OBJETIVOS:

 Obtención de fracciones celulares a partir del hígado del pollo.

 Determinación del rendimiento y pureza de cada fracción

MATERIALES:

 Mortero
 Gasa
 Pinza de punta fina
 2 beaker de 100 mL.
 Verde de janus
 Cubetas de hielo
 Dos beakers de 50 mL.
 Buffer Tris-HCL 0.5 M
 Buffer fosfato salino pH 7.2
 10 gr. De hígado
 Colorante DAPI 100 mL
 Lysotracker 100 Ml
 Mytotracker 100 ul
 Láminas y láminillas
PROCEDIMENTO:

 Se colocó el hígado en el mortero, se aseguró de moler bien y se extrajo los

ligamentos conjuntamente con la grasa. Se realizó una pasta uniforme del hígado y
seguidamente se adicionó 20 ml de solución Tris-HCL 0.5 M. Con una gasa se filtró
en un beaker limpio.
 Se transvasó 0.5 ml del extracto a 3 tubos eppendorf y se agregó 1ml de la solución
de buffer Tris-HCL 0.5 M, se rotuló con la palabra núcleo. Se centrifugó a 2500 rpm
que duró 3 minutos.
 Se colocó el sobrenadante a 3 ependorf nuevos y se marcó con la palabra
mitocondrias. Se centrifugó el sobrenadante restante a 10000 rpm que duro 8
minutos. (El pellet qu se había quedado se denomina fracción celular y se
resuspendió en 200 ul de buffer de fosfato salino-PBS).
 Se marcó 3 tubos eppedorf con la palabra lisosomas y se vertió en esos tubos del
sobrenadante. Luego se centrifugó el sobrenadante a 12000 rpm que duro 15
minutos( El pellet que se nos había quedado es la fracción mitocondrial y se
resuspendio en 200 ul de PBS).
 Se observó la fracción nuclear. Para ello se colocó 50 ul del resuspendido del tubo
marcado como núcleo en una lámina porta objeto y le adicionamos 50 ul de
colorante DAPI, se dejó reposar por 10 minutos aproximadamente.
 Tomamos el tubo marcado como mitocondrias y en un ependorf de 0.5 ml del
resuspendido y 5 ul del colorante mytotracker y lo dejamos incubar por 10 minutos
aproximadamente. En el otro ependorf de 0.5ul realizamos la misma operación y
adicionamos 5 ul del colorante verde de janus.
 Tomamos el tubo marcador con lisosoma y en un ependorf de 0.5ml adicionamos
5ul del nuevo resuspendido y 5ul del colorante lusotracker dejándolo incubar por 10
minutos a 27°C . En el otro tubo de 0.5 ul realizamos la misma operación y
adicionamos del colorante rojo neutro.
 INTRODUCCIÓN

Fraccionamiento celular permite analizar en gran medida organelas, pero si se

quiere ahondar en su funcionamiento deben realizarse ensayos bioquímicos, para lo cual
generalmente el primer paso es obtener fracciones enriquecidas en los distintos
organelos. La obtención de esta fracción puede dividirse en dos partes denominadas
homogeneización y centrifugado.
La homogeneización consiste en disgregar los tejidos en las células que los
componen y luego realizar la lisis de las células, de tal modo que se liberen sus
componentes, en particular sus organelos, sin que estos sufran mayores daños.
Una vez que se tienen todos los componentes celulares libres, es necesario separarlos en
fracciones, es decir, realizar su fraccionamiento. El método más utilizado para este fin es la
centrifugación diferencial. Cuando los diferentes componentes celulares se encuentran
suspendidos en un líquido, tienden a sedimentar hacia el fondo debido a la gravedad. Para
acelerar este proceso, se puede colocar el tubo conteniendo esta suspensión en un rotor
giratorio, de forma de someter a las partículas a una fuerza centrífuga. Este procedimiento
se denomina centrifugación, y el equipo especializado en el que se realiza se denomina
centrífuga. Las partículas van a moverse hacia el fondo del tubo, pero a su vez dos
fuerzas van a oponerse a este movimiento, la fuerza de fricción y la fuerza de flotación
generada por el líquido desplazado. Esta contraposición de fuerzas hace que
eventualmente cada partícula sedimente a velocidad constante.
Con el presente informe se pretende identificar las fracciones subcelulares, entre
las cuales tenemos: las mitocondrias, los núcleos y los lisosomasy que usaremos reactivos
especiales para la identificación de cada uno
Esta identificación la hemos realizado a través de la trituración de un hígado de
pollo al cual le hemos aplicado un reactivo (solución Tris-HCL 0.5 M) el cual tiene como
finalidad producir dos fases (sobrenadante y el pellet).
 DISCUSIÓN

 Después de poner las muestras en la centrifuga nos dimos cuenta que se ponen
dos fases (pellet y sobrenadante) y nos preguntamos ¿A qué se debe? Luego se
investigo acerca de esa inquietud y nos dimos la sorpresa que se debe: a la
centrifugación diferencial consiste que es lograda poniendo en suspensión de los
componentes celulares a la acción de diferentes fuerzas centrifugas resultando en
la producción de fracciones pura e impuras que pueden ser analizada en los
microscopios óptico y electrónicos.
 Usando el Verde de janus pudimos ver las mitocondrias ya que este tinte puede
teñir este tipo de muestras.
 La homogenización del hígado tubo la finalidad de que la las células sufran una
lisis y su contenido sea expulsado de la membrana plasmática, agregandole una
solución salina.
 Gracias a la centrifugación logramos separar el pellet del sobrenadante y observar
por medio de los microscopios sus estructuras. 

CONCLUSIONES

 El fraccionamiento subcelular es una técnica bioquímica utilizada para separar los

distintos orgánulos y componentes celulares para su estudio en la cual consiste en
dos partes: homogenización y centrifugado.
 El centrifugado consiste en la separación de organelas y componentes celulares
como función de los coeficientes de sedimentación.
 El pellet quedado en la muestras del experimento se denomina fracción nuclear,
mitocondrial y lisosomal.
 Gracias a la utilización del fraccionamiento celular se puede visualizar las
estructuras subcelulares en la cual necesita ciertos reactivos para su identificación.
 Tener en cuenta que la centrifugación diferencial se basa en la existencia de
diferentes partículas en suspensión que difieren su densidad que la del medio.
 La centrifuga son instrumentos que permite someter a las muestras a intensas
fuerzas.
 La homogenización es el procedimiento que se encarga que rompe los enlaces
celulares y libera el contenido celular sin dañar en medio que lo rodea.
Bibliografía:

 Los cultivos de células. Fraccionamiento celular, Javier García Calleja, 2010

 Darnel, J. Lodish, H  y Baltimore, D . 1993. Biología celular y molecular. Ediciones 
Omega, SA. pg 156 – 160
 Clarkson, A. Lefevre P, Tichener-Hooker N. 1993. A study of process interactions 
between cell disruption and debris clarification stages in the recovery of 
intracellular products.