiótico cloranfenicol, se midió la actividad de 3 enzimas: A, B y C. De
acuerdo a los resultados de la tabla, defina cuál de las enzimas es constitutiva, cuál
activable y cuál inducible por el compuesto X.
PROBLEMA 3
La termoestabilidad de la DNA polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus (T. aquaticus)
ha contribuido a la automatización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), al
evitar el agregado de enzima en cada ciclo. Es posible purificar la enzima a partir de T.
aquaticus, pero los rendimientos son bajos y es más difícil cultivar esta bacteria termófila
(crece a 95ºC) que a E. coli.
El clonado del gen de la DNA polimerasa de T. aquaticus y su expresión en E. coli (Lawyer et
al. J. Biol. Chem. 264, 6427, 1989) permitió evitar los dos problemas mencionados y producir
la enzima en escala industrial. La estrategia utilizada para expresar la Taq polimerasa en E.
coli fue transformar esta última con un plásmido que lleva el gen completo de la Taq
polimerasa (desprovisto de su propio promotor), colocado río abajo de la zona regulatoria
del operón lac, la cual incluye el gen del represor (i), el promotor (p) y el operador (o).
62
IBMC 2011
Indique el/los cultivo/s que Ud. elegiría como material de partida para la purificación de
Taq polimerasa, con el objeto de usarla después en reacciones de PCR. Fundamente las
respuestas.
1 37°C lactosa
5 95°C lactosa
PROBLEMA 4
Existe una variante mutante del gen que codifica para la proteína represora del operón lac
de E. coli que se denomina super represor (lac IS). Este represor mutante se caracteriza por
ser incapaz de unirse al inductor del operón (alolactosa, IPTG, etc.).
Sin embargo, el super represor conserva intacta la capacidad de unirse al operador del
operón lac. Suponga que, en una bacteria que posee en su cromosoma una mutación lac
IS y el resto del operón lac normal, se introduce un plásmido que contiene un operón lac
normal entero (incluyendo un gen del represor normal lac i+). Si se cultiva la bacteria en un
medio que contiene lactosa:
a) ¿Es la β-galactosidasa de esta bacteria constitutiva, inducible o ininducible?
b) ¿Cuál de los dos genes (lac IS o lac i+) será dominante? ¿En cis o en trans?
c) ¿Cuál será el efecto sobre la expresión de las proteínas del operón lac de agregar AMP
cíclico (cAMP) al medio de cultivo? ¿Y el de agregar glucosa?
d) ¿Podrá crecer esta bacteria en otro medio de cultivo adecuado que contenga lactosa
como único alimento? ¿Y si también se agrega IPTG a este medio?
PROBLEMA 5
(Basado en los papers de Chopra et al., J. Biol. Chem. (marzo 2003) y Park et al., Science
(sept 2002).)
63
IBMC 2011
canal. A través de este canal, el otro componente proteico, llamado “factor letal” (LF), es
capaz de pasar al citosol de las células infectadas, para allí ejercer su acción devastadora.
Para comprender los mecanismos de la acción mortífera del ántrax, se realizó el siguiente
experimento:
Mediante PCR (usando DNA del ántrax como molde y primers apropiados), se amplificó el
gen de PA (desprovisto de su propio promotor), el cual fue colocado en un plásmido, río
abajo de la región regulatoria completa del operón lac, como se muestra en la figura:
Preguntas:
a) ¿La cepa de E. coli transformada con el plásmido de la figura podrá causar la
enfermedad del antrax? ¿Por qué?
b) Dibuje la curva de crecimiento bacteriano y el gráfico de cantidad de PA biosintetizada
en función del tiempo de cultivo, esperable para cada uno de los cinco casos. Tome en
cuenta el fenómeno de diauxia. Justifique sus respuestas muy brevemente.
c) ¿Habría podido realizarse este experimento si no se hubiera agregado penicilina en la
primera etapa del cultivo? ¿Por qué?
PROBLEMA 6
La proteína de shock térmico (heat-shock protein) GroEL de Escherichia coli tiene un PM de
57.000 Daltons y forma multímeros tetradecaméricos (14 subunidades). GroEL es inducible
por calor (tratamiento de las bacterias 5 minutos a 43°C).
Preguntas:
a) ¿Qué significa que GroEL es inducible?
b) El hecho de que GroEL sea inducible por calor, ¿le sugiere alguna hipótesis sobre las
características de la proteína represora? ¿Cuál es esa hipótesis?
c) ¿Qué tipo de mutantes de E. coli en que GroEL no sea inducible por calor deberían poder
encontrarse?
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IBMC 2011
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IBMC 2011
CÉLULA I
A) GUÍA DE ESTUDIO
9) ¿Qué son los hoyos revestidos (coated pits) y las vesículas revestidas (coated vesicles)?
¿De qué están revestidos?
12) ¿Qué es un liposoma? Mencione alguna de las utilidades de los mismos en biología
molecular y celular.
14) ¿Qué estructuras conforman el aparato de Golgi? ¿Qué funciones tiene el mismo? ¿Y
específicamente en células vegetales?
15) ¿En qué compartimento celular se glicosilan las proteínas? ¿Qué ocurre con las cadenas
de oligosacáridos unidas a proteínas en el aparato de Golgi?
16) ¿Qué destino celular tienen las proteínas cuyo mRNA codifica para una secuencia
hidrofóbica (péptido señal) en el extremo N-terminal? ¿Qué entiende por descarga
vectorial?
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IBMC 2011
18) ¿Dónde y de qué manera se originan los lisosomas? ¿Cuál es el contenido de los
lisosomas? ¿Qué ocurre si penetra al lisosoma una droga como la cloroquina que es capaz
de captar ávidamente H+?
21) Describa cómo participan los canales de Na+ y K+ en la generación de los potenciales
de reposo y acción de las células nerviosas. ¿Qué es el "patch clamp"?
67
IBMC 2011
B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
La adenilato ciclasa (AC) eucariótica es una enzima de membrana plasmática que fabrica
cAMP hacia el citoplasma. Para que la producción de cAMP sea estimulada, la AC tiene
que encontrarse unida a un receptor celular, el cual a su vez haya unido su ligando
específico (hormona adrenalina, por ejemplo). Se dispone de dos tipos celulares mutantes:
las células A poseen receptores para adrenalina pero no tienen AC. Las células B poseen
AC, pero no tienen receptores para adrenalina.
Preguntas:
a) ¿Por qué se observa activación solamente en el caso 8?
b) ¿Qué ocurrió en los otros experimentos y para qué fueron realizados?
c) ¿Habría cambiado el resultado si las células A y B hubieran sido obtenidas de animales
alimentados durante largo tiempo con una dieta rica en ácidos grasos saturados?
PROBLEMA 2
La enzima X es una proteína de membrana mitocondrial interna y está formada por dos
polipéptidos (a de 40.000 Da y b de 22.000 Da) unidos por fuerzas no covalentes. Se dispone
de preparaciones de membranas mitocondriales abiertas y de mitocondrias sometidas a
diversos tratamientos, obteniéndose las siguientes fracciones:
68
IBMC 2011
Actividad
Polipéptido a Polipéptido b
enzimática (*)
P1 0 No No
I
S1 100 Si (40 kDa) Si (22 kDa)
P2 0 Si (40 kDa) No
II
S2 0 No Si (22 kDa)
P3 100 Si (30 kDa) Si (22 kDa)
III
S3 0 No No
P4 0 Si (20 kDa) No
IV
S4 0 No No
V F5 0 Si No
69
IBMC 2011
f) ¿Qué le indica el hecho de que el tratamiento con tripsina de las vesículas de membrana
interna right side out (III) no afecte a la actividad de la enzima X?
g) Haga un esquema de un trozo de membrana mitocondrial y ubique, con su orientación
correcta, los polipéptidos a y b de acuerdo con lo respondido en las preguntas anteriores.
PROBLEMA 3
Hace algunos años se ha descubierto que, pese a tener secuencias aminoacídicas muy
diversas, todas las proteínas peroxisomales poseen cerca de su extremo carboxi-terminal la
secuencia Ser-Lys-Leu (SKL, en el código de una letra). Esta secuencia consenso SKL sirve de
"etiqueta" para dirigir a estas proteínas a los peroxisomas. Por métodos de ingeniería
genética es posible construir un plásmido de expresión en células de mamíferos con un
cDNA para la proteína peroxisomal luciferasa que contiene la secuencia SKL (Figura 1).
Cuando se transfectan células de mamíferos en cultivo con este plásmido se observa que la
luciferasa codificada por el mismo se almacena correctamente en los peroxisomas, por un
mecanismo similar al de la catalasa. Por manipulaciones génicas fue posible delecionar la
secuencia SKL o agregar secuencias provenientes de genes de otras proteínas (ver figuras).
En todos los casos las modificaciones no alteran el marco de lectura del resto de la
luciferasa.
Preguntas:
a) ¿Por qué mecanismo entra al peroxisoma la luciferasa codificada por el plásmido de la
Figura 1?
b) ¿En qué compartimento celular se almacenará la luciferasa codificada por el plásmido:
i) de la Figura 2?
ii) de la Figura 3?
Justifique sus respuestas describiendo los pasos por los que la proteína llega al
compartimento correspondiente. Describa los mecanismos moleculares y si corresponde la
orientación final de la proteína.
c) Los tres cDNAs de luciferasa codifican para la secuencia consenso de glicosilación
Asparagina-X-Serina (NXS en el código de una letra) ¿Cuáles de las tres luciferasas
producidas terminarán glicosiladas? Justifique su respuesta.
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IBMC 2011
PROBLEMA 4
En las levaduras la degradación de los ácidos grasos ocurre en los peroxisomas. Los ácidos
grasos (ácidos carboxílicos de cadena larga que forman parte de los fosfolípidos) se
degradan totalmente hasta fragmentarse en moléculas de Acetil-CoA. Este Acetil-CoA sale
del peroxisoma gracias a una enzima proteica de localización peroxisomal llamada
carnitina acetiltransferasa y entra en la mitocondria ayudado por la misma enzima, de
localización mitocondrial. Una vez en la mitocondria, el Acetil-CoA entra al ciclo de Krebs,
contribuyendo a la obtención de energía metabólica (ATP) del mismo modo que lo hace el
Acetil-CoA proveniente de la glucólisis. Un único gen de localización nuclear codifica para
las dos formas (peroxisomal y mitocondrial) de la carnitina acetiltransferasa:
Preguntas:
a) ¿En qué compartimento celular se sintetizan las carnitina acetiltransferasas mitocondrial y
peroxisomal; y qué tipo de translocación las lleva a sus destinos?
b) ¿En qué compartimento/s celular/es se acumulará la actividad de carnitina
acetiltransferasa en las siguientes condiciones:
i) levaduras cultivadas sin ácidos grasos en el medio de cultivo.
ii) levaduras cultivadas con ácidos grasos en el medio de cultivo.
c) ¿Cuál será la ventaja (valor adaptativo) de que el promotor 2 (y no sólo el 1 o ambos)
sea inducible por ácidos grasos?
d) Para cada una de las dos condiciones de cultivo de la pregunta b), indique él o los
destinos celulares de la actividad de carnitina acetiltransferasa para las siguientes
mutaciones de su gen (suponga en todos los casos que las mutaciones se encuentran en
homocigosis):
i) Deleción de la secuencia que codifica para la señal de transporte a mitocondria
(MTS).
ii) Deleción de la secuencia que codifica para AKL.
iii) Deleción de ambas secuencias (MTS y AKL).
iv) Inserción, en el exón 2, río abajo del ATG y en fase de traducción con éste (se
mantiene el marco de lectura), de una secuencia codificante para un péptido señal
start transfer, que incluye el sitio de reconocimiento para la peptidasa de la señal.
e) ¿Cuál es la causa molecular de que ninguna de las carnitina acetiltransferasas
estudiadas (ni la enzima normal ni las mutantes descriptas en la pregunta d) se almacenen
en los lisosomas?
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IBMC 2011
PROBLEMA 5
La calreticulina es una proteína con actividad de chaperona, localizada normalmente en el
lumen del retículo endoplasmático rugoso. Su actividad consiste en plegar correctamente
proteínas mal plegadas, a las cuales reconoce sólo si están glicosiladas en asparragina con
un oligosacárido que aún contenga la glucosa terminal. Se obtuvo una línea celular de
ratón donde se anularon (knockearon) los dos alelos del gen de la calreticulina (células
calret-). Si bien estas células son viables, pliegan mal algunas de sus proteínas, en particular
a una glicoproteína de secreción llamada fibronectina.
Se transfectaron células calret- con distintos clones de cDNA de calreticulina (Figura 1) que
la dirigen a diferentes compartimentos celulares. La construcción A corresponde a la
calreticulina normal (salvaje), en tanto que las construcciones B a D son variantes
artificialmente creadas.
72
IBMC 2011
Preguntas:
a) ¿Por qué las células calret- sin transfectar tienen niveles mucho más bajos de fibronectina
en el medio condicionado que las células normales? Justifique.
b) ¿A qué compartimentos celulares se dirigieron y en qué forma se acumularon (soluble o
de membrana) las calreticulinas codificadas por las construcciones A, B, C, D y E usadas
para transfectar las células calret-? Justifique su respuesta poniendo en evidencia sus
conocimientos teóricos sobre los mecanismos de direccionamiento de proteínas en las
células eucariotas. En los casos de membrana dibuje la topología de la proteína
calreticulina en la misma.
c) ¿Por qué las transfecciones con las construcciones B, C, D y E no recuperaron los niveles
de fibronectina en el medio? Justifique su respuesta para cada una de las construcciones
indicando si en cada destino la chaperona encontró o no a la fibronectina, y, en caso de
haberla encontrado por qué no pudo plegarla correctamente.
d) ¿Qué resultados habría obtenido si en los experimentos de la Figura 2, en lugar de medir
cantidad de fibronectina en el medio, hubiera medido cantidad de fibronectina
intracelular? Dibuje el gráfico de barras y justifique.
PROBLEMA 6
La proteína 1 es una proteína lisosomal. Se obtuvieron 3 variantes (2 a 4). Todas ellas, al igual
que la 1, se translocan co-traduccionalmente en el retículo endoplasmático rugoso. Indique
justificando:
a) el destino final de cada una de las 3 variantes.
b) cuál/cuáles de las 4 podrá/n estar sujeta/s al control de calidad de plegamiento que
tiene lugar en el lumen del rugoso.
73
IBMC 2011
PROBLEMA 7
El Dominio de Agregación Condicional (DAC) es una secuencia aminoacídica que, por
presentar alta afinidad por sí misma, provoca el agregado y precipitación de las proteínas
que la poseen. A su vez el DAC presenta sitios de unión específica para el ligando sintético
AP22542 (una molécula orgánica, no tóxica, pequeña e hidrofóbica que no es fabricada en
células animales). Cuando se une al DAC, AP22542 promueve la desagregación de la
proteína, permitiendo que la misma se pliegue correctamente y no precipite.
La agregación de proteínas en el retículo endoplasmático rugoso provoca la retención de
las mismas en su lumen, mientras que si se encuentran solubles y bien plegadas, dichas
proteínas siguen la vía normal de secreción. La agregación de proteínas en el citoplasma
(citosol) provoca la inmediata degradación total de las mismas por proteasas inespecíficas.
Teniendo en cuenta estos conceptos, Rivera et al. (Science 287, 826-830, 2000) transfectaron
células humanas en cultivo con la construcción I con el fin de desarrollar un sistema de
expresión de proteínas recombinantes controlable por la adición o no del ligando AP22542
al medio de cultivo de las mismas. Entre el cDNA para DAC y el cDNA para la proteína X
introdujeron una región que codifica para el sitio de reconocimiento de la proteasa FURINA,
presente en todos los tipos celulares de mamíferos, pero de localización exclusiva en el
lumen del aparato de Golgi.
Preguntas:
a) ¿En qué destino (núcleo, citosol, lisosomas, peroxisomas, RER, Golgi, mitocondrias, medio
extracelular) encontrará Ud. una banda que sea reconocida por el anticuerpo
mencionado? ¿Qué peso molecular tendrá la banda observada? (considere 1 aminoácido
= 100 Daltons). Justifique su respuesta.
b) ¿En qué compartimentos encontrará Ud. una banda que sea reconocida por el
anticuerpo mencionado y qué peso molecular tendrá la banda observada en una
transfección igual a la de la pregunta a) pero en presencia del ligando AP22542? Justifique.
c) ¿Qué resultados de Western habría obtenido en cada caso si se hubieran usado para
transfectar las construcciones II y III, en ausencia y en presencia del ligando AP22542?
Justifique.
74
IBMC 2011
e) Si con fines de terapia génica se utilizara una construcción similar a la I donde la proteína
X fuera insulina y el promotor fuera de expresión en todos los tejidos, introduciéndola de
manera estable en cualquier tipo celular del paciente, ¿qué debería administrarse a los
pacientes y en qué momentos del día, para garantizar una secreción y función de insulina
recombinante similares a las fisiológicas? Justifique.
PROBLEMA 8
La fusión entre una vesícula de transporte y una membrana "blanco" ("target" en inglés) se
lleva a cabo gracias a la existencia de proteínas integrales de membrana específicas
llamadas SNAREs. La vesícula presenta en su membrana un v-SNARE, anclado por un
dominio de transmembrana hidrofóbico, exponiendo hacia el citoplasma un dominio (DIE)
que interacciona específicamente con el DIE del t-SNARE que se encuentra anclado en la
membrana "target". Los DIEs son alfa hélices e interaccionan entre sí formando un "coiled-
coil" o torzada. La unión de los dos tipos de SNARE por sus DIEs atrae físicamente a las dos
membranas a una distancia tan corta (1,4 nm) que sus fosfolípidos se reordenan
espontáneamente y se produce la fusión. La Figura 1 muestra el paso previo a la fusión de
una vesícula de transporte y la membrana plasmática que dará lugar a una exocitosis.
75
IBMC 2011
Con el fin de usar el mecanismo de los SNAREs para lograr fusión de células entre sí, se
fabricó una serie de clones de expresión de cDNAs de v- y t-SNAREs modificados con el
agregado de un péptido señal start transfer y sitio para la peptidasa de la señal, para
dirigirlos a otro destino celular y/o con otra topología (Fig. 2).
Preguntas:
a) Explique para cada una de las 10 transfecciones por qué razón hubo o no fusión celular
describiendo el destino celular de las proteínas recombinantes expresadas, su topología y
glicosilación. Justifique.
b) La tunicamicina es una droga que inhibe la glicosilación de proteínas en asparagina.
Sabiendo que los v- y t- SNAREs normales tienen en sus DIE las secuencias Asn-Ala-Ser y Asn-
Glu-Thr repectivamente, ¿qué efectos tendrá el agregado de tunicamicina sobre:
i) la fusión de vesículas con membranas "target" en células normales no transfectadas?
ii) la fusión de células entre sí en células transfectadas con C+D?
iii) la fusión de células entre sí en células transfectadas con A+B?
Justifique
PROBLEMA 9 (OPTATIVO)
La siguiente es una clave dicotómica que permite identificar proteínas de acuerdo a su
localización precisa en los distintos compartimentos de una célula eucariota. Los caracteres
(o “etiquetas”) mencionados corresponden a los de los precursores de las proteínas
maduras.
a) Asigne correctamente el número de una o más proteínas de las listadas más abajo, a
cada casillero de la clave.
Ayuda para el uso de la clave: Para cada proteína compare los dilemas de igual jerarquía
(A y AA, por ejemplo). Si la proteína pertenece a A, entonces continúe comparando los
dilemas B y BB. Si la proteína pertenece a AA, entonces continúe comparando los dilemas G
y GG.
76
IBMC 2011
Clave:
A. Con péptido señal hidrofóbico N-terminal que reconoce al SRP (“signal recognition
particle”) y secuencia de reconocimiento para la peptidasa de la señal.
B. Con péptido hidrofóbico interno “stop transfer” (de anclaje).
C. Con secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal .............................................
CC. Sin secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal ................................................
BB. Sin péptido hidrofóbico interno “stop transfer” (de anclaje).
D. Con secuencia de retención KDEL............................................................................
DD. Sin secuencia de retención KDEL.
E. Con secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal.
F. Con señal conformacional para adición de Man-6P ...............
FF. Sin señal conformacional para adición de Man-6P ..................
EE. Sin secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal ..................................
AA. Sin péptido señal hidrofóbico N-terminal que reconoce SRP.
G. Con péptido “señal” para translocación a mitocondria.
H. Con péptido de anclaje a membrana mitocondrial .............................................
HH. Sin péptido de anclaje a membrana mitocondrial ................................................
GG. Sin péptido “señal” para translocación a mitocondria.
I. Con secuencia SKL de entrada a peroxisoma ........................................................
II. Sin secuencia SKL de entrada a peroxisoma.
J. Con secuencia básica de transporte a núcleo .......................................
JJ. Sin secuencia básica de transporte a núcleo ..........................................
PROBLEMA 10 (OPTATIVO)
Las proteínas peroxisomales (PP) entran al peroxisoma por translocación post-traduccional.
La etiqueta es la secuecnia SKL (Ser-Lys-Leu) localizada en su extremo C-terminal. Dicha
secuencia es reconocida por un receptor proteico citosólico llamado Pex5, el cual a su vez
es reconocido por un receptor proteico de la membrana peroxisomal, llamado Pex 13. La
función de SKL consiste exclusivamente en reconocer y unirse a Pex5. Si un péptido corto
con la secuencia SKL es unido covalentemente a una partícula de oro de 9 nm de
diámetro, equivalente al tamaño de la mayor parte de las PP en su estado plegado, dicha
partícula se transloca normalmente al interior del peroxisoma. La Figura 1 muestra dos
modelos alternativos para el mecanismo de entrada al peroxisoma. En el modelo "A", la PP
se transloca sola, dejando a Pex5 en el citosol. En el modelo "B", se translocan
conjuntamente la PP y Pex5 unidos, volviendo Pex5 al citosol posteriormente.
77
IBMC 2011
Para distinguir entre los dos modelos se hicieron los siguientes experimentos: Se transfectaron
cultivos de células humanas normales o provenientes de un paciente con la enfermedad de
Zellweger con la construcción de la Fig. 2. Las células de estos pacientes tienen peroxisomas
defectuosos porque está anulada la maquinaria de importación de sus enzimas.
La construcción de la Figura 2 expresa una proteína de fusión entre Pex5, la secuencia SKL,
un sitio de reconocimiento para la proteasa Plp, la cual se localiza exclusivamente en el
lumen del peroxisoma, y la porción codificante del gen de la β-galactosidasa de E. coli.
Una vez transfectadas las células y transcurridas 48 hs, se aislaron las proteínas citosólicas y
las contenidas en el lumen de los peroxisomas. Ambas preparaciones fueron analizadas por
la técnica de Western (gel de poliacrilamida con SDS) con una anticuerpo que reconoce al
Pex5 producido por la construcción de la Figura 2 pero no al Pex5 endógeno. En paralelo se
midió la actividad de la β-galactosidasa. Los resultados se encuentran en la Figura 3.
78
IBMC 2011
Preguntas:
a) ¿Cuál de los dos modelos es correcto? Justifique diciendo qué indican cada una de las
bandas de la Figura 3 y la actividad de β-gal.
b) Dibuje Westerns como los de la Figura 3, pero usando un anticuerpo anti β-galactosidasa.
c) ¿Qué resultados habría obtenido en Westerns, (dibújelos) usando el mismo anticuerpo
contra Pex5, si las construcciones transfectadas hubieran tenido las siguientes
modificaciones, todas ellas sin alterar el marco de lectura restante?:
i) Deleción de la secuencia que codifica para SKL.
ii) Inserción de una secuencia que codifica para un péptido señal start tranfer en el
extremo N-terminal de Pex5 .
iii) Deleción de la secuencia que codifica para el sitio de reconocimiento para la Plp.
d) ¿Cómo habrían dado los Westerns si el modelo correcto fuera el otro?
e) ¿Por qué se observa actividad de β-galactosidasa en las células transfectadas si no se
adicionó al cultivo ni lactosa ni IPTG? Justifique demostrando que sabe el tema "operón lac".
f) ¿Alguna de las 3 proteínas (PP, Pex5, Pex13) podría estar glicosilada en asparagina?
Justifique.
g) ¿En qué aspectos la translocación de proteínas al peroxisoma resulta semejante a
i) a translocación al REG de las proteínas de secreción?
ii) la importación de proteínas por la mitocondria?
iii) el transporte de proteínas al núcleo?
Compárelas considerando los siguientes parámetros:
- caracter post o co-traduccional
- etiqueta
- receptor soluble de la etiqueta
- receptor de membrana del anterior
- canal hidrofílico
- estado de plegamiento de la proteína durante el pasaje
- necesidad de chaperonas para el pasaje
h) La función de los peroxisomas es proveer de enzimas oxidasas y catalasa que oxidan
compuestos orgánicos que pudieran resultar tóxicos para la célula, tornándolos inactivos.
Estas reacciones de oxidación consumen oxígeno. No obstante, las células provenientes de
pacientes de enfermedad de Zellweger consumen oxígeno normalmente. ¿Cómo se
explica? ¿Qué función cumpliría ese consumo de oxígeno?
79
IBMC 2011
CÉLULA II
A) GUÍA DE ESTUDIO
CITOESQUELETO
1) Describa los tres componentes del citoesqueleto incluyendo: monómeros que los
componen, estructura, tamaño, localización, polaridad y orientación (si la tienen).
5) ¿Cuáles de los componentes del citoesqueleto son estables y cuáles dinámicos? Describa
los distintos procesos celulares en los cuales intervienen los dinámicos.
7) ¿Qué función cumplen las proteínas motor dineína y kinesina? ¿Con qué componentes
del citoesqueleto interaccionan?
8) ¿Qué tipo de microtúbulos participan en la división celular y qué papel que cumple cada
uno? ¿Cuáles son los distintos modelos postulados sobre el papel de los microtúbulos en la
segregación de los cromosomas?
12) ¿Qué tipo de moléculas forman la lámina nuclear? ¿Qué ocurre con la lámina nuclear
durante la mitosis?
13) Describa los distintos tipos de uniones célula-célula y célula-matriz extracelular. ¿Con
qué elementos del citoesqueleto interaccionan?
CICLO CELULAR
80
IBMC 2011
8) ¿Cuáles son las distintas fases del ciclo celular y qué procesos ocurren en cada una de
ellas?
10) ¿Qué tipos de moléculas regulan los puntos de control de las transiciones entre una fase
y la siguiente y cómo se regula su actividad?
11) ¿Qué significa que el ciclo celular sea unidireccional? ¿Cómo se logra?
NEURONAS
1) ¿Que célula es considerada la unidad celular del tejido nervioso? ¿En qué diferencias
estructurales se basan la hipótesis reticular y la hipótesis neuronal de la estructura del
sistema nervioso? ¿Qué desarrollo tecnológico permitió saldar la disputa entre estas dos
hipótesis (Golgi vs Cajal)?
2) ¿Cuáles son los mecanismos de comunicación entre las diferentes partes de una
neurona cuyo cuerpo se encuentra a metros de su terminal sináptica? ¿Qué función
cumple cada uno?
3) Dibuje los elementos básicos que definen una sinapsis química y una sinapsis eléctrica.
4) El Dr. Eduardo De Robertis (1913-1988) descubrió en nuestro país las vesículas sinápticas.
¿Qué contienen? ¿Cómo y hacia dónde vierten su contenido? ¿Cuál es el receptor de ese
contenido? ¿Cuál es el destino de la vesícula sináptica una vez que vertió su contenido?
¿Cuál es el destino del contenido?
5) ¿Qué significa activar un canal? ¿Qué diferencia fundamental existe entre la estructura
molecular de un canal voltaje-dependiente y uno ligando-dependiente? ¿Dónde se ubica
cada uno de estos tipos en una neurona?
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IBMC 2011
B) PROBLEMAS
CITOESQUELETO
PROBLEMA 1
La figura muestra una fotografía de microscopía electrónica de un corte transversal de un
flagelo eucariota.
a) Asigne los siguientes componentes a las posiciones indicadas por números en la figura.
Túbulo "A" Vaina interna
Túbulo "B" Nexina
Brazo externo de dineína Radio
Brazo interno de dineína Microtúbulo único
b) ¿Cuáles de las estructuras mencionadas están compuestas por tubulina?
c) ¿Cuáles de las estructuras son continuas con componentes del cuerpo basal o
blefaroplasto?
d) Mutaciones en los genes que codifican para las dineínas causan esterilidad masculina
porque los flagelos de los espermatozoides no se mueven. ¿Por qué estos pacientes
presentan también trastornos en las vías respiratorias tales como congestiones bronquiales?
e) ¿Por qué el tratamiento de un hombre con cáncer con taxol, una droga que estabiliza los
microtúbulos polimerizados, inhibe la proliferación de las células cancerosas y disminuye la
cantidad de espermatozoides producidos por los testículos pero no afecta la motilidad de
los mismos? Justifique cada uno de los 3 casos.
PROBLEMA 2
El movimiento ondulatorio de un flagelo eucariota se produce porque éste se curva en
ciertas regiones y esa curvatura se va corriendo a lo largo del flagelo, según se ilustra en la
Figura 1.
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IBMC 2011
b) Las moléculas elásticas de nexina que unen dobletes adyacentes deben estirarse para
acomodar la curvatura del flagelo hasta un semicírculo. Si el largo de una banda de nexina
no estirada situada en la base del flagelo es de 30 nm. ¿cuál es el largo de la banda de
nexina estirada situada en la punta del flagelo?
c) ¿Qué ocurriría con los dobletes adyacentes de la figura si se destruyeran las bandas de
nexina y los radios por un tratamiento suave con proteasas, que no destruye a los
microtúbulos de tubulina?
Datos:
- perímetro del círculo: p = 2.π.r (r: radio)
- teorema de Pitágoras: a²+b² = c² (a y b son los catetos y c es la hipotenusa)
PROBLEMA 3
Los microtúbulos del cinetocoro, que unen a los centrosomas con los cinetocoros, guían a
los cromosomas hacia los polos de la célula durante la mitosis. De cada centrosoma sale
también, en forma radial, un conjunto de microtúbulos que no se enganchan a
cromosomas, llamados microtúbulos del áster. Se realizó el siguiente experimento in vitro:
Centrosomas aislados fueron incubados con tubulina soluble (monomérica) para iniciar el
crecimiento de microtúbulos y posteriormente se agregaron cromosomas aislados. Los
cromosomas se unieron espontáneamente a los extremos libres de los microtúbulos, como
se ilustra en la figura. Los complejos fueron luego diluidos a una concentración muy baja de
tubulina soluble y fueron observados nuevamente. Como se ve, sólo los microtúbulos del
cinetocoro resultaron resistentes a la dilución.
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IBMC 2011
a) ¿Por qué piensa Ud. que los microtúbulos del cinetocoro son más estables que los del
áster?
b) De todos modos, los microtúbulos del cinetocoro no son 100% estables en una célula.
¿Cuál es la evidencia para esta afirmación?
c) Explique el mecanismo de la desaparición de los microtúbulos del áster luego de la
dilución. ¿Se despegan del centrosoma; se despolimerizan de un extremo o se desintegran
al azar en varios puntos a lo largo de su longitud?
PROBLEMA 4
En la figura se grafica la velocidad de crecimiento para los dos extremos (+ y -) de
microfilamentos de actina en función de la concentración de actina globular soluble.
PROBLEMA 5
La doble membrana nuclear está sostenida, desde el lado nuclear, por una malla fibrosa de
laminas llamada lámina nuclear. Las laminas son 3 tipos de proteínas (lamina A, lamina B y
lamina C) que forman filamentos intermedios. Cuando las células entran en mitosis, la
lámina nuclear se desarma y la membrana nuclear se desintegra. El armado y desarmado
de la lámina nuclear está controlado por la fosforilación reversible y regulada de las
laminas. Para investigar el rol de la fosforilación Ud. marca células con un aminoácido
radiactivo y luego purifica las laminas tanto de células que están en mitosis como de células
en interfase. Después somete las laminas purificadas a electroforesis bidimensional en geles
de poliacrilamida.
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Nota: Ojo!, no confundir los términos lamina (proteína) con lámina (estructura nuclear
formada por laminas) y mucho menos con laminina (otra proteína no emparentada con las
laminas que forma parte de la matriz extracelular de muchas células).
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CICLO CELULAR
PROBLEMA 6
Critique las siguientes afirmaciones y justifique.
a) El ciclo celular se divide en varias fases, las cuales están marcadas en el diagrama. De
todas ellas, la más rica en eventos regulatorios conocidos es “G1”.
PROBLEMA 7
Una gran parte del conocimiento actual sobre el funcionamiento del ciclo celular ha sido
conseguida gracias a estudios realizados con levaduras que tienen mutados genes
esenciales para que el ciclo prosiga. Cuando uno de esos genes está mutado las levaduras
son incapaces de dividirse y eso se considera evidencia de que esos genes codifican para
proteínas de importancia para la progresión del ciclo. Este concepto, si bien ha resultado
sumamente útil plantea una paradoja: Si esas cepas mutantes no pueden dividirse, las
colonias de levaduras no pueden crecer. ¿Cómo es que existen entonces estas levaduras?
¿Cómo se hace para poder propagarlas?
PROBLEMA 8
Las proteínas quinasas agregan un grupo fosfato a sus proteínas blanco, acción que se
denomina “fosforilar” en la jerga de los laboratorios de biología molecular. Estas se dividen
en serín/treonín quinasas y tirosín quinasas dependiendo del tipo de aminoácido al cual
fosforilen. El Factor Promotor de la Mitosis (MPF) es una proteína dimérica compuesta por
una ciclina (ciclina B) y una Cdk o “quinasa dependiente de ciclinas” que se llama Cdc2, y
es del tipo serín/treonín quinasa.
Además del control de la actividad quinasa de las Cdks dado por la aparición y
desaparición periódica de las ciclinas, existe un nivel adicional de control dado por un
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Un aminoácido crítico de Cdc2 es el #15, tirosina, abreviado como Y15, el cual es fosforilado
por la quinasa de tirosinas Wee1 y defosforilado por la fosfatasa de tirosinas Cdc25. El
balance entre las actividades de estas dos proteínas determina el estado de fosforilación
de Y15 en Cdc2. Cuando Wee1 está más activa que Cdc25, Y15 queda fosforilada y por lo
tanto MPF resulta inactivo. En el caso inverso, Y15 queda desfosforilada y MPF se muestra
activo.
Las actividades regulatorias varias de MPF y sus proteínas asociadas se estudian en extractos
de ovocitos de rana. En esos extractos, la quinasa Wee1 está activa y la fosfatasa Cdc25
está inactiva.
Como dato adicional de la complejidad del sistema sabemos que, así como la actividad de
MPF es regulada por fosforilación, también lo es a su vez la actividad de Cdc25.
El ácido okadaico (OA) es un potente inhibidor de las fosfatasas del tipo serina/treonina. El
agregado de OA es usado comúnmente como método para lograr una rápida activación
de MPF.
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PROBLEMA 9
La duración del ciclo celular puede variar mucho de acuerdo al entorno en el que se
encuentra un tipo celular determinado a expensas de la duración de cada una de las
distintas fases, excepto de la M, que es bastante constante y de aproximadamente 1 hora.
Para medir la duración del ciclo celular de los hepatocitos que forman parte del hígado de
un ratón adulto, se prepararon cortes de hígado y se los tiñó con un colorante para que las
células en mitosis resulten fácilmente reconocibles al microscopio. Habiendo observado
25.000 células en total, se encontraron solamente 3 células en mitosis.
a) Calcule la duración del ciclo celular de los hepatocitos en el hígado de un ratón adulto.
b) En base a las Figuras 1 y 2 calcule la duración total del ciclo celular y de la fase G2 de los
hepatocitos en cultivo.
c) Con los datos anteriores y del enunciado, y sabiendo que el período S dura 6 horas,
¿cuánto dura G1?
d) Si la velocidad de avance de la DNA polimerasa en la fase S es siempre 2 kpb/minuto y el
tamaño del genoma de ratón es 3x109 pb, ¿en cuánto tiempo se terminaría de replicar todo
el genoma? ¿Es consistente el resultado de este cálculo con las respuestas anteriores?
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NEURONAS
PROBLEMA 10
El Prof. John Z. Young (Premio Nobel de Medicina) descubrió que ciertas especies de
calamares (Loligo) poseen un axón gigante (del diámetro de un spaghetti y de varios
centímetros de longitud. El Prof. Rodolfo Llinás utilizó esta preparación para estudiar la
importancia del axoplasma y sus elementos (iones, proteínas, etc.) en la generación del
impulso nervioso. Con un rodillo extrajo todo el axoplasma e insertando una cánula en el
mismo permitió rellenarlo con distintas soluciones.
a)¿Cuál de las siguientes soluciones cree Ud. que reemplazará más fielmente al axoplasma?
- Solución A: NaCl 440 mM, KCl 5 mM, CaCl2 0,001 mM
- Solución B: albumina 1g/litro, NaCl 440 mM, KCl 5 mM, CaCl2 0,001 mM
- Solución C: KCl 440 mM, NaCl 5 mM, CaCl2 0,1 mM
b) ¿Permitirá la solución que Ud. eligió generar un potencial de acción?
c) Si agregamos a la solución exterior saxitoxina (toxina que producen los dinoflagelados
durante los episodios de marea roja y que bloquea el canal de Na+ especificamente), ¿se
podrá generar un potencial de acción? ¿Se producirán cambios muy significativos en el
potencial de membrana?
Preguntas:
a) ¿Qué efectos tendrá la colchicina, un alcaloide que afecta el equilibrio dinámico
tubulina/microtúbulos, sobre la secreción de proteínas en el botón axonal? Justifique.
b) La secreción requiere ATP in situ (en el lugar), lo cual es coherente con el hecho de que
las mitocondrias también viajen por la misma vía hasta el terminal axonal (a una velocidad
aproximada de 1 metro por día!). No obstante, el ATP también es requerido a lo largo de
todo el axón. ¿Para qué?
c) La enfermedad hereditaria de “Charcot*-Marie-Tooth” es una neuropatía causada por la
mutación del gen de la kinesina KIF1B que impide a esta proteína unir ATP. El síntoma más
notorio de esta enfermedad es debilidad muscular. ¿Cuál es el mecanismo molecular de la
enfermedad?
* Nota histórica: Jean-Martin Charcot (1825-1893) fue un famoso neurólogo francés que fue
maestro de Sigmund Freud durante su visita al hospital “La Salpetrière” de París.
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Los animales alternamos períodos de vigilia (estar despiertos) con períodos de sueño (estar
dormidos). Poco se sabía de los eventos moleculares que determinan el pasaje de la vigilia
al sueño y viceversa, hasta que se descubrió una proteína, llamada orexina (hipocretina),
que es fabricada por algunas neuronas (llamadas aquí neuronas de tipo I) de una región
del cerebro llamada hipotálamo. La orexina es sintetizada en el retículo endoplasmático
rugoso y empaquetada en vesículas de transporte que viajan, mediante una proteína
motor, por los microtúbulos maduros (o estables) de los axones de las neuronas de tipo I
hacia sus terminales nerviosas donde es secretada por exocitosis. La orexina secretada
difunde por la sinapsis hasta encontrarse con la membrana de neuronas de tipo II, donde
interactúa con un receptor específico constituido por una proteína integral de siete pasos
de membrana. La unión de la orexina a su receptor produce una serie de efectos biológicos
que incluyen promover la vigilia y el apetito.
Existe una enfermedad en los humanos llamada narcolepsia en la cual los pacientes tienen
somnolencia diurna y sufren ataques repentinos de sueño, desplomándose de golpe por
falta de tono muscular. Esta enfermedad ha sido muy estudiada en perros. Existen
dobermans y “salchichas” alterados genéticamente que sufren narcolepsia. Se los puede
observar jugueteando activamente hasta que de repente caen dormidos por unos 30 a 60
segundos, sin tono muscular alguno, luego de lo cual despiertan de golpe y siguen jugando
por unos minutos antes de repetir el ciclo. En 1999 se descubrió que los perros narcolépticos
tienen mutado el gen del receptor de orexina. Al poco tiempo se encontró que algunos
humanos narcolépticos tienen destruidas las neuronas de tipo I, mientras que otros tienen
mutado el gen de la orexina. Como prueba experimental de estas observaciones, se
hicieron ratones knock out para el gen de la orexina, los cuales nacieron y crecieron
normalmente pero presentaron narcolepsia y además comían menos que los normales. Si
quiere ver filmaciones reales de dobermans, humanos y ratones narcolépticos, baje archivos
de la siguiente dirección de web:
http://med.stanford.edu/school/Psychiatry/narcolepsy/moviedog.html
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IBMC 2011
Preguntas:
a) ¿Cuáles de las siguientes mutaciones en el gen de orexina causarán narcolepsia?
Justifique indicando los destinos celulares de las proteínas mutadas.
i) Deleción del péptido señal “start transfer”, sin alterar el resto del marco de lectura.
ii) Introducción de una secuencia de aminoácidos básicos (localización nuclear,) sin
alterar el marco de lectura ni el plegamiento del resto de la proteína.
iii) Cambio de un aminoácido por otro que provoca un mal plegamiento irreversible de la
proteína.
iv) Introducción de una secuencia SKL (de entrada a peroxisoma) en el extremo C-
terminal, sin alterar el marco de lectura ni el plegamiento del resto de la proteína.
v) Deleción de la secuencia de reconocimiento para la peptidasa de la señal, sin alterar
el resto del marco de lectura.
b) El taxol es una droga usada frecuentemente en quimioterapia del cáncer, cuyo
mecanismo de acción consiste en inhibir el equilibrio polimerización/despolimerización de
los microtúbulos de tubulina. Sabiendo que ni las neuronas de tipo I ni las de tipo II se dividen
en el adulto, pero que los microtúbulos son imprescindibles para la llegada de las vesículas
con orexina a los terminales nerviosos, ¿producirá el tratamiento con taxol trastornos en el
sueño en los pacientes? Justifique.
c) ¿Cómo se definen el extremo (+) y el extremo (–) del microtúbulo de tubulina?
d) El receptor de orexina (7 pasos de membrana) es una glicoproteína.
i) ¿Con qué tratamientos se lo podrá solubilizar? Justifique.
ii) ¿Por qué a pesar de ser una glicoproteína no se dirige a los lisosomas?
iii) Su secuencia aminoacídica presenta 3 sitios de N-glicosilación (Asn-X-Ser): uno de ellos
se encuentra en uno de los segmentos transmembrana, otro en uno de los dominios
extracelulares y el tercero, en uno de los dominios intracelulares. Sólo uno de los 3 está
glicosilado, ¿cuál y por qué?
e) (Pregunta extra con conceptos de metabolismo)
La termogenina es una proteína que se integra a la membrana interna mitocondrial y actúa
como desacoplante. Tanto la sobreexpresión de termogenina como la falta de oxígeno
(anoxia) producidas en neuronas de tipo I de ratones normales reducen los niveles de ATP
sin matar a las células. Explique las diferencias entre los mecanismos de acción de la
termogenina y la anoxia; y por qué ambos eventos causan narcolepsia a pesar de no matar
a las neuronas de tipo I. Justifique.
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INMUNOLOGÍA
A) GUÍA DE ESTUDIO
3) ¿Dónde se producen las células precursoras de las células blancas? ¿Dónde maduran los
linfocitos? ¿En qué órganos se pueden encontrar linfocitos?
4) Explicar las diferencias entre una respuesta inmune humoral y una respuesta inmune
celular: ¿Qué se produce, contra qué reaccionan estos productos y como se destruye el
antígeno en cada respuesta?
5) ¿Cómo se explica que un organismo sea capaz de producir anticuerpos contra una
sustancia sintética que no existe en la naturaleza?
6) ¿Qué hecho determina que un determinado clon de linfocitos sea seleccionado para
multiplicarse y madurar?
7) ¿Por qué la segunda exposición a un antígeno suele provocar una respuesta inmune más
rápida e intensa que la primera?
8) ¿Por qué un mismo animal no fabrica anticuerpos contra sus propias macromoléculas?
12) ¿Qué son las regiones constantes, la región variable y la región hipervariable de una
inmunoglobulina?
13) ¿Cómo se explica que un ser humano sea capaz de producir más moléculas diferentes
de anticuerpos que las que podrían ser codificadas por todo el ADN de su genoma?
14) ¿Por qué son variables las zonas variables de cada cadena? ¿Qué otros factores
aumentan la diversidad de los anticuerpos? ¿Cuántos anticuerpos diferentes son
producidos por un único linfocito B?
15) ¿Qué determina que se produzca el cambio de clase del anticuerpo secretado por la
misma célula plasmática?
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IBMC 2011
18) Explique por qué una célula infectada con un virus se convierte en un blanco del
sistema inmune.
19) ¿En qué células se encuentran los antígenos de MHC de tipo I? ¿Qué tipos de células
reconocen?
20) ¿En qué células se encuentran los antígenos de MHC de tipo II? ¿Qué tipos de células
reconocen?
21) ¿Cómo presentan las células B y los macrófagos los antígenos provenientes del exterior a
las células T?
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IBMC 2011
B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
La iguana voladora de la isla de Krakatoa poseía en su saliva una exótica proteína, la
krakatoína, que inyectada en una persona, tenía como único efecto matar a aquellos
linfocitos B que se unieran por sus receptores a la krakatoína. En 1987, el profesor Vulkan
descubrió que si la saliva de las iguanas voladoras era hervida antes de ser inyectada, la
persona podía producir anticuerpos contra la Krakatoína y quedaba vacunada por un
tiempo contra la mordedura de la iguana voladora. Los estudios del Prof. Vulkan fueron
interrumpidos por la famosa erupción volcánica que destruyó la isla y extinguió
completamente a las iguanas y al Prof. Vulkan, por lo que quedaron pendientes las
siguientes cuestiones:
a) ¿Era letal la mordedura de la iguana?
b) ¿Quedaban vacunadas contra la krakatoína aquellas personas mordidas por iguanas
vivas que, se entiende, no habían sido hervidas previamente?
c) ¿Podían ser vacunadas con krakatoína hervida aquellas personas que previamente
habían sido mordidas por iguanas voladoras?
d) ¿Habían perdido muchos linfocitos B por acción de la krakatoína las personas mordidas?
PROBLEMA 2
Se sabe que existe un solo par de alelos para la inmunoglobulina M (IgM) por célula. Hay
dos formas de IgM, la de membrana y la secretada, las cuales difieren en las regiones C-
terminales de sus cadenas pesadas. La IgM de membrana tiene una secuencia hidrofóbica
de transmembrana (o anclaje) que no está presente en la forma secretada. Ud. dispone de
un oligonucleótido sintético correspondiente a la secuencia de anclaje, como así también
de un anticuerpo monoclonal que sólo reconoce dicha secuencia aminoacídica. Con estas
dos herramientas moleculares, Ud. analiza DNA, RNA y proteínas de dos tipos celulares:
linfocitos B inmaduros (LB) y plasmocitos (PL).
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PROBLEMA 3
Ud. entra a trabajar a un laboratorio de inmunología como becario y su director le pide que
realice 3 experimentos de "Western". La idea es confirmar, para cada uno de 8 cultivos
celulares (del A al H), de qué tipo celular se trata: linfocitos B (inmaduros, maduros o de
memoria), precursores de linfocitos B o plasmocitos.
Cada "Western" fue revelado con un anticuerpo específico diferente según muestra la
figura:
a) Complete la siguiente tabla con los resultados de los experimentos de “Western” indicando a
qué tipo celular corresponde cada cultivo y qué función o tipo de respuesta realiza.
Se realizó un cuarto “Western” que fue revelado con un anticuerpo anti Vh del clon X. Los
resultados se muestran en la siguiente figura:
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PROBLEMA 4
Hace algunos años (Nature 415: 1035, 2002), Hochenlinger y Jaenisch generaron un ratón
clonado por transferencia de un núcleo de un linfocito B ya exitosamente rearreglado (de
aquí en más llamado donante) a un cigoto al cual se le había destruido su propio núcleo.
Preguntas:
a) ¿Qué quiere decir que una respuesta B humoral a una infección es policlonal? Responda
brevemente. La respuesta a esta pregunta le ayudará a seguir adelante con el problema.
b) Todos los linfocitos B del ratón clonado resultaron monoclonales. ¿Qué significa esta
afirmación?
c) Para comprobar la afirmación anterior, los investigadores hicieron 100 Northern blots de
RNAs obtenidos de 100 linfocitos B maduros individualmente obtenidos de ganglios del
animal. ¿Cuál de las siguientes sondas fue la que se usó en la hibridación del Northern que
permitió concluir que todos los linfocitos B del ratón clonado eran monoclonales? Justifique.
Segmentos de DNA correspondientes a:
i) un rearreglo VDJ (de cadena pesada), distinto del arreglo del linfocito B donante.
ii) el rearreglo VDJ (de cadena pesada) del linfocito B donante.
iii) la porción constante mu (Cµ) de cadena pesada del linfocito B donante.
iv) la porción constante delta (Cδ) de cadena pesada del linfocito B donante.
Los investigadores encontraron que la cantidad de linfocitos en sangre del animal clonado
es normal y que entre los anticuerpos secretados había de diferentes clases incluyendo del
tipo IgM, de lo cual concluyeron que la célula B donante original no había sufrido aún
“switch de clase”.
e) ¿Es correcta esta afirmación? Justifique.
f) ¿Qué habría concluido respecto a la célula B donante si sólo hubieran encontrado IgA?
¿Es posible obtener sólo IgA?
g) ¿Cómo serán en cuanto a su variabilidad los receptores de células T (TCR) de los linfocitos
T de este ratón, monoclonales o policlonales?
Finalmente hicieron también otro ratón clonado por transferencia nuclear a partir de un
linfocito T ya exitosamente rearreglado, con resultados similares en cuanto a la
monoclonalidad de las células maduras del ratón en los linajes celulares correspondientes.
h) ¿Cuál/es de los dos animales (clonado a partir de célula B o clonado a partir de célula T)
será capaz de:
i) Generar una respuesta inmunológica a un transplante de órgano o tejido heterólogo.
Justifique.
ii) Generar una respuesta humoral a la inyección de un antígeno.
PROBLEMA 5
Tomando en cuenta el esquema del DNA que codifica para las cadenas pesadas (H) de los
anticuerpos que se muestra en la Figura 1 y la curva de respuesta de un animal de
experimentación a la inyección de un antígeno "X" que se ilustra en la Figura 2:
a) Dibuje:
i) Un esquema de los mRNAs más abundantes de las cadenas H de los linfocitos B (B1,
B2, B3 y B4) que respondan al antígeno "X", indicados en la Figura 2.
ii) Un esquema donde muestre las proteínas correspondientes a los mRNAs B2 y B3,
dibujándolas con la célula que las produce.
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b) Diga qué otras células y proteínas participan en el paso de B1 a B2. Use esquemas y
justifique.
c) En el tiempo que se indica en la Figura 2, se inyecta otro antígeno diferente, "Y", que es la
primera vez que se inyecta en el organismo en estudio. Dibuje:
i) La curva de respuesta al antígeno "Y" en el mismo gráfico de la Figura 2.
ii) Un esquema del mRNA de cadena H de las células que responderán al antígeno "Y",
pre- y post respuesta al mismo.
PROBLEMA 6
Para estudiar la colaboración entre distintos tipos de linfocitos en la generación de la
respuesta inmune, se obtuvieron linfocitos B, T, y macrófagos de un hombre inmunizado con
la toxina del tétano inactivada (TOXT). Los linfocitos fueron cultivados in vitro durante varios
días en presencia de TOXT e interleuquina 2 para producir clones B y T específicos para
TOXT.
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Se hizo el siguiente experimento con un clon B, un clon T y los macrófagos: las células del
clon B o los macrófagos fueron incubadas con diferentes sustancias, luego lavadas para
eliminar su exceso y finalmente enfrentadas con células de un clon T. Al cabo de 2 días se
observó si había o no proliferación de las células T.
Lavado de células
3 Mφ Anti-hIg TOXT Si +++++
Aclaraciones:
Anti-hIg: anticuerpo anti-inmunoglobulinas humanas
TOXT desnat.: TOXT desnaturalizada por calor
DNP: dinitrofenol (desacoplante)
Preguntas:
a) Analice detalladamente los resultados de cada uno de los diez tratamientos. En su
análisis debe responder a las siguientes preguntas:
i) ¿Cuál es el antígeno en este sistema?
ii) ¿Qué tienen en su membrana los linfocitos B?
iii) ¿Por qué en algunos casos hay proliferación de los linfocitos T y en otros no?
iv) ¿Cuál es el efecto y cómo actúan el Anti-hIg, la cloroquina y el DNP?
b) Haga un dibujo sencillo que muestre la cooperación entre un linfocito B y un linfocito T
específicos para TOXT.
c) ¿Son los macrófagos capaces de presentar antígeno a las células T?
d) ¿Por qué el Anti-hIg y la TOXT desnaturalizada se comportan distinto cuando se usan
macrófagos que cuando se usan linfocitos B?
e) Se sabe que la inmunidad que los humanos desarrollan contra el tétano es de tipo
humoral, y que la TOXT desnaturalizada puede usarse como vacuna contra el tétano. In
vivo, ¿participan clones B iguales al utilizado en el experimento in vitro, en la respuesta
inmune generada por dicha vacuna?
PROBLEMA 7
Un polipéptido "N" es clivado in vitro en cuatro péptidos/epitopes (X,W,Y,Z) que presentan
capacidad antigénica. La mezcla resultante es pasada por una columna de afinidad que
tiene anticuerpos anti-X unidos covalentemente a sefarosa. Lo que NO queda retenido en la
columna (llamado aquí el "eluido") es utilizado en los siguientes experimentos:
a) Se utiliza el "eluido" para estimular un cultivo de linfocitos totales sin macrófagos.
i) ¿Se producirán anticuerpos anti-W en estos cultivos? Tanto en caso de respuesta
afirmativa como negativa, justifique con un esquema de las células participantes que
ilustre su respuesta por el sí o por el no.
ii) ¿Se producirán anticuerpos anti-X en estos cultivos?
b) Se utiliza el "eluido" para estimular un cultivo de linfocitos totales con macrófagos donde a
los macrófagos se les han eliminado todos los receptores de membrana excepto las
moléculas MHCII y los receptores Toll. ¿Se producirá IL-1 e IL-2 en estos cultivos?
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IBMC 2011
c) Se utiliza el "eluido" para estimular un cultivo de linfocitos totales sin macrófagos donde a
los linfocitos B se les han "afeitado" los receptores de membrana. ¿Se producirá IL-2 en estos
cultivos?
d) Se utiliza el "eluido" para estimular un cultivo de linfocitos totales con macrófagos
normales donde a los linfocitos B se les han "afeitado" los receptores de membrana. ¿Se
producirán anticuerpos en estos cultivos?
e) Se inyecta el "eluido" en ratones que habían sido previamente vacunados con el péptido
"N". ¿Habrá producción de anticuerpos predominantemente del tipo IgG contra el péptido
"N"?
PROBLEMA 8
Los ratones de la cepa CH3, que son resistentes a la infección con el parásito protozoario
Leishmania, desarrollan una respuesta mediada por linfocitos T helper 1 (TH1) después de la
infección, mientras que los ratones de la cepa BALB/c hacen una respuesta mediada por
linfocitos T helper 2 (TH2) y son más susceptibles a la infección (es decir que están menos
protegidos).
Si se hace una segunda exposición al antígeno (parásito), las curvas de la respuesta de
memoria son las siguientes:
Preguntas:
a) ¿En cuál de los dos casos estarán involucrados linfocitos CD4 +?
b) ¿Cuál es el tipo de anticuerpo predominante en I? ¿Cómo lo demostraría por Western
blot?
c) ¿En cuál de los dos casos se encontrará abundante cantidad de linfocitos CD8+?
d) Si después de la activación por el antígeno se realiza un Northern blot de RNA extraído de
linfocitos TH1 y TH2, ¿qué sondas utilizaría para diferenciarlos, detectando mRNAs que estén
presentes selectivamente en cada uno de ellos?
e) Los pocos anticuerpos obtenidos en II y la gran cantidad de anticuerpos obtenidos en I
¿son mono o policlonales?
f) ¿Se verán afectadas ambas cepas por la extracción del timo en su capacidad de
responder contra Leishmania? ¿En igual medida?
g) Después de la activación por el antígeno, los linfocitos CD8+ expresan en membrana un
receptor para una de las interleuquinas, el cual no está presente, por ejemplo, en los
macrófagos. ¿Cuál es la interleuquina que actúa como ligando de este receptor?
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PROBLEMA 9
Darrah et al. publicaron en Nature Medicine (13: 843, 2007) un estudio acerca del tipo de
respuesta y del tipo de células del sistema inmune que están involucrados en la inmunidad
generada por la vacunación contra Leishmania major, un parásito cuya infección afecta a
12 millones de personas en la actualidad. La vacunación consiste en la inyección en los
pacientes de un virus recombinante no inmunogénico que no enferma pero al entrar en las
células del vacunado expresa una proteína del parásito que funciona como antígeno.
Para ensayar la efectividad de la vacunación hicieron el siguiente experimento. A ratones
vacunados o no, les hicieron distintos tratamientos detallados en la figura y al cabo de dos
semanas los desafiaron mediante la inoculación de parásitos para medir la cantidad de los
mismos en los ratones después de otra semana. Obtuvieron los resultados que se muestran
en la figura.
Preguntas:
a) ¿Cómo interpreta los resultados de los puntos 1 y 2 de la figura en términos de la eficacia
de la vacunación?
b) ¿Cómo afectó a la efectividad de la vacuna el tratamiento del punto 4 en la figura?
¿Para qué hicieron el tratamiento indicado en el punto 3?
c) De acuerdo a los resultados del tratamiento del punto 4 del experimento de la figura,
i) ¿Qué célula colaboradora está actuando?
ii) ¿Qué CD estará expresando la misma?
iii) ¿Qué otra citoquina produce?
iv) ¿Es una célula de memoria?
d) i) ¿Serán las células descriptas en la pregunta c) las únicas que participan? Si considera
que hay otras, indique cuáles y con qué CD las identificaría. ¿Qué tipo de respuesta
inmune se está generando? Justifique.
ii) ¿Qué otra célula del sistema inmune innato estaría también involucrada?
e) Los investigadores aislaron de un ratón vacunado, como en el punto 1 de la figura, las
células descriptas en las preguntas c) y d) y las transfirieron a un ratón gemelo del original,
naïve (que nunca había sido expuesto a los antígenos de este parásito), y previamente
irradiado.
i) ¿Por qué los investigadores usaron para este experimento ratones gemelos, naïve e
irradiados?
ii) ¿Qué resultado obtuvieron cuando a estos ratones los desafiaron con el parásito,
como 1 ó 2 de la figura? Justifique.
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IBMC 2011
iii) ¿Qué resultado habrían obtenido si hubieran desafiado con parásitos a ratones
gemelos, naïves e irradiados pero a los que previamente no se les hubiera inyectado
las células descriptas en las preguntas c) y d)? Justifique.
PROBLEMAS OPTATIVOS
PROBLEMA 1
Se desea probar la existencia de linfocitos CD8 citotóxicos en una preparación de linfocitos
totales de un individuo A. Para ello se realiza un ensayo de citotoxicidad "in vitro" utilizando
como blanco ("target") células de un individuo Z, las cuales habían sido previamente
cargadas con 51Cr e irradiadas para inmunosuprimirlas. Se obtiene una gran respuesta
citotóxica, es decir, una gran liberación de 51Cr desde el interior de las células del individuo
Z, cuando se las incuba con los linfocitos del individuo A.
a) ¿Qué resultado esperaría si el ensayo de citotoxicidad se hubiera hecho con linfocitos del
individuo A qué pasan de largo por una columna de afinidad de anticuerpo monoclonal
anti-CD4-agarosa? ¿Por qué?
b)¿Qué resultado esperaría si al ensayo hecho en a. se le agrega IL-2 exógena? ¿Por qué?
c) ¿Qué le ocurriría al individuo Z si se lo inmunosuprime y luego se lo inyecta con:
i) la preparación de linfocitos original del individuo A?
ii) la preparación de linfocitos del individuo A que pasó de largo por la columna de
afinidad?
PROBLEMA 2
Se estudió la proliferación de linfocitos T en las siguientes condiciones in vitro:
Aclaraciones: k.o.= knock out del gen que codifica para una proteína del retículo
endoplasmático con actividad de bomba de los péptidos producidos en el proteasoma.
PROBLEMA 3
El brillante inmunólogo Dr. Leukin diseñó un experimento para evidenciar activación y
proliferación de linfocitos T. Para ello disponía de dos anticuerpos, cada uno de ellos
covalentemente unido a un marcador fluorescente de distinto color (anticuerpos
fluorescentes). Uno de los anticuerpos unido a un marcador fluorescente rojo reconocía
exclusivamente células CD4. El otro, unido a un marcador fluorescente verde, reconocía
células CD8.
Se realizó el siguiente experimento de activación y expansión clonal:
Tubo 1: Pool de linfocitos T + antígeno proteico + células presentadoras de antígeno.
Tubo 2: Pool de linfocitos T + antígeno viral + células autólogas infectadas por virus + células
presentadoras de antígeno.
Luego de realizar estas incubaciones, hizo reaccionar cada tubo con los anticuerpos
fluorescentes para detectar qué subpoblación de linfocitos T había proliferado en cada
caso. Complete el siguiente cuadro indicando el tipo de fluorescencia que Ud. hubiera
101
IBMC 2011
esperado encontrar en cada caso. Justifique su respuesta, utilice esquemas. Indique las
principales interleuquinas que intervienen en cada caso.
PROBLEMA 4
Las células foliculares de la tiroides son las que secretan la tiroxina, una pequeña molécula
yodada que regula el metabolismo energético de los mamíferos. La captación del iodo
plasmático, la síntesis y secreción de la tiroxina están bajo el control de la hormona
tirotrópica (TSH), una glicoproteína sintetizada y secretada por la hipófisis anterior.
Existe una enfermedad en que los pacientes (son casi siempre mujeres):
- Tienen una tiroides muy grande y evidencias clínicas de hiperfunción tiroidea. El perfil
bioquímico de estas pacientes es el siguiente: "La tiroxina plasmática es altísima".
- La TSH plasmática es baja (cuando se mide la concentración de moléculas de TSH por
radioinmunoensayos que utilizan tanto anticuerpos monoclonales como policlonales).
- El suero de estas pacientes tiene una molécula de las siguientes características:
- No es reconocida por los anticuerpos anti-TSH (tanto monoclonales como policlonales)
- Es capaz de estimular la captación de iodo, la síntesis de tiroxina y la secreción de la
hormona tanto cuando se la incuba in vitro con células tiroideas como cuando se la
inyecta en animales de experimentación.
- Actúa sobre el receptor de TSH: Si se incuban membranas de células foliculares
tiroideas (donde se encuentra el receptor de la TSH) con TSH marcada
radiactivamente, se puede seguir perfectamente la cinética de la interacción
hormona receptor. Pero si se preincuban las membranas tiroideas con suero de estas
pacientes, y luego se agrega TSH marcada, no se detecta adsorción de la hormona a
los receptores.
PROBLEMA 5
Ud. dispone de los siguientes anticuerpos monoclonales:
1- anti-receptor IL-2
2- anti-proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC clase I).
3- anti-receptor de BCGF (IL-4)
4- anti-proteínas del MHC clase II
Indique cuáles de estos anticuerpos bloquean:
a) la proliferación clonal de linfocitos B
b) la proliferación clonal de linfocitos CD8+
Justifique brevemente. Ayúdese con un diagrama de cooperación celular.
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CÉLULA III
A) GUÍA DE ESTUDIO
3)
A) Dibuje un corte de una mitocondria típica vista al microscopio electrónico (haga un
dibujo GRANDE). Señale y dé nombre a todas sus partes y compartimentos y ubique en su
dibujo lo siguiente: a) protones (H+) acumulados por el bombeo de la cadena respiratoria;
b) ATPasa (ATP sintetasa); c) isocitrato deshidrogenasa; d) oxidación de ácidos grasos; e)
citocromo b; f) FADH2; g) síntesis de ATP; h) cardiolipina; i) conversión de piruvato en Acetil
CoA; j) NADH+H+; k) ARN ribosomal.
7) ¿Qué ocurre con el ciclo de Krebs, la cadena respiratoria y la síntesis de ATP mitocondrial
en presencia de cianuro? ¿Y en presencia de un desacoplante como el dinitrofenol?
11) ¿Cuáles son los productos primarios de la fotosíntesis, cómo se originan y para qué son
utilizados?
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B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
¿Qué produce mayor cantidad de ATP en la respiración aerobia, una molécula de glucosa
o una de un ácido graso de 16 carbonos, sabiendo que hasta la formación de Acetil-CoA la
degradación de ácidos grasos no produce energía? Enumere (no los describa) los procesos
involucrados en la producción de ATP a partir de Acetil-CoA y los compartimentos
mitocondriales en donde ocurren.
PROBLEMA 2
La entrada de la carnitina acetiltransferasa a los peroxisomas y a las mitocondrias, tal cual
fue comentada en el problema 4 de la guía "Célula I", es inhibida por agentes
desacoplantes (dinitrofenol). El agregado de ATP revierte la inhibición de la entrada a
peroxisomas, pero no a mitocondrias. ¿Qué le indica esto sobre la naturaleza de la energía
necesaria para la translocación a cada uno de los dos destinos?
PROBLEMA 3
El factor de crecimiento epidermal (EGF) es una proteína que para cumplir su rol biológico,
es decir, estimular el crecimiento de las células animales, se une desde afuera a un receptor
específico situado en la membrana plasmática de las células blanco. Luego, el complejo
EGF-receptor es internalizado por un proceso de endocitosis mediada por receptor y
ambos, el EGF y su receptor, son degradados en el interior celular. Para estudiar este
mecanismo se realizaron distintos pretratamientos a cultivos de células hepáticas humanas,
luego se agregó EGF marcado radiactivamente y se determinó la cantidad del mismo
unido a membrana y degradado en el interior celular al cabo de 45 minutos de incubación
a 37°C. En la siguiente tabla se esquematizan los resultados.
2 cianuro 1000 0 --
4 tripsina 0 0 --
* Una vez pretratadas las células, los correspondientes reactivos fueron eliminados por
lavado antes de ensayar la unión del EGF.
** En unidades arbitrarias.
PROBLEMA 4
La figura muestra el aumento de la turbidez -que es directamente proporcional al número
de bacterias presentes- de un cultivo de E. coli a 37°C en diversas condiciones.
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PROBLEMA 5
El tubo A contiene una preparación de tilacoides intactos a la cual se le agrega ferredoxina
(purificada por separado). El tubo B contiene una preparación de mitocondrias intactas
mientras que el tubo C contiene una preparación de liposomas que incluyen
bacteriorrodopsina y ATPasa de mitocondrias de corazón bovino (igual que en el
experimento de Racker y Stockenius). Todas las preparaciones membranosas se encuentran
en una solución acuosa conteniendo Mg2+, el buffer apropiado, ADP y fosfato inorgánico.
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PROBLEMA 6
El proceso de crecimiento y maduración del ovocito ocurre casi totalmente dentro del
folículo ovárico. El ovocito se encuentra dentro de la cavidad interna del folículo (atrio)
recubierto de una capa de células especializadas, el "cumulus". La maduración nuclear se
detiene en la profase I de la meiosis hasta que las gonadotrofinas liberadas en el período
preovulatorio provocan la reanudación de la meiosis. El ovocito puede experimentar
espontáneamente este fenómeno en condiciones "in vitro". La respuesta meiótica en cultivo
puede ser evaluada morfológicamente mediante la observación microscópica de la
ruptura de la membrana nuclear, proceso conocido como ruptura de la vesícula germinal
(GVB, germinal vesicle breakdown). La evolución de este fenómeno depende de las fuentes
de energía disponibles. Con motivo de evaluar la fuente de energía utilizada por los
ovocitos durante la maduración, se incubaron ovocitos desnudados (es decir, separados de
las células del cumulus mediante una digestión con hialuronidasa). La Figura 1 muestra las
curvas obtenidas al graficar las respuestas observadas (% de GVB) a dosis crecientes de
diferentes sustratos.
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Dato: El oxalacetato puede generar piruvato por una reacción enzimática independiente
de su participación en el ciclo de Krebs. Por este motivo, en presencia de oxalacetato
siempre hay piruvato suficiente como para generar la Acetil-CoA necesaria para el ciclo de
Krebs.
Preguntas:
a) ¿Qué infiere de la falta de respuesta en presencia de glucosa o lactato?
b) ¿Qué indican los resultados obtenidos en presencia de piruvato y oxalacetato?
Ud. cuenta con dos inhibidores del ciclo de los ácidos tricarboxílicos: malonato y
fluoroacetato. El malonato bloquea la acción de la succinato deshidrogenasa, mientras
que el fluoroacetato inhibe la conversión de citrato en isocitrato.
c) ¿Qué experimento realizaría para comprobar la hipótesis deducida de la Figura 1?
Grafique y explique los resultados que espera obtener.
Con el objeto de averiguar el origen del piruvato utilizado como sustrato por los ovocitos
desnudados, Dows y col. cultivaron ovocitos desnudados; complejos cumulus-ovocitos (tal
cual son extraídos del ovario) y un co-cultivo de células del cumulus y ovocitos desnudados.
Los cultivos fueron realizados en medio con glucosa en presencia y ausencia de un inhibidor
de la glucólisis, el iodoacetato. La Figura 2 muestra los % GVB obtenidos en cada caso.
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PROBLEMA 7
La levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) es un hongo unicelular que puede
crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno (es aerobio facultativo). En
ausencia del mismo produce CO2 y etanol.
Se tienen dos cultivos de levaduras:
A) En medio mínimo con glucosa en presencia de O2.
B) En medio mínimo con glucosa en ausencia de O2.
b) Explique y justifique qué sucedería en los cultivos A y B para los ítems I a IV al agregar:
i) un agente desacoplante como el dinitrofenol (DNP).
ii) un inhibidor del transporte de electrones como el cianuro.
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PROBLEMA 1
El citocromo b2 es una proteína soluble de 481 aminoácidos, de la cadena respiratoria de
las mitocondrias de levaduras, localizada en el espacio intermembrana. Está codificada por
un gen nuclear y llega a su destino final por translocación post-traduccional. En su región
amino-terminal, el precursor del citocromo b2 (561 aa) posee dos secuencias que le marcan
el camino a seguir: la secuencia de importación (S.I.), de 31 aminoácidos, con carga neta
positiva, seguida de la secuencia de exportación (S.E.), de 49 aminoácidos, de naturaleza
hidrofóbica.
Preguntas:
a) ¿En qué ribosomas se sintetiza el precursor del citocromo b2?
b) ¿A qué grupo de proteínas pertenece hsp60?
c) Describa el camino y el destino preciso (compartimento, unión o no a membrana, etc.)
que tendría el citocromo b2 (o sus precursores) en cada una de las siguientes alteraciones:
i) Se ha mutado el sitio de reconocimiento de la peptidasa del espacio intermembrana.
ii) Con S.I. / sin S.E.
iii) Sin S.I. / sin S.E.
iv) S.I y S.E. han sido reemplazados por un "péptido señal" de inserción clásico.
v) Igual a iv), pero además se le ha agregado en su extremo C-terminal la secuencia de
entrada a peroxisomas Ser-Lys-Leu.
vi) Igual a iii), pero además se le ha agregado en su extremo C-terminal la secuencia de
entrada a peroxisomas Ser-Lys-Leu.
d) Si se agrega el desacoplante valinomicina, la fase de exportación de esta translocación
se interrumpe aún si la mitocondria tiene exceso de ATP. ¿Cómo actúa la valinomicina y
qué le indica este experimento sobre la fuerza que propulsa la translocación de proteínas a
la mitocondria?
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Existe una cepa mutante de levaduras, llamada mif4, donde el gen que codifica para la
proteína hsp60 no se expresa.
f) ¿Qué ocurre con la cadena respiratoria? ¿Qué pasa con la producción de ATP en esta
cepa, a nivel citoplásmico y mitocondrial?
g) De hecho, la mutante sobrevive y crece. ¿Cómo lo logra? ¿Cómo se reoxida su
NADH+H+?
h) Las bacterias tienen una proteína llamada GroEL, la cual tiene una secuencia
aminoacídica muy parecida a la de hsp60. In vitro, GroEL, al igual que hsp60, es capaz de
mantener desplegado al precursor del citocromo b2 de levaduras. ¿Qué le indica este
experimento sobre el origen evolutivo de las mitocondrias? ¿Cuál sería la función de GroEL
en bacterias?
PROBLEMA 2
La bacteria Escherichia coli, los espermatozoides humanos y el alga verde unicelular
Chalmydomonas se mueven en medio líquido gracias a que tienen flagelos. La estructura y
el mecanismo de movimiento de los flagelos son totalmente diferentes en procariotas
respecto de eucariotas.
Moles de ATP
Movimiento flagelar
producidos por
en presencia de glucosa
mol de glucosa
con O2 sin O2 sin O2 DNP
Agregados con O2 sin O2 DNP colchicina
sin luz sin luz sin luz + ATP
Bacteria
38 2 sí no no no no sí
Escherichia coli
Espermatozoide
36 2 sí no no no sí sí
humano
Alga verde
36 2 sí sí no no sí sí
Chlamydomonas
COLUMNA 1 2 3 4 5 6 7 8
Aclaraciones:
Las columnas 1, 2 y 5 son en oscuridad; las demás, en presencia de luz.
DNP: Dinitrofenol. Es un desacoplante.
Colchicina: droga que inhibe la polimerización de microtúbulos.
Preguntas:
a) Explique las causas de las diferencias en la cantidad de ATP producido por mol de
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PROBLEMA 3
En las bacterias, la glucólisis y el ciclo de Krebs ocurren en el protoplasma (no hay
citoplasma y núcleo), mientras que la cadena respiratoria tiene lugar en la membrana
plasmática. Se transformó Escherichia coli con un plásmido que expresa el cDNA de la
proteína “desacoplina” bajo las órdenes del promotor/operador del operón lactosa (Figura
1). La desacoplina funciona como un desacoplante de la cadena respiratoria. Para cumplir
esta función debe insertarse en la membrana.
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Preguntas:
a) Dibuje en la Figura 1 la enzima responsable de la síntesis de ATP en la fosforilación
oxidativa, respetando su forma y orientación y señale el sitio activo.
b) ¿Cuál es el equivalente topológico del espacio periplásmico en las células eucariotas?
c) En base al enunciado, tache lo que no corresponda en la siguiente tabla y justifique
todas sus respuestas para cada una de las condiciones de cultivo, todas con aereación por
agitación.
d) ¿Qué habría pasado con el movimiento del flagelo si las bacterias se hubieran cultivado
en presencia de lactosa y exceso de ATP? Justifique.
e) En otros experimentos se probaron separadamente 3 construcciones mutadas de cDNA
de “desacoplina” (Figura 2). Ninguna de ellas fue capaz de desacoplar. Explique por qué.
f) Escherichia coli habita normalmente el colon (intestino grueso) de los vertebrados. El colon
es un segmento del aparato digestivo principalmente anaerobio. En esas condiciones E. coli
realiza distintos tipos de fermentaciones, entre ellas la láctica. ¿Cuál es el valor adaptativo
de la misma?
g) ¿Por qué el balance de la respiración aerobia en bacterias es de 38 ATP producidos por
molécula de glucosa, mientras que en los eucariotas es de 36 ATP? No explique todo el
balance, simplemente diga a qué se debe la diferencia.
PROBLEMA 4
Si se incuba un cultivo de la bacteria Escherichia coli en presencia del disacárido lactosa
marcado con el isótopo radiactivo 14C en todos sus carbonos, al cabo de un tiempo, las
bacterias sintetizan grandes cantidades de ATP (lo cual les permite dividirse y crecer) y
liberan CO2 radiactivo al medio.
a) ¿Qué procesos de control genético y metabólico están ocurriendo en la bacteria para
que se produzcan las dos moléculas mencionadas?
b) Si al mismo cultivo, que aún posee un exceso de lactosa marcada radiactivamente, se le
agrega un exceso de glucosa no marcada, al cabo de un tiempo las bacterias siguen
produciendo ATP y CO2, pero éste último no es más radiactivo. ¿Por qué? ¿Qué ocurrió?
c) ¿Qué ocurrirá con la producción de ATP y de CO2 en los experimentos planteados en las
preguntas a) y b), si en cada caso se agrega un exceso del desacoplante dinitrofenol?
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IBMC 2011
A) GUÍA DE ESTUDIO
1) ¿Qué característica de las histonas hace que éstas se peguen fuertemente al ADN?
2) ¿Cuáles son las histonas presentes en el nucleosoma? ¿Cuántas moléculas de cada una
de ellas hay por nucleosoma?
4) ¿Qué ocurre con la estructura de la cromatina cuando ésta es tratada con nucleasa
(DNasa) micrococal?
10) ¿Qué es un cromosoma politénico, qué organismos los poseen y cómo se originan?
11) Dibuje las distintas fases de la mitosis y describa los principales eventos de cada una de
ellas.
12) ¿Qué son las fibras polares y las del cinetocoro? ¿Cuáles son las evidencias de que los
centríolos no son los centros organizadores del huso mitótico?
13) Defina: fenotipo, genotipo, gen dominante, gen recesivo, heterocigota, homocigota,
alelos, ligamiento genético.
14) Ud. concursa para obtener un cargo de Profesor de Biología en un colegio secundario.
En la prueba de oposición le piden que enuncie (y resuelva) tres problemas que ilustren:
a) la primera ley de Mendel
b) la segunda ley de Mendel
c) co-dominancia en grupos sanguíneos humanos A, B y O y que defina el concepto de
alelos múltiples.
15) ¿Qué son los poros nucleares? ¿Qué sustancias pueden pasar a través de los mismos?
¿Cuál es la ultraestructura de los poros?
16) Esquematice los distintos pasos que involucra el armado de los ribosomas en el nucléolo
y en el citoplasma.
17) ¿Cómo está constituida la lámina nuclear? ¿Qué factores regulan su armado y
desarmado?
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IBMC 2011
B) PROBLEMAS
PROBLEMA 1
Las histonas son proteínas cuya secuencia está muy conservada a lo largo de la evolución
(por ejemplo, la histona H4 de vaca difiere en sólo 2 de sus 102 aminoácidos con la de
arveja) ¿Qué le sugiere esta observación con respecto a un posible rol regulatorio de la
expresión genética por parte de las histonas?
PROBLEMA 2
Señale verdadero o falso. Justifique SOLO las falsas.
a) La cromatina inactiva está más empaquetada que la cromatina activa.
b) Las histonas fosforiladas se unen más fuertemente al ADN.
c) Sólo el ADN procariota se encuentra superenrollado en condiciones fisiológicas.
d) Los nucleosomas estabilizan el superenrollamiento del ADN en la cromatina.
e) Los sitios hipersensibles a la digestión con DNasa I se encuentran preferentemente en las
regiones codificantes del ADN.
f) El núcleo celular está recubierto por una envoltura nuclear doble formada por una
bicapa lipídica interna y una lámina proteica externa.
g) El movimiento de los cromosomas hacia los polos es causado por polimerización y
despolimerización de microfilamentos de actina.
h) El nucléolo es la región asociada a los genes ribosomales donde se acumula y procesa el
ARN ribosomal.
i) La lámina nuclear se desarma en el período S de la interfase.
j) Los cuerpos basales o blefaroplastos son los que realizan el trabajo mecánico que
posibilita el movimiento de cilias y flagelos.
PROBLEMA 3
¿Cuántas moléculas de ADN contiene un cromosoma de una célula eucariótica en:
a) el período G1 del ciclo celular?
b) el período G2 del ciclo celular?
c) en la profase mitótica?
d) en la metafase mitótica?
e) en la anafase mitótica?
Señale en cuál de las etapas mencionadas dicho cromosoma podría ser visto con
morfología de bastón al microscopio óptico.
PROBLEMA 4
Señale V o F y justifique:
a) En la mitosis se separan los cromosomas homólogos.
b) Los cromosomas homólogos se separan en la segunda división meiótica.
c) Los cromosomas homólogos se separan en la primera división meiótica.
d) Las cromátidas hermanas se separan en la segunda división meiótica.
e) Las cromátidas hermanas se separan en la mitosis.
f) En el crossing over intercambian material genético las cromátidas hermanas.
g) En un individuo con 2n=36, las dos células resultantes de la primera división meiótica
tienen 18 cromosomas cada una.
h) Si dos genes se encuentran ligados pero sus loci están tan alejados que la frecuencia de
recombinación entre ambos es del 50%, los cruzamientos en que se tenga en cuenta a
ambos genes seguirán la segunda ley de Mendel.
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IBMC 2011
PROBLEMA 5
Los grupos sanguíneos A, B y O están determinados por tres alelos en la población humana:
IA, IB e IO, siendo IA e IB codominantes entre sí y dominantes sobre IO.
El grupo sanguíneo Rh está determinado por un par de alelos (Rh+ dominante sobre Rh-)
ubicados en otro par de cromosomas. Una mujer de grupo B Rh+ da a luz a un bebé de
grupo A Rh-.
a) Dé todos los genotipos posibles de la madre y del niño.
b) ¿Qué tipos sanguíneos (fenotipos y genotipos) debería tener su marido para asegurar
que su esposa le ha sido fiel?
c) Si Ud. fuera un abogado representando a un esposo engañado en un juicio sobre
paternidad, involucrando los mismos hechos básicos que los descriptos más arriba, ¿qué
grupo o grupos sanguíneos debería tener su cliente para demostrar fehacientemente que
su esposa lo engañó y así ganar el juicio?
PROBLEMA 6
Un pterodáctilo (reptil volador) puede tener ojos rojos (RR o Rr) o azules (rr). En un locus
ubicado en otro par de cromosomas existe un gen que si es tt hace que los ojos sean
incoloros, mientras que si es Tt o TT hay expresión de color en los ojos (ya sea rojo o azul).
PROBLEMA 7
En el pollo, las plumas sedosas están determinadas por un gen recesivo respecto al que rige
plumas normales.
a) Si de un cruzamiento entre individuos heterocigotas para dicho gen se criasen 98 aves,
¿cuántos cabría esperar que fuesen sedosos y cuántos normales?
b) Si tuviese un pollo de plumas normales, ¿cuál sería el camino más rápido para determinar
si es homocigótico o heterocigótico?
PROBLEMA 8
Groff y Odland encontraron una variedad de pepinos cuyas flores no podían abrirse al
madurar. Sin embargo dichas flores podían ser polinizadas abriéndolas artificialmente. Los
resultados de dichos experimentos fueron:
Fenotipos de la progenie
Progenitores Flores abiertas Flores cerradas
cerrado x abierto todas ninguna
F1 x F1 145 59
cerrado x F1 81 77
Designe los símbolos para los genes involucrados e indique el genotipo de: a) los
progenitores cerrados; b) los progenitores abiertos; c) la F1.
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