Extracción de ADN

plasmídico por lisis alcalina

Eq.5
Fundamento
Se basa en las diferencias con respecto a la
forma y tiempo de desnaturalización.

El primer paso consiste en crear un ambiente

osmótico hostil para la bacteria y lograr así su
lisis y consecuente liberación del material
genético.
 Las bacterias son puestas en contacto con la
solución I de alta concentración de sales,
glucosa y EDTA (ácido etilendiamino
tetracético). Este último es un agente
quelante de calcio (el calcio es un ión
estabilizador de las membranas bacterianas).
 Posteriormente se agrega una solución
(solución II) con una alta concentración de
SDS e hidróxido de sodio: en condiciones
alcalinas (pH 11) el ADN se desnaturaliza. Sin
embargo, el ADN cromosomal al no ser tan
compacto se desnaturaliza más rápidamente
que el ADN de plásmido .
 Cuando a esta solución se le agrega acetato
de potasio (solución III), el ADN
desnaturalizado (cromosomal) forma un
agregado junto con el SDS y las proteínas
bacterianas, el cual precipita, mientras que el
ADN del plásmido se mantiene en solución.
La separación de la fracción soluble de la
insoluble se logra mediante centrifugación.
 Finalmente, el ADN del plásmido es
concentrado por precipitación con etanol.
 Debido a que este procedimiento no
garantiza una alta pureza, es posible que la
muestra final contenga trazas de ADNasas
bacterianas que se acarrean durante el
proceso de extracción. Para evitar la
degradación de las moléculas de ADN por
estas enzimas, se aconseja trabajar de forma
rápida y con soluciones a baja temperatura.
$ Eq.5